Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM PHÓ THỊ THUÝ HẰNG NGHIÊN CỨU BẢO TỒN VỐN GEN CÂY NGƯU TẤT
(ACHYRANTHES BIDENTATA BLUME) BẰNG KĨ THUẬT NUÔI
CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Mã số: 60.42.70
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ TÂM Thái Nguyên, 2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Nguyễn Thị Tâm đã tận tình hƣớng dẫn,
chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này.
Tôi xin trân thành cảm ơn Th.S. Vũ Anh Tuấn, KTV Lƣơng Thị Hồng Vân
- bộ môn Hoá hữu cơ - Khoa Hoá học trƣờng Đại học Sƣ phạm đã tận tình
hƣớng dẫn tôi thực hiện một số thí nghiệm trong luận văn. Tôi xin cảm ơn KTV
Đào Thu Thuỷ (PTN Công nghệ Tế bào thực vật), KTV Trần Thị Hồng (PTN Di
truyền học), đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi tiến hành các thí nghiệm.
Tôi xin cảm ơn Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô giáo, cán bộ Khoa Sinh -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Mục lục
Những chữ viết tắt
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
1.4.1. Ƣu thế của nhân giống in vitro
12
1.4.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
1.4.3. Một số thành tựu trong nhân giống cây trồng bằng kĩ thuật
nuôi cấy in vitro
15
1.5. Ứng dụng kĩ thuật PCR - RAPD trong phân tích sự đa dạng
di truyền
19
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
23
2.1. Vật liệu………………………………
23
2.1.1. Vật liệu thực vật
23
2.1.2. `Hoá chất, thiết bị và địa điểm nghiên cứu
23
2.2. Phương pháp nghiên cứu
24
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro
24
2.2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu hợp chất saponin trong rễ cây Ngƣu
tất
28
ngoài đồng ruộng và cây trồng bằng hạt
51
3.3. Sử dụng kĩ thuật RAPD đánh giá hệ gen cây Ngƣu tất in vitro và
cây trồng bằng hạt
53
3.3.1.Kết quả tách chiết ADN tổng số
53
3.3.2. Kết quả phản ứng RAPD
54
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
60
PHỤ LỤC
64
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
DANH MỤC CÁC BẢNG trang
Bảng 2.1. Thành phần cơ bản của môi trƣờng MS
23
Bảng 2.2. Trình tự nucleotit của 5 đoạn mồi ngẫu nhiên…………
32
Bảng 3.1. Kết quả khử trùng hạt Ngƣu tất
34
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng
nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm ……………………
38
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến tốc độ sinh
trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm ………………………
40
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến hình thành rễ của cây Ngƣu
tất trong ống nghiệm (sau 30 ngày)
42
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả năng nhân
chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm
44
Bảng 3.6. Ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ sinh trƣởng
Trang
Hình 3.1. Biểu đồ so sánh ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến
tỷ lệ bình không nhiễm và tỷ lệ hạt nảy mầm của hạt Ngƣu tất
35
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ nảy mầm
và sự phát triển của chồi mầm Ngƣu tất
36
Hình 3.3.
Biểu đồ so sánh khả năng nhân chồi giữa BAP và kinetin
39
Hình 3.4.
Biểu đồ so sánh tốc độ sinh trƣởng giữa BAP và kinetin…
41
Hình 3.5.
Ảnh hƣởng riêng rẽ của BAP và kinetin đến khả năng
nhân chồi và tốc độ sinh trƣởng của chồi Ngƣu tất trong ống nghiệm
41
Hình 3.6. Hình ảnh rễ Ngƣu tất trong môi trƣờng có α-NAA
43
Hình 3.7. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến khả
năng nhân chồi của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm………
45
Hình 3.8. Biểu đồ ảnh hƣởng của tổ hợp chất KTST đến tốc độ
sinh trƣởng của cây Ngƣu tất trong ống nghiệm…………
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Theo báo cáo của Tổng Công ty Dược Việt Nam (năm 2000) cho thấy,
Tổng công ty đã nhập khẩu 182 loại dược liệu với tổng khối lượng 18.300
tấn, trong đó có 81 loại nhập với khối lượng trên 100 tấn/loại. Trong đó, có 13
loại thuốc đi từ động vật và khoáng vật; 169 loại từ cây thuốc, nhiều loại là
thuốc bắc đầu vị, một số không có ở Việt Nam [33].
