PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN HAEMOPHILIA A
BẰNG KỸ THUẬT PCR-RFLP SỬ DỤNG DEEP
VENT ADN POLYMERASE

Nguyễn Hoài Giang
Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương
Nguyễn Tùng Lâm
Trường Đại học Ngoại Thương

ĐẶT VẤN ĐỀ

Haemophilia A (bệnh máu khó đông) là một trong những
bệnh di truyền phổ biến liên quan đến nhiễm sắc thể X.
Ước tính trên thế giới có khoảng từ 1/5000 đến 1/10.000
các bé trai sinh ra mắc bệnh này. Theo số liệu thống kê của
Viện Huyết học và Truyền máu Trung ương số lượng bệnh
nhân Haemophilia A ở Việt nam cũng không phải là nhỏ.
Một trong những nguyên nhân gây ra bệnh Haemophilia A
là do các đột biến ở gen mã hoá cho yếu tố đông máu số
VIII (factor VIII). Gen này nằm trên cánh dài của nhiễm
sắc thể tại vị trí Xq28. Gen mã hoá cho yếu tố VIII rất lớn
(khoảng 180 kb) bao gồm 26 exon (1). Kỹ thuật PCR dùng
Taq ADN polymerase, sau đó phát hiện điểm đột biến bằng
enzyme giới hạn (PCR-RFLP) đã được các nghiên cứu
trước đây sử dụng rất có hiệu quả để phát hiện các đột biến
của bệnh Haemophilia A(1, 2).

Deep Vent ADN polymerase có hoạt tính xúc tác quá trình
tổng hợp ADN mới như Taq ADN polymerase. Các nghiên
cứu của hãng New England Biolab cho thấy Deep Vent
ADN polymerase có nhiều ưu điểm hơn so với Taq ADN

ADN polymerase, các enzyme giới hạn Bcl I và Hind III và
thang ADN chuẩn 100bp của hãng New England Biolabs
(Mỹ). Các hoá chất khác sử dụng cho nghiên cứu này đều
của các hãng Sigma, Merck, Promega…

Phương pháp nghiên cứu

• Tách chiết ADN từ máu được cải tiến theo phương
pháp được mô tả bởi Sambrook và cộng sự (5).

• Phản ứng PCR sử dụng enzyme Taq ADN polymerase,
với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và 19 của yếu tố VIII
được tiến hành theo nghiên cứu của Kogan và cộng sự (2).

• Phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu cho intron 18 và
19 của yếu tố VIII, sử dụng enzyme Deep Vent được tối ưu
theo theo phương pháp nghiên cứu được mô tả bởi Nguyễn
Hoài Giang và các đồng tác giả (6).

• Cắt sản phẩm PCR bằng enzyme giới hạn Bcl I và Hind
III theo thường qui chuẩn của hãng New England Biolabs
(4).

• Điện di sản phẩm PCR trên gel polyacrylamide 6% và
nhuộm bạc theo phương pháp của Sambrook và cộng sự
(5). KẾT QUẢ, THẢO LUẬN


C-20 giây, 72
o
C-20 giây; 2 mM Mg
2+
;
200 àM dNTPs. Kết quả điện di trên gel polyacrylamide
6% cho thấy sản phẩm PCR với cặp mồi đặc hiệu cho
intron 18 có kích thước 142 bp ở cả người bình thường
khoẻ mạnh và bệnh nhân Haemophilia, giống như kết quả
của Kogan và cộng sự (giếng 1 đến 3, Hình 1). Theo nghiên
cứu trước đây (1, 2), đột biến ở intron 18 sẽ làm thay đổi vị
trí nhận biết của enzyme giới hạn Bcl I. Nghĩa là những
bệnh nhân Haemophilia A có đột biến ở intron 18 sẽ không
thay đổi kích thước của sản phẩm PCR sau khi ủ với
enzyme Bcl I (giếng 5, Hình 1). Ngược lại những người
bình thường khoẻ mạnh hoặc những bệnh nhân
Haemophilia A không có đột biến ở intron 18 sẽ bị enzyme
giới hạn Bcl I cắt tạo ra 2 băng kích thước 99 và 43 bp
(giếng 4, Hình 1). Trong số 25 mẫu người bình thường
khoẻ mạnh khi sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP với cặp mồi
đặc hiệu cho intron 18: 25/25 mẫu (100%) đều bị cắt với
enzyme Bcl I ở 50
o
C sau 12 giờ. Trong số 19 mẫu bệnh
nhân Haemophilia A có 8 mẫu không bị cắt và 11 mẫu bị
cắt bởi enzyme Bcl I ở 50
o
C sau 12 giờ. Kết quả này cho
thấy có 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được
nghiên cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho

Sử dụng điều kiện PCR của intron 19 của Kogan và cộng
sự là 30 chu kỳ với 94
o
C-1 phút, 55
o
C-1 phút, 70
o
C-3 phút;
chúng tôi cũng đã thành công trong việc khuyếch đại intron
này bằng Taq ADN polymerase (giếng 1, Hình 2). Tương
tự với intron 18, điều kiện PCR với Deep Vent ADN
polymerase cho cặp mồi của intron 19 sau khi tối ưu hoá là
30 chu kỳ với 94
o
C-30 giây, 57
o
C-20 giây, 72
o
C-40 giây và
sản phẩm PCR có kích thước 730 bp.

Loại trừ 8 mẫu đã phát hiện được mang đột biến ở intron
18, 11 mẫu bệnh nhân còn lại và 25 mẫu người bình thường
khoẻ mạnh được khuyếch đại bằng cặp mồi đặc hiệu cho
intron 19 với Deep Vent ADN polymerase theo điều kiện
PCR đã được tối ưu hoá như trên (giếng 3 và 5, Hình 2).
Các nghiên cứu trước đây đã chỉ rõ đột biến ở intron 19 sẽ
làm thay đổi vị trí nhận biết của enzyme giới hạn Hind III
(1, 2). Nghĩa là những bệnh nhân Haemophilia A có đột
biến ở intron 19 sẽ không thay đổi kích thước của sản phẩm


Giếng 4: Sản phẩm PCR (ở giếng 3) sau khi cắt bằng
enzyme Hind III.

Giếng 5: Sản phẩm PCR được khuyếch đại với enzyme
Deep Vent ADN polymerase (ADN khuôn được tách chiết
từ máu của bệnh nhân Haemophilia A).

Giếng 6: Sản phẩm PCR (ở giếng 5) sau khi cắt bằng
enzyme Hind III .

Mr: Thang ADN chuẩn 100bp.
KẾT LUẬN

• Hình thành được qui trình phát hiện các đột biến ở
intron 18 và 19 của gen mã hoá cho yếu tố VIII, bệnh
Haemophilia A bằng kỹ thuật PCR-RFLP với Deep Vent
ADN polymerase.

• 8/19 (42%) số bệnh nhân Haemophilia A được nghiên
cứu có mang đột biến ở intron 18 gen mã hoá cho yếu tố
VII và không có mẫu nào mang đột biến ở intron 19.
TÀI LIỆU THAM KHẢO



SUMMARY

Detection of mutations (in Introns 18 and 19) from
haemophilia patients by PCR-RFLP with DEEP VENT
DNA POLYMERASE

Haemophilia A is an X-linked recessive genetic disorder
caused by the mutations in the factor VIII gene. The
incidence of haemophilia A is from 1/5000 to 1/10.000
males births. The changes of factor VIII gene are the points
mutations and inversion mutation in intron 22. Genetics
analysis in haemophilia A families is widely carried out by
linkage analysis by allelotyping using restriction fragment
length polymorphism (RFLP) and microsatellite repeat
(STR) markers to track chromosomes linked with the
disease. PCR-RFLP is a fast and convenient method to
detect the mutations in the factor VIII gene.

Deep Vent DNA polymerase is purified from the strain of
E.coli that carries the Deep Vent DNA polymerase gene of
Pyrococcus species GB-D. The native organism was
isolated from a submarine thermal vent at 2010 meters and
it able to grow at temperature as high as 104oC. Deep Vent
DNA polymerase is a high-fidelity thermophilic DNA
polymerase. The fidelity of Deep Vent DNA polymerase is
derived in part from an integral 3’-5’ proofreading
exonuclease activity.

In this study, we applied the PCR-RFLP technique with