ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN HỒ THỊ THU HƯƠNG
PHÂN LẬP ACID OLEANOLIC TỪ RỄ CÂY NGƯU TẤT
(Achyranthes Bidentata Blume) VÀ TINH CHẾ LÀM CHẤT CHUẨN
Chuyên ngành: Hóa Phân Tích
Mã số chuyên ngành: 604429
LUẬN VĂN THẠC SĨ: HÓA HỌC
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
MS: Mass Spectroscopy
IR: Infrared Spectroscopy
NMR: Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy
DEPT: Distortionless Enhancement By Polarization Transfer
HMBC: Heteronuclear Multiple – Bond Correlation Spectroscopy
HSQC: Heteronuclear Single – Quantum Correlation Spectroscopy
COSY: Correlation Spectroscopy
TLC: Thin Layer Chromatography
HPLC: High Performance of Liquid Chromatography
UFLC: Ultra Fast of Liquid Chromatography
DMSO: Dimethyl Sulfoxid
m: multies
s: single
d: douplet
dd: douplet-douplet
HCl: acid hydrochloric
H
2
SO
4
: acid sulfuric
C: chuẩn đối chiếu
NL: chuẩn nguyên liệu thu được
T: mẫu thử
DĐVN: dược điển Việt Nam.
phương trình hồi quy của chất đối chiếu.
Bảng 12. Kết quả xác định hàm lượng acid oleanolic trong thuốc thử dựa trên
phương trình hồi quy của chất chuẩn nguyên liệu.
MỤC LỤC
Trang
Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Mở đầu 1
Chƣơng 1- TỔNG QUAN
1.1 Mô tả thực vật về cây ngƣu tất 3
1.1.1 Phân loại và mô tả hình thái 3
1.1.2 Nơi sống và thu hái 4
1.1.3 Bộ phận dùng 4
1.1.4 Thành phần hóa học 5
1.1.5 Công dụng và tính vị 6
1.2 Sơ lƣợc về saponin 9
1.3 Phản ứng thủy phân saponin 11
1.4 Acid oleanolic 12
1.5 Tình hình nghiên cứu 13
Chƣơng 2-NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 17
2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị 19
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
Hình 1. Cây và bộ phận rễ của ngưu tất
Hình 2. Hình vi phẫu rễ cây ngưu tất
Hình 3. Sơ đồ chung về quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất
Hình 4. Kết quả khảo sát dung môi chiết
Hình 5. Kết quả khảo sát acid sử dụng thủy phân saponin toàn phần
Hình 6. Kết quả khảo sát nồng độ acid
Hình 7. Kết quả khảo sát nhiệt độ thủy phân
Hình 8: Kết quả khảo sát thời gian thủy phân
Hình 9. Kết quả kiểm tra các phân đoạn thu được
Hình 10. Quy trình chiết acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất
phong phú.
Khoa học hiện đại không chỉ quan tâm các tính năng dược lí, mà còn
nghiên cứu chuyên sâu các thành phần hợp chất có trong từng bộ phận của cây,
phân lập các hợp chất, mang lại nhiều giá trị to lớn.
Nói đến ngưu tất, ít người biết cây dược liệu này có tác dụng hạ
cholesterol máu và hạ huyết áp, một trong những căn bệnh phổ biến, xuất hiện
ở nhiều lứa tuổi, và là căn bệnh khó chữa hiện nay. Loài cây này được du nhập
từ Trung Quốc, và hiện nay đã trồng thành công ở nước ta.
[1,3]
Acid oleanolic là sản phẩm thủy phân từ saponin có trong phần lớn thực
vật như cây cỏ xước, hạt gấc, hoa tỳ bà,… và trong cây ngưu tất, đặc biệt có
nhiều trong phần rễ của cây ngưu tất. Nó có tác dụng bảo vệ tế bào gan, chống
oxi hóa, chống tác nhân gây khối u.
[4,5]
Trên thị trường đã đưa ra nhiều chế phẩm mà thành phần có saponin của
rễ cây ngưu tất, trong đó có chế phẩm dùng để làm thuốc hạ cholesterol máu
cao.
Điều đó thật đáng mừng, tuy nhiên, thuốc chữa bệnh phải ở hàm lượng
cho phép, nếu hàm lượng quá cao sẽ ảnh hưởng không tốt đến sức khỏe của
người sử dụng.
