Chủ đề: Kĩ thuật nhân giống vô tính invitro
Nhóm 9
1.Trần Tuấn Đạt 560787

5.Nguyễn Thị Quý 560856

2.Nguyễn Văn Hùng 560810

6.Nguyễn Thị Thảo 560864

3.Trương Đình Huynh 550463

7.Nguyễn T.Hồng Trang 575682

4.Đoàn Thị My 560830

8. Đỗ Thị Hải Yến 560897
1.Thế nào là nhân giống vô tính cây trồng bằng nuôi cấy mô?
Nhân giống vô tính là phương pháp nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới dựa theo sinh
sản vô tính, nghĩa là phương pháp tạo nhân lên hoặc tạo ra cơ thể mới từ tế bào,
mô, cơ quan của cơ thể bố hoặc mẹ.
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù chung cho tất cả các loại nguyên liệu nuôi
cấy thực vật hoàn toàn sạch vi sinh vật trên môi trường nhân tạo, trong điều kiện
vô trùng.
ð
Nhân giống vô tính cây trồng bằng nuôi cấy mô là quá trình sản xuất một
lượng lơn cây hoàn chỉnh từ các bộ phận cơ quan của cây trồng như: chồi,
mắt ngủ, vảy củ, thân lá… của cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy
in vitro.
2.Ưu nhược điểm của nhân giống invitro
2.1. Ưu điểm của vi nhân giống

3.ĐỐI TƯỢNG CỦA NHÂN GIỐNG VÔ TÍNH INVITRO
Page 3
Hiện nay kĩ thuật nhân giống vô tính invitro đã được áp dụng để nhân nhanh rất
nhiều loài thực vật phục vụ các mục đích khách nhau của con người và nhân giống
vô tính invitro đã mang lại hiệu quả kinh tế to lớn thực sự.
Trong sản xuất các loại cây có nhu cầu thương mại lớn, giá trị kinh tế cao đã được
ứng dụng kĩ thuật nhân giống vô tính invitro để nhân nhanh các giống tốt, sạch
bệnh đáp ứng nhu cầu về giống. Ví dụ: các cây lương thực,thực phẩm (khoai tây,
súp lơ, măng tây, cà chua, cà phê, mía) các cây ăn quả (chuối, dứa, cam, dâu tây),
các cây lâm nghiệp (bạch đàn, keo lai), các giống hoa (đồng tiền, cúc, cẩm chướng,
hoa ly….).

Nhân giống invitro trên cây chuối
Đặc biệt là các loại cây khó nhân giống nhanh bằng phương pháp thông thường
mà lại có giá trị kinh tế lớn như hoa lan thì kĩ thuật nhân giống vô tinh invitro là
lựa chọn tối ưu. Ở Việt Nam và trên thế giới một số loại lan quý như lan hồ điệp,
lan hài đỏ (hồng hài), hài hằng cũng đã được áp dụng thành công kĩ thuật này để
nhân giống một cách nhanh chóng. Phân viện sinh học tại Đà Lạt đã rất thành công
trong việc nhân giống và trồng lan hài đỏ bằng phương pháp gây vết thương trong
trong gieo hạt invitro nhằm kích thích sự hình thành chồi.
Page 4

Lan hài đỏ - loài lan quý hiếm ở Việt Nam
Các cây có kiểu gen quý hiếm, có ý nghĩa di truyền được nhân nhanh và duy trì
bằng nhân giống vô tính invitro để làm vật liệu cho công tác chọn tạo giống.
Các loài thực vật quý hiếm, có nguy cơ tuyệt chủng cao cũng là đối tượng cần áp
dụng phương pháp nhân giống vô tính invitro để cải thiện số lượng cá thể, tránh
nguy cơ bị biến mất hoàn toàn. Ví dụ như cây sưa đỏ, gỗ nghiến ở Việt Nam.

Cây sưa con

các bệnh dạ dày, tim mạch hay mỹ phẩm (mặt nạ, kem dưỡng da).

