VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
Lớp: KSCNSH 06 - 01
LUẬN VĂN BÁO CÁO
Định lượng kháng nguyên Cyfra 21- 1
bằng kỹ thuật Real
SVTH: Đinh Thị Thu Hằng
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Mục lục
Mở đầu
Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (International
Agency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu trong số các bệnh về ung thư. Tổng số người chết vì ung thư phổi
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
2
2
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
hàng năm cao hơn tổng số người chết vì ung thư vú, ung thư ruột và ung thư
tuyến giáp, và đứng thứ hai trong tổng số tử vong vì bệnh sau các bệnh về tim
mạch. Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia của Việt Nam cũng đưa ra
những cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục trong
những năm gần đây. Phần lớn bệnh nhân ung thư khi được phát hiện đã ở giai
đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong. Vì rất nhiều lí do
như: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm không an toàn… nên
căn bệnh nguy hiểm này ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù đây là một căn
bệnh rất nguy hiểm nhưng nếu bệnh nhân được phát hiện sớm và được điều trị
theo những phác đồ thích hợp thì người bệnh vẫn có cơ hội được cứu sống, thậm
chí là khỏi bệnh. Ngoài những phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thống
như: chụp hình phổi bằng X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa học
đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh
ung thư. Sự phát triển như vũ bão của ngành sinh học phân tử đã mở ra một
hướng mới trong nghiên cứu Sinh_Y_Dược học. Việc tìm ra những chỉ thị sinh
- Ung thư phổi tế bào nhỏ (small_cell carcinoma) chiếm khoảng 20% trong số
các bệnh ung thư phổi, loại này thường phát triển ở phế quản – phổi (không ở
ngoại vi phổi). Mặc dù tế bào ung thư là những tế bào nhỏ, nhưng chúng phát
triển rất nhanh và tạo thành những khối u lớn, có khả năng lan rất xa trước khi có
triệu chứng lâm sàng. Nhiều trường hợp khi phát hiện không thể mổ được nữa,
tử vong nhanh. Đây là loại ung thư có quan hệ mật thiết với thuốc lá và là loại
ung thư ác tính nhất.[3]
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
5
5
Hình 1: Ung thư phổi
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Ung thư phổi không phải tế bào nhỏ (non small _cell carcinoma) chiếm
khoảng 80% trong số các bệnh ung thư phổi, ung thư phổi không phải tế bào nhỏ
thường gặp hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Nó thường phát triển và lan chậm hơn
ung thư phổi tế bào nhỏ. Có ba loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ chủ yếu,
chúng được đặt tên theo loại tế bào mà từ đó ung thư phát triển.[3]
+ Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến
nhầy trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% trong các loại ung thư
phổi. Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở phụ nữ và những người không hút
thuốc.[3]
+ Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở phế
quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản.Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở
nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% trong các loại ung thư phổi.[3]
+ Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt
phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% trong các loại ung thư phổi.[3]
1.1.3. Triệu chứng của bệnh ung thư phổi
Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có các triệu chứng sau:
- Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn.
- Thường xuyên thấy đau ngực.
(P.Freour, 1979). Chất này đóng vai trò quan trọng trong phát sinh ung thư phổi.
Ngoài ra trong khói thuốc lá còn chứa các chất gây ung thư khác như
nitrosamine, benzanthracene. Các chất này cũng là nguyên nhân gây ra bệnh Ung
thư phổi.
Trong khóa họp vào tháng 11 năm 1982 tại Geneve, các chuyên gia về ung thư
phổi đã thống nhất kết luận rằng 80-90% nguyên nhân dẫn đến ung thư phổi là
do hút thuốc lá. Tại Việt Nam, theo thống kê trên 389 bệnh nhân mắc ung thư
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
7
7
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
phổi đã được phẫu thuật thì: 70% số bệnh nhân có hút thuốc lào, 52% hút thuốc
lá, 10,49% hút cả thuốc lá và thuốc lào. Những người hút các loại khác và những
người hít phải khói thuốc lá (hút thuốc lá thụ động) cũng có nguy cơ tương tự.
Ngừng hút thuốc lá sẽ làm giảm đáng kể khả năng mắc ung thư phổi.
1.1.5.2. Radon
Radon là một chất khí phóng xạ không màu, không mùi và không nhìn thấy bằng
mắt thường. Trong tự nhiên radon có trong sỏi đá. Nó có thể làm tổn hại tới phổi
và từ đó có thể dẫn đến ung thư phổi. Những người làm việc trong hầm mỏ có
thể tiếp xúc với khí radon. Ở một số vùng ở Mỹ, người ta còn tìm thấy khí radon
ở trong những ngôi nhà.