2
Do đó, để kiểm tra cũng như giám sát chất lượng của các thành phẩm
này, chúng tôi đã nghiên cứu chiết xuất acid oleanolic trong rễ cây ngưu tất
dùng làm chất chuẩn phục vụ cho công tác kiểm nghiệm.
Vì vậy, cần tìm ra phương pháp chiết đơn giản để có thể phân lập được
acid oleanolic từ rễ cây ngưu tất, và sử dụng như chất chuẩn để đánh giá những
sản phẩm bán thành phẩm. Nên tên đề tài của chúng tôi là “Phân lập acid
oleanolic từ rễ cây ngưu tất (Achyranthes Bidentata Blume) và tinh chế làm
chất chuẩn”.
Với hai mục tiêu chính:
chim. Bầu hình trứng. Quả hình bầu dục, có một hạt. Cây cho hoa vào khoảng
từ tháng 5-9 và cho quả tháng 10-11.
Hình 1. Cây và bộ phận rễ của ngưu tất.
1.1.2 Nơi sống và thu hái
Cây ngưu tất hiện nay được trồng thành công ở nước ta, dược liệu
đủ dùng trong cả nước và xuất khẩu.
4
Ngưu tất là một vị thuốc được dùng khá phổ biến trong Y học cổ
truyền với nhu cầu ngày càng tăng, được nhập trồng vào nước ta từ những
năm 1960. Hiện nay đã thích hợp với điều kiện nước ta và phát triển tốt,
được trồng ở nhiều nơi nhất là đồng bằng Bắc bộ như: xã Tân Quang,
huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên; thôn Thiết Trụ, huyện Khoái Châu, tỉnh
Hưng Yên; xã Ninh Hiệp, huyện Gia Lâm; Trung tâm nghiên cứu cây trồng
và chế biến thuốc Hà Nội và một số nơi khác.
Cây trồng được cả ở trên núi cao lẫn đồng bằng. Thu hái vào mùa
đông xuân, phơi tái rồi ủ đến khi nhăn da (6-7 ngày), xông diêm sinh, sấy
khô. Dùng sống hoặc sao tẩm rượu.
Trong các bộ phận của cây ngưu tất, thì rễ ngưu tất có tác dụng y
học lớn, và ngày nay, các sản phẩm bắt nguồn từ rễ ngưu tất khá nhiều. Do
đó, những nghiên cứu về rễ ngưu tất rất cần thiết. Ngoài ra, trong rễ ngưu
tất có các hoạt chất có chức năng trị bệnh.
1.1.3 Bộ phận dùng
Bộ phận dùng: Rễ - Radix Achyranthis Bidentatae.
Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1 cm. Ðầu
trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuôn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng đất
hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con.
Vi học
Ðặc điểm vi phẫu
Mặt cắt rễ gần tròn. Từ ngoài vào trong có: Lớp bần gồm các tế bào
6
Bảng 1. Hàm lượng Oleanolic acid (OA) trong từng bộ phận khác nhau của
cây ngưu tất thay đổi theo thời gian [8]
Thời gian thu hoạch mẫu Hàm lượng của OA (%)
Rễ Thân Lá
Tháng tám 7.76 4.09 4.13
Tháng chín 1.03 2.76 3.37
Tháng mười 2.95 1.17 0.25
Tháng mười một 2.90 1.09 0.06
Tháng mười hai 2.59 1.47
1.1.5 Công dụng và tính vị
Tác dụng dƣợc lý:
- Kháng viêm rõ rệt đối với giai đoạn cấp tính và mạn tính của phản ứng
viêm thực nghiệm. Rễ ngưu tất có tác dụng mạnh hơn khoảng 4 lần so với rễ
cỏ xước.
- Gây thu teo tuyến ức chuột cống đực non. Tác dụng gây thu teo tuyến ức
là một trong những đặc tính của thuốc ức chế miễn dịch. Rễ ngưu tất có tác
dụng mạnh hơn khoảng 8 lần so với rễ cỏ xước. Có mối tương quan song song
giữa tác dụng kháng viêm và tác dụng gây thu teo tuyến ức của rễ Ngưu tất.
