ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
-----------------------
NGUYỄN THỊ THIỀU
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ HOẠT TÍNH
SINH HỌC CỦA SỮA ONG CHÚA VÀ PHẤN HOA
Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Mã số: 60 44 27 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Người hướng dẫn khoa học:
TS. Dương Ngọc Tú Hà Nội - 2010
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
2
Lời cảm ơn
Trớc hết Em xin đợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc TS. Dơng Ngọc Tú, đã giao đề
1.1.3. Thu hoạch sữa ong chúa ............................................................................... 6
1.1.4. Tác dụng của sữa ong chúa .......................................................................... 7
1.1.5 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
của sữa ong chúa ..................................................................................................... 8
1.2. Phấn hoa ....................................................................................................... 12
1.2. 1. Giới thiệu về phấn hoa ............................................................................... 12
1.2. 2. Cấu trúc của phấn hoa [1] ........................................................................ 14
1.2. 3. Thành phần hoá học của phấn hoa [51]. ................................................ 18
1.2.4. Cách thu hoạch phấn hoa ........................................................................... 18
1.2.5. Tác dụng của phấn hoa ong ........................................................................ 19
1.2. 6. Lớp chất flavonoit, thành phần hoá học có trong phấn hoa ................ 20
1.2.7. Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
của phấn hoa.......................................................................................................... 21
Chơng 2: Thực Nghiệm ................................................................................... 24
2.1. Đối tợng và kỹ thuật thực nghiệm .......................................... 24
2.1.1. Nguyên liệu .................................................................................................. 24
2.1.2. Hoá chất ...................................................................................................... 24
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
4
2.1.3. Các dụng cụ và trang thiết bị nghiên cứu ................................................. 24
2.1.4. Các phơng pháp phân tích, phân tách và phân lập các hợp chất ........ 25
2.1.5. Các phơng pháp các định cấu trúc hoá học các hợp chất ..................... 28
2.1.6. Phơng pháp thử hoạt tính sinh học ......................................................... 28
2.2. Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa và phấn
hoa ......................................................................................................................... 31
2.2.1 Quy trình phân lập chất trong sữa ong chúa ............................................ 31
2.2.2. Chiết mẫu phấn hoa và phân lập hợp chất 2 (7-O-
Phổ cộng hởng từ hạt nhân proton (
1
H Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)
CC: Sắc ký cột (Column Chromatography)
DEPT: Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO: Dimethyl Sunfoxide
EtOH: Etanol
HPLC:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-performance liquid
chromatography)
HPLC-pre:
Sắc ký lỏng hiệu năng cao - điều chế (High-performance liquid
chromatography preparative)
EI-MS:
Phổ khối lợng va chạm điện tử (Electron Impact-Mass
spectroscopy)
ESI - MS Phổ khối bụi điện tử (Electron Spray Ionization Mass Spectra)
TLC: Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography)
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
6
Danh mục bảng
Chơng 1 Trang
Bảng 1.1: Quá trình phát triển của ong chúa và ong thợ
4
7
Danh mục hình
Chơng 1 Trang
Hình 1.1: Sự phát triển của ấu trùng ong bởi sữa ong chúa
3
Hình 1.2: Sữa ong chúa tơi
3
Hình 1.3: Các dẫn xuất hydroxy và este của 10 HDA thu đợc từ
sữa ong chúa
9
Hình 1.4: Sơ đồ phân lập 10- HDA, các dẫn xuất hydroxy và este
của 10-HDA
10
Hình 1.5: Hình ảnh của một số loại phấn hoa dới kính hiển vi
điện tử quét
13
Hình 1. 6: Cấu trúc hạt phấn
15
Hình 1.7: Cấu tạo hạt phấn hoa
17
Hình 1.8: Ong thu hạt phấn hoa
19
Hình 1. 9: Flavan (2 phenyl chroman)
20
Chơng 2
Hình 2.1: Công thức của phân tử Coomassie Brilliant Blue
31
47
Hình 3.10: Phổ ESI MS của chất 2
48
Hình 3.11: Cấu trúc của chất 2 (7-O -
Xyloside-naringenin)
48
Hình 3.12: Sơ đồ quá trình sinh tổng hợp các Flavonoit
51
Hình 3.13: Sơ đồ sinh tổng hợp của 7 O-
Xyloside
naringenin
52
Hình 3.14: Biểu đồ hoạt tính của phấn hoa
53
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
trong phòng chống lại nhiều loại bệnh tật khác nhau và tăng cờng sức khoẻ.