Page 8
Tổng hợp lượng lớn sinh khối tảo.
4.Các bước trong nhân giống in vitro
Bước 1: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ
Trược khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho
nguồn mẫu nuôi cấy). Các cây này cần sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai
đoạn sinh trưởng mạnh. Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích
hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả truớc khi lấy mẫu sẽ làm
giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh trưởng của mẫu cấy in vitro.
Bước 2: Tạo vật liệu khởi đầu
Là giai đoạn khử trùng mẫu vào nuôi cấy in vitro. Giai đoạn này cần đảm bảo các
yêu cầu: tỷ lệ nhiễm thấp, tỷ lệ sống cao, mô tồn tại và sinh trưởng tốt.
Kết quả giai đoạn này phụ thuộc vào rất nhiều vào cách lấy mẫu, tuỳ thuộc vào
mục đích khác nhau, loại cây khác nhau để nuôi cấy phù hợp. Khi lấy mẫu cần
chọn đúng mô, đúng giai đoạn phát triển của cây, quan trọng nhất là đỉnh chồi
ngọn, đỉnh chồi nách sau đó là đỉnh chồi hoa và cuối cùng là đoạn thân, mảnh lá.
Ví dụ: Vật liệu nuôi cấy thích hợp để nhân nhanh in vitro
Măng tây: chồi ngọn (Kohter, 1975)
Khoai tây: mầm (Morel, 1952)
Dứa: chồi nách, chồi đỉnh (Paunethier, 1976)
Bắp cải: mảnh lá (Bimomilo, 1975)
Súp lơ: hoa tự (Kholer, 1978)
Cần thiết phải khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy bằng hoá chất khử trùng
để loại bỏ các vi sinh vật bám trên bề mặt mẫu cấy. Chọn đúng phương pháp khử
trùng sẽ đưa lại tỷ lệ sống cao và chọn môi trường dinh dưỡng thích hợp sẽ đạt
được tốc độ sinh trưởng nhanh. Thường dùng các chất: HgCl 0.1% xử lý trong 5-
10 phút, NaOCl hoặc Ca(OCl)2 5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H2O2, dung
dịch Br

Để đưa cây từ ống nghiệm ra ngoài vườn ươm với tỷ lệ sống cao, cây sinh trưởng
tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:
- Cây trong ống nghiệm đã đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất định (số lá, số rễ,
chiều cao cây
- Có giá thể tiếp nhận cây in vitro thích hợp: giá thể sạch, tơi xốp, thoát nước.
- Cần có thời gian huấn luyện cây con (từ 1-2 tuần tuỳ từng loại cây) để thích nghi
với những thay đổi về nhiệt độ, độ ẩm, sâu bệnh bằng cách đặt bình cây ngoài điều
kiện tự nhiên, mở nắp bình nuôi
5. Phương thức trong nhân giống in vitro:
5.1. Hoạt hóa chồi nách:
Page 9
Hoạt hóa chồi nách bằng cách hủy đỉnh sinh trưởng. Bản chất của phương
pháp là á dụng kỹ thuật hủy đỉnh sinh trưởng cưỡng bức, gây ức chế nội tại, kích
thích các chồi ngủ tiềm ẩn ở nách lá, đầu rễ, phân hóa thành chồi mới.
hoạt hóa chồi nách bằng cách phá vỡ hiện tượng ưu thế ngọn khi nuôi cấy các đỉnh
chồi hoặc đoạn thân mang mắt ngủ. Theo phương pháp này thì sự hoạt hóa của
chồi nách diễn ra theo 2 cách:
Cách 1: Cây phát triển trực tiếp từ chồi đỉnh hay chồi nách: xảy ra khi nuôi cấy cây
hai lá mầm như thuốc lá, khoai tây, hoa cúc
Cách 2.Tạo cụm chồi từ chồi đỉnh hoặc chồi nách: xảy ra khi nuôi cấy cây một lá
mầm như mía, lúa,
5.2 Tạo chồi bất định:
Chồi bất định là chồi mọc ra rừ các cơ quan các bộ phận khác của cây không
phải là phôi. Ví dụ: chồi hình thành từ mô sẹo.
Tạo chồi bất định ta thường sử dụng các bộ phận của cây như: đoạn thân, mô lá,
giẻ hành…trong quá trình này cần thực hiện quá trình phản phân hóa và quá trình
phân hóa để tế bào hình thành trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua giai đoạn phát
triển mô sẹo
Tạo cụm chồi là để tái sinh một cách định hướng các tế bào mô nuôi cấy thành các
cụm chồi. Mẫu được khử trùng và tách bỏ chồi nách và đỉnh sinh trưởng sau đó