- Rễ Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu ở thỏ đã gây tăng
cholesterol từ ngoài vào và gây ức chế sự tổng hợp cholesterol trong cơ thể
thỏ; gây hạ huyết áp rõ rệt trên mèo, mức độ hạ áp từ từ, thời gian tác dụng
kéo dài. Có độc tính thấp.
- Chế phẩm Solamin trong thành phần có ngưu tất và một số dược liệu khác
đã được áp dụng để điều trị thấp khớp với kết quả là có tác dụng chống viêm
và giảm đau rõ rệt trên lâm sàng. Kết quả tốt nhất và tương đối nhanh đối với
đau lưng cấp do lạnh và sang chấn. Ðối với viêm đa khớp dạng thấp, chưa có
biến dạng về khớp và đối với chứng đau nhức đơn thuần, tác dụng điều trị
tương đối tốt. Khi đã có biến dạng về xương, cơ, khớp, kết quả kém. Thuốc
không gây tác dụng phụ đáng kể.
1 thang, chữa các chứng bốc nóng, nhức đầu, chóng mặt, đau mắt, ù
tai, tăng huyết áp cao, rối loạn tiền đình, khó ngủ, đau nhức dây thần
kinh, rút gân, co giật, táo bón.
8
4. Thang tiết niệu: Ngưu tất 30g, rễ cỏ tranh, mã đề, mộc thông, huyết
dụ, lá móng tay, huyết sâm đều 15g sắc uống.
Chữa các chứng viêm cầu thận cấp, phù thũng, đái đỏ, đái són, viêm gan
vi rút, đái vàng thẫm, da vàng, viêm bàng quang, đái ra máu.
Rễ ngưu tất đã được GS Đoàn Thị Nhu và cộng sự chứng minh có tác
dụng hạ cholesterol máu và có tác dụng hạ huyết áp. Viện Dược liệu (Bộ Y
tế Việt Nam) đã sản xuất cao toàn phần bào chế dưới dạng viên được đem
thử tại Viện Bảo vệ sức khỏe người cao tuổi do GS Phạm Khuê và các
cộng sự thực hiện và đã đi đến kết luận sau:
- Ngưu tất có tác dụng làm giảm cholesterol máu trên 65% số bệnh
nhân có cholesterol máu cao được điều trị.
- Ngưu tất có tác dụng làm giảm tỉ lệ β/α lipoprotein máu ở 82% số
bệnh nhân có tỉ lệ β/α lipoprotein máu cao điều trị.
- So sánh với Clofibrat (một loại thuốc hóa học được dùng phổ biến
điều trị các bệnh nhân trên) thì tác dụng hạ cholesterol máu cao hơi
yếu hơn, còn tác dụng hạ tỉ lệ β/α lipoprotein thì gần tương đương.
Phạm Kim Mãn (luận án phó tiến sĩ 1992) đã nghiên cứu đưa ra chế
phẩm “Bidentin” mà thành phần có saponin của rễ ngưu tất cộng với chất phụ
gia để làm thuốc hạ cholesterol. Thuốc đã được thử lâm sàng có kết quả tốt,
thuốc ổn định và không gây tác dụng phụ.
Gần đây, một nam dược mới được nghiên cứu là có tác dụng điều hòa
huyết áp, với ba dược liệu gồm ngưu tất, sơn tra, nhân trần, với tên gọi an
mạch ích nhân, đang được bán rộng rãi trong khắp cả nước.
Tính vị: Ngưu tất có vị đắng, chua mặn, tính bình; có tác dụng bổ can thận,
mạnh gân cốt, phá ứ huyết, tiêu ung độc.
Ngưu tất đã được chính thức đưa vào Dược điển II Việt Nam tập 3
triterpenoid và saponin steroid. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và
loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm.
Saponin triterpenoid:
Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen.
Người ta chia làm 2 loại:
Saponin triterpenoid pentacyclic: loại này chia ra các
nhóm: olean, ursan, lupan, hopan.
a - Nhóm olean (I) : Phần lớn các saponin triterpenoid trong tự nhiên
đều thuộc nhóm này. Phần aglycon thường có 5 vòng và thường là dẫn
10
chất của 3-b-hydroxy olean 12- ene, tức là b-amyrin. Một vài aglycon
làm ví dụ (công thức A):
o Acid oleanolic: R1 = R2 = R4 = R5 = -CH
3
, R3 = -COOH.
o Hederagenin: R2 = R4 = R5 = -CH
3
, R1 = -CH
2
OH , R3 = -
COOH
o Gypsogenin: R2 = R4 = R5 = -CH
3
, R1 = -CHO , R3 = -
COOH.