Sữa ong chúa và phấn hoa là những sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, chứa
nhiều thành phần hoá học và có nhiều tác dụng dợc lý.
Việc nghiên cứu, khảo sát về thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
của sữa ong chúa và phấn hoa ở Việt Nam nhằm đặt cơ sở khoa học cho việc
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
2
sử dụng chúng một cách hợp lý và có hiệu quả là rất quan trọng. Do đó chúng
tôi đã chọn đề tài Nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học
của sữa ong chúa và phấn hoa. Việc nghiên cứu thành phần hoá học và cấu
trúc của các hợp chất cũng nh hoạt tính sinh học từ sữa ong chúa và phấn hoa
sẽ tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong lĩnh vực tìm kiếm các
phơng thuốc mới cũng nh giải thích đợc tác dụng của các đối tợng nghiên
cứu trên. Do đó, các kết quả thu đợc sẽ là yếu tố quan trọng đóng góp cho
nhân loại những phát hiện mới có ý nghĩa thực tiễn cũng nh đóng góp cho sự
phát triển nền y học dân tộc Việt Nam.
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
3
chơng 1. Tổng quan
1.1. Sữa Ong chúa
1.1.1. Nguồn gốc và đặc điểm sữa ong chúa
Sữa ong chúa là thức ăn duy nhất của ong chúa và các ấu trùng ong,
đợc sản sinh từ tuyến hạch miệng của ong thợ [19]. Sữa ong chúa có màu
trắng sữa, hơi vàng, vị hơi chua. Ong chúa sử dụng loại thức ăn này cả cuộc
đời, còn những ấu trùng ong đợc ăn sữa ong chúa trong 3 ngày đầu của cuộc
đời. Chính vì thế mà gây ra sự khác biệt giữa ong chúa và ong thợ [16]: Tuổi
thọ của ong chúa khoảng 5-6 năm, gấp 40 lần so với ong thợ là chỉ sống đợc
thay đổi [6].
Nớc: hàm lợng nớc trong sữa ong chúa khá ổn định với những
nguồn thu hoạch ở nhiều nơi khác nhau, nó chiếm khoảng trên 60% và có hoạt
độ (a
w
là lợng nớc tồn tại trong sản phẩm hoặc vật chất) trên 0,92 mặc dù
trong sữa ong chúa có sự xuất hiện đáng kể lợng ổn định vi sinh vật. ở bên
trong các tổ ong, sữa ong chúa liên tục đợc tạo ra bởi các chú ong thợ cùng
với sự hút ẩm từ môi trờng xung quanh và khả năng hoà tan của một số hợp
chất. Do đó độ ẩm trong sữa ong chúa hầu nh không thay đổi.
Protein: Theo một số quan điểm, protein chiếm khoản 27 41% là một
trong những phần quan trọng nhất của sữa ong chúa khô. Các axit amin có mặt
với hàm lợng phần trăm cao nhất là: prolin, lysin, axít glutamic, -alanin,
phenylalanin, aspartate và serin [11]. Nồng độ của axít amin nhóm D rất ít,
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
5
trong điều kiện thuận lợi, một số enzym protein hoạt động liên tục kể cả khi
sữa ong chúa đợc bảo quản một nơi cố định.
Cacbonhydrat: Chiếm khoảng 30% trong sữa ong chúa khô.
Lipit và axít 10-hydroxy-2-decenoic(10-HDA): Thành phần này xuất
hiện trong sữa ong chúa khá khiêm tốn chỉ khoảng 8-19% trong thành phần
sữa ong chúa khô. Nhng không thể phủ nhận nó là thành phần quan trọng
nhất của sữa ong chúa. Trong thực tế, phần lipit bao gồm chủ yếu là các axít
hữu cơ (chiếm khoảng 80-90%), hầu hết dới dạng tự do, với cấu trúc hiếm
gặp trong tự nhiên. Thực tế chúng là các mono-, axít đihydroxy và axít
đicacboxylic với 8 đến 10 nguyên tử các bon, có sự sắp xếp đặc trng riêng
[39].