phân hóa để tách các tế bào soma hình thành phôi.
Bước 1: sự phân hóa các tế bào có khả năng hình thành phôi. Trong quá trình này
cần môi trường giàu auxin, vì auxin giúp cho việc cảm ứng để tạo các tế bào phôi,
Page
11
đồng thời nó còn kích thích quá trình phát triển số lượng tế bào thông qua việc liên
tiếp phân chia tế bào. Các tế bào có khả năng phát sinh là các tế bào nhỏ, nhân lớn,
nhiều hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đạm đặc, giàu protein và ARN
thông tin.
Bước 2: sự phát triển của phôi mới hình thành trong môi trường ngiên cứu của giai
đoạn này phải nghèo hoặc không có auxin, với nồng độ auxin cao kích thích sự
tạo phôi nhưng ức chế quá trình phân hóa và quá trình phát triển tiếp theo của phôi
này. Như vậy với nồng độ chất điều tiết sinh trưởng hợp lý là rất quan trọng để có
các phản hồi thích hợp. Nếu nồng độ thấp có thể gây sốc cho phản ứng, nếu nồng
độ cao sẽ gây ức chế hoặc gây độc.
Hình thức phát sinh trực tiếp: thể phôi phát triển từ mẫu nghiên cứu. Mẫu nghiên
cứu có thể là biểu bì, chu bì, tiền phôi hợp tử, tế bào nuôi cấy huyền phù và tế
bào… nói chung sự phát sinh trực tiếp phôi soma là do tế bào trong mẫu nghiên
cứu tồn tại tế bào tiền phôi trong nuôi cấy thì tế bào này trực tiếp bước vào giai
đoạn phát sinh phôi, hình thành thể soma
Hình thức phát sinh gián tiếp: thể phôi phát triển từ mô sẹo hoặc huyền phù tế bào
thông qua phản phân hóa đồng thời do cảm ứng định hướng phát triển tạo tế bào
quyết định cảm ứng phát sinh phôi và chúng phát triển thành phôi soma
Sự phát sinh hình thái của phôi vô tính
Tất cả các phôi vô tính đều có cấu trúc lưỡng cực, gồm có mô phân sinh của cả
chồi và rễ do đó có thể hình thành một cây hoàn chỉnh trong nuôi cấy in vitro. Sự
phát sinh hình thái ở phôi vô tính rất giống với phôi hữu tính, những phôi phát triển
bình thường sẽ trải qua những giai đoạn phát triển riêng biệt như: hình cầu, hình
tim, hình ngư lôi và hình lá mầm.
Page