Mạch đường có thể nối vào C-3 theo dây nối acetal, có khi mạch
đường nối vào C-28 theo dây nối ester. Gần đây người ta phân lập
được các saponin có đến 10-11 đơn vị đường nếu kể cả 2 mạch, riêng
một mạch có thể đến 6 đơn vị đường.
b - Nhóm ursan (II): Cấu trúc của nhóm ursan cũng tương tự như nhóm
quan trọng để bán tổng hợp các thuốc steroid. Hai sapogenin quan trọng nhất
là diosgenin (có chủ yếu trong các loài Dioscorea) và hecogenin (có chủ yếu
trong các loài Agave).
Nhóm furostan: Nhóm này có cấu trúc tương tự như nhóm spirostan
chỉ khác là vòng F bị biến đổi.
Nhóm aminofurostan: Ở đây vòng F mở như trường hợp
sarsaparillosid nói ở trên nhưng ở vị trí C-3 đính nhóm NH
2
.
Nhóm spirosolan: Nhóm này chỉ khác nhóm spirostan ở nguyên tử oxy
của vòng F được thay bằng NH.
Nhóm solanidan: Solanin có trong mầm khoai tây thuộc nhóm này.
Những chất thuộc 3 nhóm aminofurostan, spirosolan và solanidan đều có
chứa N vừa mang tính alcaloid vừa mang tính glycosid nên được gọi là những
chất glycoalcaloid.
Ngoài những nhóm saponin steroid kể trên người ta còn gặp một số saponin
steroid có cấu trúc mạch nhánh khác
1.3 Phản ứng thủy phân saponin
Saponin là một glycosid. Sự thủy phân các glycosid để cho ra phần
đường và phần aglycon dễ hay khó tùy thuộc vào nối glycosid (C-glycosid
hay O-glycosid), loại đường (-uronic hay ose), kiểu mạch đường (biose nối
1-2 hay biose nối 1-6) hay vị trí gắn đường với khung.
Các tác nhân thủy phân thường là kiềm, acid hoặc enzym
Trong việc nghiên cứu saponin, nhất là đối với những hợp chất mới,
người ta hay chiết xuất sapogenin. Vì saponin thường khó phân lập, khó
kết tinh, và việc phân tích cấu trúc phần đường cũng khó. Hơn nữa, quá
trình phân tích cấu trúc saponin cũng cần phải tách sapogenin để xác định.
Vậy, muốn có sapogenin toàn phần, người ta phải thủy phân saponin toàn
12
phần, loại bỏ phần ose bằng phương pháp thích hợp sau đó phân lập các
Acid oleanolic là một aglycon phổ biến trong các loại thực vật, thuộc phân
nhóm olean triterpen
Tác dụng dược lý:
+ Bảo vệ tế bào gan do ức chế emzym gan Cyp P450 [9]
+ Tác dụng chống tác nhân gây khối u: acid ursolic và acid oleanolic
ức chế TPA một chất hoạt hóa thể EBV tại tế bào Raij [15]
+ Tác dụng chống một số tác nhân gây độc cho gan và được dùng
trong điều trị viêm gan ở Trung Quốc: thử nghiệm trên chuột nhắt với acid
oleanolic chống lại tác nhân gây độc là Cadmium bằng cách kích thích sản
xuất metallothionein [11], và giảm tác dụng độc của acetaminophen bằng
cách tăng hoạt tính alanin aminotrsferase và sorbitol dehyrogenase [10]
13
+ Tác dụng chống HIV invitro trên tế bào đơn nhân ở người đã được
gây nhiễm [13]
+ Tác dụng ức chế α- glucosidase của acid oleanolic và dẫn chất tổng
hợp của acid oleanolic[16]
Một số dược liệu có thành phần là acid oleanolic: trái bồ kết, cây ngưu
tất, cây ngưu tất nam ( cỏ xước), hạt gấc,
1.5 Tình hình nghiên cứu về acid oleanolic
- Qui trình chiết xuất
Trong Dược điển Việt Nam IV, chuyên luận Dược liệu, trang 847 giới
thiệu sơ lược về cây ngưu tất, chiết xuất acid oleanolic và định tính bằng
sắc ký lớp mỏng trong dược liệu. Quy trình chiết xuất oleanolic như sau:
2g ngưu tất chiết với ethanol 96 %, lấy dịch lọc đem thủy phân
bằng acid HCl 10 %, cách thủy 80
o
C, thêm một ít nước pha loãng dịch
chiết rồi chiết với chloroform, thu gom phần dịch chiết cloroform cho
bay hơi tới cắn. Hòa tan cắn trong ethanol 96
o
- Định tính bằng sắc ký bản mỏng [2]
- Dung môi chạy sắc ký: (chloroform: Methanol) (40:1)
- Bản mỏng silicagel 60 GF 254.