Axít hydroxy với 10 nguyên tử các bon (nh 10-HDA) có thể tìm thấy
với nồng độ cao hơn tất cả các axít khác. Nó không chỉ gây ra điểm khác biệt
Sacarozơ (%) 0,5-2,0 -
Tạp chất (%) 0,8-3,0 2-5
pH 3,4-4,5 3,4 -4,5
1.1.3. Thu hoạch sữa ong chúa
Sữa ong chúa là một tặng phẩm thiên nhiên mà khoa học chỉ có thể
phân tích, xác minh mà không thể tái tạo. Do đó điều mà các nhà khoa học
có thể làm là nghiên cứu cặn kẽ mọi sinh hoạt của loài ong để rồi lợi dụng vào
đó lấy sản phẩm phục vụ con ngời.
Trong công nghệ nuôi ong lấy mật con ngời đã vô tình nhng may
mắn biết cách tạo nhiều sữa ong chúa qua chu trình tạo ong chúa giống. Ngày
nay, sữa ong chúa đợc bán trên khắp thế giới chủ yếu là sản phẩm thu đợc
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
7
từ công nghệ nuôi ong. Còn sữa ong chúa đợc lấy từ tự nhiên hầu nh không
đợc làm sản phẩm thơng mại. Sau đây là trình bày sơ lợc về quy trình sản
xuất và thu hoạch sữa ong chúa:
a. Quy trình bắt cóc ong chúa
Là quy trình tạo ong chúa mới qua việc bắt đi ong chúa đang trong
nhiệm kỳ. Theo đặc tính của loài ong, để cho đàn ong đợc tồn tại, khi các
chú ong thợ thấy mất đi ong chúa, chúng lập tức chọn một trong những ấu
trùng ong thúc dỡng để trở thành chúa. Việc bắt cóc, biệt lập hay giết đi ong
chúa đơng nhiệm nhằm thúc đẩy ong thợ sớm chọn và thúc dỡng nhiều ấu
trùng ong để trở thành ong chúa. Quy trình này chỉ thích hợp dới dạng tiểu
sản xuất, lợng sữa ong chúa thu đợc ít.
b. Quy trình làm giả tổ ong chúa
Là quy trình tạo hàng loạt tổ ong chúa bằng cách lấy enzym và những
mùi vị từ tổ ong chúa đem trét vào những tổ mới đã chuẩn bị sẵn. Mùi vị của
các tổ ong giả đã đánh lừa các chú ong thợ. Khi các chú ong thợ khám phá ra
Trong một số công trình khoa học đã công bố, sữa ong chúa đợc báo
cáo nh một tác nhân làm thay đổi miễn dịch trong bệnh Badơdô [21]. Nó
cũng đợc báo cáo là có tác dụng đối với hệ thần kinh đệm [26] và các tế bào
tuỷ sống trong hệ thần kinh [21].
Ngoài ra sữa ong chúa còn đợc sử dụng nh một loại thực phẩm chức
năng có khả năng chống mệt mỏi, chống dị ứng, chống lão hoá, chống vi
khuẩn [60] rất có lợi cho cơ thể của chúng ta. Sữa ong chúa còn làm tăng
khả năng sinh dục ở cả hai giới Tóm lại, sữa ong chúa rất tốt cho cơ thể của
con ngời, nếu dùng thờng xuyên thì sẽ đem lại một sức khoẻ dẻo dai và
phòng chống lại nhiều loại bệnh tật.
1.1.5 Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học và hoạt tính sinh
học của sữa ong chúa
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
9
1.1.5.1. Một số kết quả nghiên cứu về thành phần hoá học của sữa ong chúa
a. Phân lập 10-HDA từ sữa ong chúa.
Năm 2005, Naoki Noda và các đồng nghiệp phát hiện ra trong dịch
chiết clorofom/metanol chứa nhiều axít béo có giá trị. Bằng việc sử dụng
phơng pháp HPLC điều chế pha đảo với 70% CH
3
CN và 80% CH
3
CN, ông và
các cộng sự đã tách đợc 10- HDA và một số dẫn xuất hydroxy béo, este của
nó từ dịch chiết clorofom/metanol của sữa ong chúa [46]. Sau đây là cấu trúc
của 13 chất mà Naoki Noda và cộng sự đã xác định đợc (trong đó chất 1 là
10 HDA, còn lại là các dẫn xuất hyđroxy và este của 10 HDA).
-OPN
chiết với CHCl
3
/ CH
3
OH, 2:1 (v/v)
chiết với CHCl
3
Cosmosil 75C
18
-OPN
chiết với CHCl
3
/ CH
3
OH, 2:1 (v/v)
chiết với CHCl
3
chiết với CH
3
OH
Cosmosil 75C
18
-OPN
chiết với CHCl
3
/ CH
3
Hình 1.4: Sơ đồ phân lập 10- HDA, các dẫn xuất hydroxy và este của 10-HDA
Năm 2007, Naoki Noda và các cộng sự cũng dùng HPLC đã phân lập
đợc thêm 2 monoglucozit của 10-HDA và axít 10- hydroxydecanoic,16 sterol
chứa 28 29 nguyên tử các bon trong sữa ong chúa [56].