1.1.5.3. Amiang
Amiang là tên gọi của một nhóm các chất khoáng, chúng tồn tại trong tự nhiên
dưới dạng sợi và được sử dụng trong một số nghành công nghiệp. Amiang có hai
nhóm chính là nhóm amphibole và nhóm serpentine. Nhóm amphibole khi hấp
thụ qua đường hô hấp và lưu lại trong phổi sẽ rất khó bị đào thải ra ngoài. Các
sợi thuộc nhóm amphibole là nguyên nhân chính gây ra các bệnh ung thư phổi, u
trung biểu mô.
1.1.5.4. Nghề nghiệp
Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trò quan trọng trong
Tiền sử bản thân người bệnh cũng là một nguyên nhân gây ung thư phổi. Một
người đã mắc ung thư phổi một lần có nguy cơ mắc ung thư phổi lần hai cao hơn
so với một người chưa bao giờ mắc bệnh ung thư phổi.Bỏ hút thuốc sau khi được
chẩn đoán ung thư phổi có thể ngăn ngừa nguy cơ bị ung thư phổi lần hai.
Các nhà nghiên cứu vẫn tiếp tục tìm hiểu những nguyên nhân gây ra bệnh ung
thư phổi và tìm kiếm những cách thức để phồng chống căn bệnh này. Chúng ta
đã biết, cách tốt nhất để phòng chống bệnh ung thư phổi là bỏ hút thuốc lá, càng
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
9
9
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
bỏ hút thuốc lá sớm thì càng tốt. Thậm chí, nếu bạn đã hút thuốc lá trong một
thời gian dài thì việc bỏ hút thuốc lá cũng vẫn không bao giờ là quá muộn.
1.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1
1.2.1. Kháng nguyên
1.2.1.1. Định nghĩa
Kháng nguyên được định nghĩa là một chất tương tác với các phân tử kháng thể
và thụ thể kháng nguyên trên các tế bào lympho. Một chất gây miễn dịch là một
kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản
ứng miễn dịch thích ứng. Để đơn giản hóa, kháng nguyên và chất gây miễn dịch
đều được xem là kháng nguyên.[2,3]
1.2.1.2. Bản chất hóa học của kháng nguyên
Về bản chất hóa học, kháng nguyên là những phân tử protein có khối lượng phân
tử lớn (kể cả các protein cộng hợp như các glycoprotein, lipoprotein và
nucleoprotein) và các polysaccharide (kể cả lipopolysaccharide). Các kháng
nguyên protein và polysaccharide này được tìm thấy trên bề mặt của virus, tế
bào vi khuẩn, nấm, đơn bào và tế bào người.[3]
1.2.1.3. Nguồn gốc kháng nguyên
1.2.1.3.1. Kháng nguyên ngoại sinh
Kháng nguyên ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài do:
được gọi là kháng nguyên đặc hiệu khối u và thường là kết quả của một đột biến
đặc hiệu cho khối u. Phổ biến hơn, các kháng nguyên này được trình diện ở tế
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
11
11
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
bào khối u lẫn tế bào thường, khi đó chúng được gọi là kháng nguyên liên hệ
khối u. Nếu lympho bào T độc bào nhận ra kháng nguyên này, chúng có thể tiêu
diệt tế bào khối u trước khi tế bào khối u tăng sinh và di căn.
Kháng nguyên khối u cũng có thể có trên bề mặt khối u ở dạng thụ thể bị đột
biến. Trong trường hợp này chúng bị nhận diện bởi tế bào B.
1.2.1.5. Các loại kháng nguyên
-Miễn dịch nguyên: kháng nguyên loại này kích thích đáp ứng miễn dịch khi
được đưa vào trong cơ thể. Miễn dịch luôn luôn là một đại phân tử (protein,
polysaccharide). Khả năng kích thích đáp ứng miễn dịch của nó phụ thuộc vào
tính lạ đối với vật chủ, kích thước phân tử, thành phần hoá học và tính không
đồng nhất (vd: phân tử protein chứa nhiều loại amino axit khác nhau).
-Dung nạp nguyên: kháng nguyên loại này kích thích tình trạng không đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu do hình dạng phân tử của nó. Khi thay đổi hình dạng, nó
có thể trở thành miễn dịch nguyên.
-Dị ứng nguyên: đây là chất gây phản ứng dị ứng. Chúng có thể xâm nhập
vào cơ thể qua nhiều con đường như: ăn, hít, tiêm hoặc tiếp xúc với da.