- Thuốc thử phun màu: dung dịch acid phosphomolybdic 5% trong
ethanol
- Nhiệt độ lên màu: 120
o
C
- Dung dịch chuẩn: 1mg/ 5ml.
o Qui trình định lƣợng
Định lượng acid oleanolic trong đối tượng thực vật thường được thực
hiện bằng phương pháp HPLC
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic trong cao ngưu tất
- Cột: prontosil LC8 ( 150 x 4,6 mm; 3 µm)
- Pha động: (acetonitril: nước) ( 72 : 28)
- Đầu dò : PDA 203 nm
- Tốc độ dòng : 0,785 ml/ phút
15
- Thể tích tiêm : 20 µl
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic trong đối tượng cao gấc
[5]:
- Cột: Lichrosorb RP8 ( 150 x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động : [acetonitril : nước (pH 3_ chỉnh bằng H
3
PO
4
1%)] ( 60: 40)
- Đầu dò : DAD 206 nm
- Tốc độ dòng : 1,2 ml/ phút
Định tính bằng phương pháp sắc ký bản mỏng với các điều kiện theo
chuyên luận DĐVN IV [2]
- Dung môi chạy sắc ký: (chloroform: Methanol) (40:1)
- Bản mỏng silicagel 60 GF 254.
- Thuốc thử phun màu: dung dịch acid phosphomolybdic 5% trong
ethanol
- Nhiệt độ lên màu: 120
o
C
- Dung dịch chuẩn: 1mg/ 5ml.
Qui trình định lượng bằng phương pháp đo quang UV-VIS:
Định lượng acid oleanolic bằng phương pháp đo quang ở vùng 230
nm đến 350 nm cho cả hai dung môi là acid oleanolic trong acetic băng ( λ
max = 256 nm) và trong ethanol (λ max = 277 nm) [18].
Tuy nhiên, trong trường hợp này, chúng tôi sử dụng dung môi là
methanol, áp dụng phương pháp đo quang ở vùng 190 nm đến 350 nm,
và định lượng ở bước sóng 215 nm.
Điều kiện HPLC định lượng acid oleanolic dựa theo tài liệu [21] và có
điều chỉnh cho phù hợp:
- Cột: RP C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm)
- Pha động: [methanol : đệm phosphat 0,03 mol/l (pH 2,8_ chỉnh bằng
H
3
PO
4
1%)] ( 86: 14)
- Đầu dò : UV 215 nm
- Tốc độ dòng : 1,0 ml/ phút
- Thể tích tiêm : 10 µl
17
2.2 Hóa chất, nguyên liệu và thiết bị
Hóa chất 18
ST
T
Hóa chất
Xuất xứ
Độ tinh
khiết
Ghi chú
1
Ethanol (PA)
Malaysia
99.9 %
2
N-hexane
USA
95 %
3
Methylen cloric
(PA)
USA
99.9 %
4
Cloroform (PA)
20x20 cm
10
Bột silicagel 60 F
254
Merck
0.063-0.2
mm
11
Potassium
dihydrophosphat
Merck
99.5 %
12
Acid phosphor
molybdic
Nguyên liệu
Rễ cây ngưu tất khô được mua ở Dược liệu trung ương III, quận
nhất, thành phố Hồ Chí Minh.
Copyright: Tài liệu đại học ©