Dịch chiết CHCl
3
Sữa ong chúa đã đợc động khô
Dịch chiết CH
3
OH
Dịch chiết
CHCl
3
/CH
3
3
/CH
3
OH
Fr.I
Cặn chiết
Dịch chiết CHCl
3
Sữa ong chúa đã đợc động khô
Lớp CH
3
OH lớp H
2
O
13
Phần kém
phân cực
7-9 10-12
Fr.II
Dịch chiết
CHCl
3
/CH
3
OH
Fr.I
Cặn chiết
Dịch chiết CHCl
3
dùng HPLC điều chế [28].
b. Phân lập các thành phần hoá học khác
- Năm 2003, Boselli và cộng sự sử dụng máy GC-MS đã xác định đợc
các axit amin tự do trong sữa ong chúa. Các axít amin xác định đợc là:
prolin, lysin, glutamat, -alanin, phenylalanin, aspartat and serin [11].
- Năm 1998, Schmitzova và cộng sự đã xác định đợc hơn 80% protein
có trong sữa ong chúa là các protein chủ đạo (đợc gọi là major royal jelly
proteins và thờng đợc viết tắt là MRJPs). Năm 2009, Shougo Tamura và
các cộng sự sử dụng HPLC và các phơng pháp phân tích khác đã tách ra đợc
các protein chính trong sữa ong chúa [50] .
Hàm lợng nớc trong sữa ong chúa tơi đã đợc xác định bởi Ferioli
và các cộng sự [22]. Năm 2006, Benfenati xác định đợc các khoáng chất có
trong sữa ong chúa [10].
Ngoài ra còn rất nhiều công trình nghiên cứu về xác định các thành
phần hoá học có trong sữa ong chúa [6].
1.1.5.2. Một số nghiên cứu về hoạt tính sinh học của sữa ong chúa trên thế
giới
a. Hoạt tính chống oxi hoá của sữa ong chúa.
Trong một nghiên cứu của Aziza A., và cộng sự đã kết luận rằng sữa
ong chúa có tiềm năng chống lại các nguy hiểm độc hại từ FB (chất đợc sản
sinh từ nấm, là chất độc hại cho ngời và động vật). Nếu sử dụng sữa ong chúa
sẽ làm giảm các thông số sinh hoá có lợi cho cơ thể của ngời và động vật,
đồng thời cũng điều hoà đợc các phản ứng hoá học trên các mô của gan và
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
12
thận. Nghiên cứu cũng khẳng định sữa ong chúa có đặc tính chống oxi hoá
[8].
b. Hoạt tính chống ung th của sữa ong chúa.
Cách đây khoảng vài chục năm, ngời ta đã bắt đầu nghiên cứu về hoạt
Phấn hoa có thể chia làm hai loại [1]:
- Thứ nhất, phấn hoa gió là phấn hoa đợc phát tán đi nhờ gió.
- Thứ hai, phấn hoa đợc phát tán nhờ côn trùng (trong đó có ong).
Ong là loài vật đợc con ngời để ý tới và đã dùng làm vật nuôi kinh tế.
Mật ong và sữa ong chúa có nhiều tác dụng đã đợc nhiều nghiên cứu khẳng
định. Gần đây ngời ta đã bắt đầu nghĩ đến việc nghiên cứu về phấn hoa vì
phấn hoa là nguồn thức ăn của ong nên sẽ có những tính chất giống sữa ong
chúa và mật ong. Nguồn phấn hoa đợc thu từ ong mật dễ dàng hơn thu các
côn trùng khác. Hiện nay ở nớc ta có rất nhiều vùng nuôi ong nh Sơn La,
Nguyễn Thị Thiều - K19 Chuyên ngành: Hoá Hữu cơ
Luận văn thạc sỹ khoa học
14
Đắc Lắc ngoài việc thu mật ong và sữa ong chúa ra, ngời ta còn lợi dụng
để thu phấn hoa ong. Tuỳ mỗi vùng khác nhau mà thành phần hoá học trong
phấn hoa khác nhau.