Hiện nay, dược liệu tự sản xuất trong nước (bao gồm thu hái trong tự
nhiên và trồng trọt) không đáp ứng đủ nhu cầu, 60% phải nhập khẩu, có hơn
20 loài cây thuốc đã nhập nội thành công ở nước ta, đã từng sản xuất đạt sản
lượng lớn, nay cũng phải nhập khẩu trở lại trong đó có cây Ngưu tất. Có
nhiều loài vốn là những cây trồng thế mạnh của Việt Nam cũng phải nhập từ
nước khác như: Bạch biển đậu, Binh lang (hạt cau), Hoắc hương, Xạ can, Địa
liền, Hồng hoa, Xuyên tâm liên, Ý dĩ [32].
Như vậy, trong khi thường xuyên xuất khẩu gần 100 loại dược liệu, bán
thành phẩm và thành phẩm, doanh thu khoảng 30-50 triệu USD/năm, thì Việt
Nam vẫn phải nhập khẩu dược liệu, chủ yếu từ Trung Quốc. Không những
thế, còn xuất hiện tình trạng xuất khẩu tiểu ngạch dược liệu qua các cửa khẩu
vùng biên dẫn đến nguy cơ tuyệt mẫu nhiều loài cây thuốc quý hiếm [33].
Trước thực trạng trên, để thực hiện được phương châm lấy dược liệu làm
nền tảng trong chiến lược phát triển của ngành Y tế, cần phải có những chính
sách mạnh mẽ, thích hợp, đồng bộ và khoa học dựa trên những điểm chính
sau: song song với việc quy hoạch vùng dược liệu, bảo vệ nguồn tài nguyên
dược liệu, đẩy mạnh công tác thông tin và nghiên cứu dược liệu. Một trong
những trọng điểm của định hướng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây thuốc
trên quy mô lớn, phát triển nguồn dược liệu hàng hoá phục vụ cho việc điều
trị trong nước và xuất khẩu. Tuy nhiên, để thực hiện tốt điều đó, bên cạnh
việc đẩy mạnh các nghiên cứu cơ bản như thành phần hoá học, tác dụng dược
lí của cây thuốc, các nghiên cứu ứng dụng cũng cần được xem trọng [30].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
3
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm nhằm
bảo tồn nguồn gen và tạo ra số lượng nhất định cây con đồng đều cung cấp
cho sản xuất và trồng thử ngoài đồng ruộng.
- Khẳng định tính ổn định của cây nuôi cấy in vitro thông qua đánh giá
sự ổn định về hàm lượng hợp chất saponin và genome cây Ngưu tất trồng tự
nhiên và cây nuôi cấy trong ống nghiệm.
3. Nội dung nghiên cứu
1. Nghiên cứu quy trình nhân giống cây Ngưu tất trong ống nghiệm
- Nghiên cứu khử trùng hạt để có mẫu sạch ban đầu trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng lên sự phát
sinh hình thái cây Ngưu tất trong ống nghiệm.
- Nghiên cứu tạo cây hoàn chỉnh thông qua thăm dò ảnh hưởng của nồng
độ NAA hoặc IBA.
- Nghiên cứu đưa cây ra môi trường tự nhiên
2. Định lượng hợp chất saponin trong rễ cây Ngưu tất trồng tự nhiên và cây
nuôi cấy in vitro
3. Sử dụng kĩ thuật RAPD để đánh giá sự ổn định di truyền giữa cây Ngưu tất
trồng tự nhiên và cây Ngưu tất nuôi cấy in vitro.
chim. Bầu nhụy hình trứng. Quả hình bầu dục, có một hạt [38].
Rễ hình trụ tương đối thẳng, dài 20-30 cm, đường kính 0,5-1cm. Ðầu
trên mang vết tích của cổ rễ, đầu dưới hơi thuộn nhỏ. Mặt ngoài màu vàng đất
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
5
hay nâu nhạt, có nhiều nếp nhăn dọc nhỏ và vết tích của rễ con. Rễ gồm 1
hoặc 2 hoặc 3 rễ cái, chung quanh có các rễ con. Rễ cái nạc, lúc đầu hơi giòn,
màu trắng ngà, sau khi chế biến có màu hồng, trong và mềm dẻo.