phôi. Người ta đã thực hiện nhiều nghiên cứu trên nhiều loại thực vật ở các điều
kiện nuôi cấy khác nhau để qun sát khả năng tạo thành mô sẹo.
6.Các tồn tại của nhân giống cây trồng bằng nuôi cấy mô
+ Hạn chế của vi nhân giống.
+ Hạn chế về chủng loại sản phẩm : trong điều kiện hiện nay không phải tất
cả cây trồng thương phẩm đều được nhân giống bằng nuôi cấy mô.
+ nhiều cây trồng có giá trị kinh tế hoặc quý hiếm vẫn chưa thể nhân nhaanh
bằng phương pháp này để đáp ứng nhu cầu thương mại hay bảo quản nguồn gen
quý
+ Chi phí sản xuất cao: đòi hỏi lao động và có 1 trình độ nhất định sử dụng
thành thạo máy móc và thao tác kĩ thuật. đòi hỏi có trang thiết bị chuyên dụng.
+ giá thành sản phẩm còn cao so với phương pháp truyền thống như nhân
giống bằng hạt.
+ Hiện tượng biến dị soma làm mất hoặc thay đổi những đặc tính tốt của cây
mẹ và không được thể hiện ở đời con.
+ tỉ lệ biến di thấp ở giai đoạn đầu nhưng sau đó có dấu hiệu tăng do sử
dụng nhiều chất kích thích tăng trưởng làm cho cây không đồng nhất về mặt
nguồn gen.
+ xảy ra hiện tượng nhiễm mẫu do thao tác sai quy trình.
7.Nhân giống vô tính hoa đồng tiền
Đồng tiền là một trong những loài hoa có màu sắc đẹp, tươi sáng, đa dạng về
chủng loại với đầy đủ các loại màu từ đỏ, cam, vàng, trắng, phấn hồng, tím và có
giá trị kinh tế lớn. Trên bông hoa có thể có một màu đơn hoặc nhiều màu xen kẽ.
Page
14
Hoa lớn và đai nên thích hợp để tạo thành bó hoặc tạo thành hoa lẵng hoặc cắm
hoa nghệ thuật. Ngoài ra, hoa đồng tiền cũng thường được trồng trong chậu để
trong phòng làm việc hoặc phòng khách. Một trong những ưu điểm của hoa đồng
tiền là khá lâu tàn, nếu trồng trong chậu có thể nở trong thời gian 20 ngày – 30
ngày. Đồng tiền là một loại hoa có sản lượng và giá trị cao, ở điều kiện thích hợp

nước cất 3 lần, sau đó dùng Canxihypocholorid 15% để khử trùng sạch trong thời
gian15 phút, tiếp tục rửa sạch mẫu 5 lần bằng nước cất vô trùng. Cuối cùng chúng
ta được mẫu đỉnh sinh trưởng của hoa đồng tiền sạch.
3. Tái sinh cụm chồi
Mục đích của giai đoạn này là tái sinh một cách định hướng của các tế bào mô nuôi
cấy thành các cụm chồi. Mẫu đã được khử trùng sạch đưa vào đĩa petri có giấy
thấm vô trùng để thấm khô bề mặt các mẫu. Dùng dao để tách đỉnh sinh trưởng và
chồi nách có đường kính khoảng 5mm ra và sau đó cấy vào các bình tam giác có
môi trường dinh dưỡng phù hợp. Môi trường thường được sử dụng là môi trường
MS có bổ sung saccharose 3%, agar 9 g/lít, chất kích thích sinh trưởng BA 0,7 mg/
lít ở độ pH= 5,8. Sau 3 tháng thì các đỉnh sinh trưởng sẽ phát triển và tạo được
nhiều cụm chồi với các kích thước khác nhau.
4. Nhân nhanh cụm chồi
Sau khi đã phát triển thành nhiều cụm chồi thì các chồi này cần phải được tách ra
để nhân nhanh. Các cụm chồi nhỏ có kích thước 5-10mm được tách ra và cấy lên
môi trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar 9 g/lít, chất kích thích sinh trưởng
BA 0,5 mg/lít và GA3 0,1mg/lit ở độ pH= 5,8 được đặt trong các bình tam giác.
Cụm chồi phát triển tốt thì sau 2 tháng sẽ đạt được từ 4 - 5 chồi/cụm. Các chồi,
cụm chồi phát triển mạnh sẽ cho thấy các cây con có màu xanh non, lá thẳng dài,
kích thước cây từ 30-40mm.
5. Duy trì cây
Cây sau khi được cấy lên môi trường nhân giống và đạt kích thước 30-40mm thì
được cấy chuyền sang môi trường MS có bổ sung saccharose 3%, agar 9 g/lít, chất
kích thích sinh trưởng BA 0,1 mg/lít và GA3 0,3 mg/lit ở độ pH= 5,8 để duy trì
sự phát triển của cây. Sau 1 tháng cây con phát triển mạnh, lá có màu xanh non,
thẳng và có kích thước từ 40-60mm là đạt yêu cầu.
6. Tạo cây hoàn chỉnh
Cây đưa ra vườn ươm cần phải kích thước phù hợp, có đầy đủ rễ để có thể phát
triển bình thường. Do đó khi cây đạt kích thước từ 40-60mm sẽ được cấy chuyền
tiếp sang môi trường duy trì sự phát triển của cây và tạo rễ MS có bổ sung