1.2. 2. Cấu trúc của phấn hoa [1]
Phấn hoa là phần trên các nhị hoa (chứa giao tử đực) của thực vật có
hoa. Kiểu chung nhất của nhị đực ở thực vật hạt kín là gồm bao phấn gồm hai
túi phấn hay là túi tiểu bào tử đợc đính liền trên một cuống có gân mảnh là
chỉ nhị. Mỗi túi phấn có các lớp vách và ô phấn trong đó các tiểu bào tử đợc
tạo nên. Bao phấn của đa số thực vật hạt kín có bốn túi bào tử, nghĩa là mỗi
thuỳ bên có hai ô phấn, ở một số ít cây có bao phấn với hai ô phấn, trong đó
mỗi ô phấn ở một nửa bao phấn. ở trạng thái trởng thành trớc khi bao phấn
mở, phần giữa các ô phấn có thể bị vỡ ra và bằng cách đó mà bao phấn bốn túi
bào tử giống nh hai ô, còn bao phấn hai túi bào tử thì nh là bao phấn một ô.
Một số cây hai lá mầm nguyên thuỷ có nhị đực hình lá, ba gân mang
các túi bào tử ở mặt lng giữa gân giữa và các gân hai bên. Các nhị đực một
gân là dạng tiến hoá và đến nay có đến 95% thực vật hạt kín có nhị đực một
gân. Cấu trúc hạt phấn hoa đợc mô tả trong hình 1.6.
Chỉ nhị đực có cấu tạo tơng đối đơn giản. Mô mềm bao quanh bó
16
Lớp dinh dỡng là lớp chuyên hoá phát triển đồng thời với mô sinh bào
tử ở dới đó. Lớp dinh dỡng nằm bao quanh ô phấn. Tế bào của lớp này có
chất tế bào đông đặc trớc khi phát sinh bào tử và có thể là đa bội hoặc nhiều
nhân. Lớp này nh tên gọi cung cấp dinh dỡng cho hạt phấn phát triển. Có
hai kiểu lớp dinh dỡng: lớp tiết (tuyến tiết) và lớp amíp (chất nhầy). Lớp tiết
gặp ở các họ thực vật hạt kín nhiều hơn là lớp amíp. Sau quá trình giảm phân,
lớp tiết bắt đầu bị phân huỷ. Vách tế bào của chúng bị hoà tan và chất tế bào
đợc tung vào trong ô của túi phấn và tạo thành lớp áo bao quanh các hạt
phấn. Lipit là thành phần chính của lớp này.
Trong lớp dinh dỡng kiểu amíp thì chất nguyên sinh vẫn đợc giữ lại
khi vách của chúng bị hoà tan và chen vào các hạt phấn đang phát triển. Chất
nguyên sinh dính với nhau quanh ô phấn tạo thành thể nguyên hình bao
quanh. Chất nhầy (thể nguyên hình) này tiếp tục kết dính với các hạt phấn cho
đến khi hạt phấn chín. Trong thời gian bao phấn khô, trớc khi hoa nở một
thời gian ngắn chất nhầy bị mất nớc và lắng đọng trên bề mặt hạt phấn.
Lớp giữa thờng là một lớp sớm bị tiêu huỷ và bị ép dẹp giữa lớp dinh
dỡng và lớp trong, cuối cùng bị lớp dới đó hấp thụ.
Lớp trong là lớp chủ yếu của vách bao phấn thực vật hạt kín ngoại trừ
những bao phấn mở bằng lỗ. Đặc điểm của lớp này là có đờng dày thứ cấp
thành đai hay thành dải. Tại vùng bao phấn mở (stomium), đờng dày thứ cấp
của lớp trong không phát triển. Do đặc điểm của đờng dày ở lớp trong mà lớp
này có tên gọi là lớp sợi.
Hạt phấn:
Hình thái của hạt phấn cũng giống nh bào tử của thực vật khuyết hạt
nổi bật là vách của nó với các đặc điểm kiến trúc bề mặt theo các kiểu rất
khác nhau cũng nh sự bền vững rất cao về tổ chức, hoá học và sự phát triển.
Vách hạt phấn hay vỏ hạt phấn điển hình gồm một lớp vỏ ngoài (sexine) và
Copyright: Tài liệu đại học ©