Ở nước ta có cây cỏ xước mọc hoang dại, trông rất giống cây Ngưu tất,
được các vị lương y dùng thay cho Ngưu tất với tên thông dụng nam Ngưu
tất, tên khoa học Achyranthes Aspera L. cùng họ Dền. Nhìn bề ngoài, cỏ xước
trông rất giống Ngưu tất tuy nhiên phiến lá Ngưu tất to và tù hơn, còn lá cỏ
xước gầy và nhọn hơn. Rễ cỏ xước có nhiều rễ con hơn, rễ cái bị hoá gỗ. Còn
rễ Ngưu tất ít rễ con hơn, rễ cái nạc và dài như chiếc đũa [12].
1.1.3. Kĩ thuật trồng, chăm sóc, thu hái và bảo quản sau thu hoạch
Kỹ thuật trồng cây Ngưu tất
Chọn đất và làm đất: Ngưu tất ưa đất thịt pha cát, tơi xốp, nhiều mùn.
Đất phù sa, cao ráo, thoát nước rất hợp với Ngưu tất. Đất nhiều cát sỏi, bạc
màu, đất chua mặn không trồng được Ngưu tất.
Ruộng trồng Ngưu tất phải được cày bừa, đập đất kỹ. Cày hoặc cuốc sâu
có tác dụng làm cho rễ Ngưu tất dài, ăn sâu, cho năng suất cao. Khi lên luống
thường bón lót phân chuồng vào lưng chừng luống. Lượng phân chuồng, theo
tài liệu Trung Quốc phải bón tới 50 hoặc 60 tấn/ha, nghĩa là 2 - 3 tạ một sào
Bắc bộ. Nhưng ở nước ta ít khi dùng lượng phân nhiều như thế. Tuy nhiên
không nên trồng chay, năng suất sẽ thấp. Luống làm rộng 70 - 80cm cao 30 -
40cm. ở Trung Quốc người ta còn cày sâu, đập đất nhỏ và lên luống cao tới
70cm. Theo chuyên gia Trung Quốc, làm như vậy sẽ cho củ Ngưu tất dài 70 -
80cm [9].
Khi lên luống đã hoàn chỉnh, rạch 2 hàng dọc trên mặt luống cách nhau
Từ thời nguyên thuỷ, con người trong lúc tìm kiếm thức ăn, có khi ăn
phải chất độc phát sinh nôn mửa hoặc đi ỉa lỏng, hoặc hôn mê có khi chết
người, do đó dần dần có nhận thức phân biệt được vị nào ăn được, vị nào có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
7
độc. Kinh nghiệm dần được tích luỹ không những giúp cho loài người biết lợi
dụng tính chất của cỏ cây làm thức ăn mà còn biết dùng làm thuốc chữa bệnh,
hay dùng các vị có chất độc làm tên thuốc độc dùng trong săn bắn và chống
ngoại sâm. Cây thuốc Ngưu tất cũng được tìm ra bằng con đường đó [12].
Ngưu tất là một loại cây dược liệu thu hoạch củ được trồng rộng rãi ở
một số nước trên thế giới như Trung Quốc, Ấn Độ, Campuchia, Lào Trong
đó Trung Quốc là nước có diện tích cũng như sản lượng Ngưu tất nhiều nhất
thế giới.
Năm 1960, cây Ngưu tất bắt đầu được trồng ở nước ta, trong những năm
của thập kỉ 70 được phát triển đại trà, đáp ứng nhu cầu trong nước và một
phần xuất khẩu. Thời gian sau đó, diện tích cây Ngưu tất giảm trầm trọng, chỉ
còn trồng rải rác ở một số tỉnh chuyên canh về dược liệu như Lào Cai, Lai
Châu, Hưng Yên, Thanh Hoá và một số vườn dược liệu của các bệnh viện,
Viện Nghiên cứu hoặc còn mọc hoang ở thung lũng các tỉnh miền núi phía
Bắc như Lạng Sơn, Cao Bằng, Hà Giang Hiện nay, sản lượng Ngưu tất
trong nước rất ít, chỉ đáp ứng được 60% nhu cầu, số còn lại phải nhập khẩu
chủ yếu từ Trung Quốc [31].
Theo tinh thần “Định hướng chiến lược ngành y tế” và “Chính sách quốc
gia về thuốc của Việt Nam” Chính phủ đã có những chính sách cũng như
những quy định pháp luật cụ thể cho việc phát triển dược liệu. Hiện nay, các
vùng dược liệu mới đang được quy hoạch ở các tỉnh như: Lào Cai, Mèo Vạc-
Hà Giang, Chí Linh-Hải Dương, Hương Sơn – Hà Tĩnh. Viện Dược Liệu
được chọn làm cơ quan tham gia chương trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng
miền núi, chương trình trồng rừng phủ xanh đất trống, đồi núi trọc, góp phần
định trong quá trình chế biến. Rễ khô còn có emodin và physcion [38].
Saponin là một glicozit tự nhiên thường gặp trong nhiều loài thực vật.
Tiền tố sapo có nghĩa là xà phòng; và thực tế thường gặp từ "saponification"
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
9
có nghĩa là sự xà phòng hóa trong cả tiếng Anh và tiếng Pháp. Chất saponin
của Ngưu tất có tác dụng phá huyết và làm vón albumin. Ecdysteron và
inokostenon có tác dụng kìm hãm sự phát triển của một số sâu bọ [34].
Saponin có tính chất chung là khi hoà tan vào nước có tác dụng làm giảm
sức căng bề mặt của dung dịch tạo nhiều bọt, có tính chất phá huyết, độc đối
với động vật máu lạnh nhất là đối với cá, tạo thành phức với cholesterol, có vị
hắc và làm hắt hơi mạnh. Một vài động vật cũng có saponin như các loài hải
sâm, cá sao. Các saponin đều là các chất hoạt quang. Thường các steroit
saponin thì tả truyền, còn triterpenoit saponin thì hữu truyền. Điểm nóng chảy
của các sapogenin thường rất cao. Dưới tác dụng của enzym có trong thực vật
hay vi khuẩn hoặc do axit loãng, saponin bị thuỷ phân thành các phần gồm
genin gọi là sapogenin và phần đường gồm một hoặc nhiều phân tử đường.
Các đường phổ biến là D-glucoza, D-galactoza, L-arabinoza, axit galactunoic,
axit D-glucuronic Phần genin có thể có cấu trúc cholan như sapogeninsteroi
hoặc sapogenintritecpen dạng β-amirin (axit olenoic), dạng α-amirin (axit
asiatic), dạng lupol (axit buletinic) hoặc tritecpen bốn vòng [35].
Dựa vào cấu trúc của phần sapogenin, người ta chia saponin ra làm 3
nhóm lớn là triterpenoit saponin, steroit saponin và glicoancaloit dạng steroit.
Saponin có loại axit, trung tính hoặc kiềm. Trong đó, triterpenoit saponin
thường là trung tính hoặc axit (phân tử có nhóm –COOH). Steroit saponin
nhóm spirostan và furostan thuộc loại trung tính còn nhóm glicoancaloit thuộc
loại kiềm [35].
Theo Đông y, Ngưu tất có vị chua, hơi đắng, tính bình không độc, vào 2
kinh can và thận, có tác dụng làm tan máu ứ đọng, bớt sưng tấy, đau nhức,
Hoa tạp chí) đã dùng cao lỏng Ngưu tất tiến hành 90 thí nghiệm trên tử cung
cô lập của thỏ, chuột bạch, mèo và chó đã đi tới một số kết luận sau: cao lỏng
Ngưu tất có tác dụng làm dịu sức căng của tử cung chuột bạch, làm phát sinh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
11
tác dụng co bóp ở tử cung của thỏ, có tác dụng co bóp mạnh đối với tử cung
của mèo có chửa, có tác dụng làm dịu tử cung mèo không có chửa.
Theo Kinh Lợi Bân (Viện nghiên cứu Quốc lập Bắc Kinh - sở nghiên
cứu sinh lí học (1937) thì Ngưu tất có tác dụng như sau: đối với động vật đã
gây mê, Ngưu tất có thể gây giảm huyết áp tạm thời, làm yếu sức bóp của tim
ếch, ức chế sự co bóp của khúc tá tràng, ngoài ra Ngưu tất có tác dụng lợi tiểu
[12].
Lương y Lê Trần Đức đã thử nghiệm và có hiệu quả tốt 4 bài thuốc sử
dụng Ngưu tất như sau: (1) Ngưu tất dùng vị độc ngày 40 – 60 g sắc uống
nhiều lần chống co giật, bại liệt, phong thấp, teo cơ, xơ vữa mạch máu. (2)
Rượu thuốc Ngưu tất (100g) và một số dược liệu khác uống 1-2 lần/ngày,
trong 10 ngày chữa các chứng bị thương máu tụ ở ngoài hay máu ứ ở trong.
(3) Thang an thần: Ngưu tất 30g và hạt muồng sao 20g uống mỗi ngày chữa
nhức đầu, chóng mặt, ù tai, rối loạn tiền đình. (4) Thang tiết niệu: Ngưu tất
30g và một số dược liệu sắc uống chữa bệnh phù thũng, viêm cầu thận cấp,
viêm gan virut, viêm bàng quang, đái ra máu [32].
Những năm gần đây, Giáo sư Đoàn Thị Nhu - Viện dược liệu đã nghiên
cứu về dược lí thấy cao toàn phần của Ngưu tất có tác dụng làm hạ huyết áp
và giảm cholesterol trong máu. Viện dược liệu cũng sản xuất thử thuốc
Bidentind chiết xuất từ Ngưu tất Bắc. Bidentind được đưa ra thử lâm sàng
rộng rãi và có kết quả rất tốt. Nhiều xí nghiệp dược phẩm TW và địa phương
sản xuất Bidentin. Bidentin đã trở thành thuốc thông dụng, quen thuộc và
được dùng nhiều trong khoa tim mạch hiện nay [31].
Phan Hải Nam (2005), nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc hạ huyết áp
những ưu điểm lớn mà không một loại hình nhân giống nào có được, đó là:
(1) Hệ số nhân giống cao, rút ngắn thời gian đưa giống vào sản xuất.
Từ một cây trong vòng 1 – 2 năm có thể tạo thành hàng triệu cây. Tốc độ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
13
nhân của phương pháp vi nhân giống khoảng 3
6
– 10
12
lần/năm, chẳng hạn
khoai tây từ 50 ống giống của ngân hàng giống thế giới sau 6 tháng nhân
giống được 10 vạn cây khoai tây.
(2) Tiết kiệm không gian, phương pháp này nhân được một số lượng
lớn trong một diện tích nhỏ, trong 1m
2
diện tích có thể được 18000 cây.
(3) Sản phẩm cây giống đồng nhất: vi nhân giống về cơ bản là công
nghệ nhân dòng. Nó tạo ra quần thể có độ đồng đều cao dù xuất phát từ cây
mẹ có kiểu gen dị hợp hay đồng hợp.
(4) Nâng cao chất lượng giống cây trồng: nuôi cấy mô là một
phương pháp hữu hiệu để loại trừ virus, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã bị
nhiễm bệnh. Cây giống sạch bệnh tạo ra bằng kĩ thuật nuôi cấy mô thường
tăng năng suất 15 – 30% so với giống gốc.
(5) Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển: một thùng 40000 cây dâu
tây chỉ nặng 15kg), việc bảo quản cây giống cũng được thuận tiện, các cây
giống giữ ở nhiệt độ 4
0
C trong hàng tháng vẫn cho tỷ lệ sống trên 95%.
Các dạng sản phẩm của vi nhân giống như cây con in vitro hoặc trong
trưởng thì có ba khả năng: cây phát triển từ chồi đỉnh (chồi ngọn), cây phát
triển từ chồi nách phá ngủ, cây phát triển từ chồi nách mới phát sinh. Tuy
nhiên trong thực tế rất khó phân biệt được chồi phá ngủ và chồi mới phát sinh.
Có hai phương thức hình thành cây tái sinh từ nuôi cấy mô phân sinh
hoặc đỉnh sinh trưởng.
Cây tái sinh trực tiếp từ chồi đỉnh hoặc chồi nách phá ngủ. Phương thức
này chủ yếu gặp ở các đối tượng 2 lá mầm như khoai tây, thuốc lá, chanh,
cam, hoa cúc, và một số cây 1 lá mầm như dứa, sợi, mía Cây tái sinh qua
giai đoạn hình thành dẻ hành (protocom), chủ yếu gặp ở các đối tượng 1 lá
mầm như phong lan, hoa huệ Cùng một lúc đỉnh sinh trưởng tạo thành hàng
loạt protocom và các protocom này có thể tiếp tục phân chia thành các
Copyright: Tài liệu đại học ©