Tế bào trình diện với kháng nguyên của chúng qua phân tử phù hợp mô. Các tế
bào miễn dịch khác nhau có thể được hoạt hoá tuỳ thuộc vào kháng nguyên được
trình diện và loại phân tử phù hợp mô.
1.2.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1
Trên thế giới hiện nay có khá nhiều chỉ thị sinh học liên quan đến ung thư phổi,
trong đó các nhà khoa học đang rất quan tâm đến một chỉ thị mới, có độ nhạy
cao với ung thư phổi là Cyfra 21-1 nằm trong nhóm chỉ thị Cytokeratin, một cấu
trúc trong bộ khung tế bào.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
13
13
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Cytookeratin 9-20 tạo thành nhóm I (40-56 kDa, các protein axit), trong đó các
Cytokeratin 8, 18, 19 có nhiều nhất ở các tế bào biểu mô đơn giản.
Các Cytokeratin khi giải phóng khỏi các tế bào đang tăng sinh hoặc chết theo
chương trình, tạo ra các chỉ thị hữu ích cho khối u biểu mô ác tính, phản ánh rõ
nét hoạt động của tế bào. Những chỉ thị này xuất hiện đặc trưng cho các
Cytokeratin nhất định và sự giải phóng tiểu đơn vị của chúng diễn ra liên quan
đến apoptosis.[9,11,13,14]
1.2.2.1.1. Cấu trúc chung của một Cytokeratin
Một Cytokkeratin điển hình bao gồn 3 vùng: vùng đầu N (không xoắn), vùng
trung tâm (chủ yếu có cấu trúc xoắn) và đầu C (không xoắn).
Phần xoắn ở vùng trung tâm (chủ yếu là cấu trúc xoắn alpha) gồm 300-320 axit
amin có tính bảo tồn về trình tự và được chia thành 4 vùng khác nhau: 1A, 1B,
2A và 2B. Thành phần axit amin của cá vùng xoắn được bảo toàn về kích thước
và chứa các trình tự axit amin lặp lại ở phần dư. Các đoạn xoắn tách biệt nhau
nhờ các vùng liên kết ngắn hơn là L1, L1-2 và L2.[9,11,13,14,15]
1.2.2.1.2. Biểu hiện của Cytokeratin
Cytokeratin biểu hiện khác nhau ở các dạng tế bào biểu mô, ở quy mô phát triển
và quá trình biệt hóa của các mô. Trong suốt quá trình biến đổi của tế bào từ bình
thường thành tế bào ác tính, đặc tính của Cytokeratin thường được duy trì. Ưu
điểm này làm cytokeratin được ứng dụng như các chỉ thị khối u. Những biến đổi
sau khi dịch mã của các vùng ở trung tâm rất hiếm thấy, nhưng những biến đổi
này xuất hiện khá nhiều ở vùng đầu N và C, bao gồm sự phosphoryl hóa,
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
14
14
Hình 2: Cấu tạo của Cytokeratin
Kháng thể là một sản phẩm đặc hiệu được hệ miễn dịch tổng hợp giúp cơ
thể tấn công các tác nhân gây bệnh. Kháng thể là các Immunoglobiulin (có bản
chất glycoprotein), do các tế bào Lympho B, các tương bào (biệt hoá từ Lympho
B) tổng hợp và tiết ra giúp hệ miễn dịch nhận biết và vô hiệu hoá các tác nhân lạ.
(Vd: các vi khuẩn hoặc virut).[3]
1.3.2. Cấu tạo
Các kháng thể có cấu trúc hình chữ Y, có hai bộ “cành” gắn vào một “thân”.
Các đầu của Y (Fab) được gọi là các vùng biến đổi, ở phía đầu các cành chứa các
vùng gắn kết kháng nguyên (vùng quyết định bổ trợ, CDR) và thân (Fc) là một
vùng hằng định. Các vùng hằng định chứa “lẫy khởi động” chức năng phản ứng
lại kích thích bằng việc gắn kết các phức hệ của tế bào khác của hệ miễn dịch.
Kháng thể thực hiện các chức năng cơ bản như liên kết đặc hiệu với kháng
nguyên, hoạt hoá các bổ thể, hoạt hoá các tế bào miễn dịch.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
16
16
Hình 4: Cấu tạo của kháng thể
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
1.3.3. Phân loại kháng thể
1.3.3.1. Kháng thể đa dòng
Là một tập hợp các kháng thể đặc hiệu với các epitope khác nhau trên một
kháng nguyên cho trước. Trong đáp ứng miễn dịch, cơ thể tổng hợp nhiều kháng
thể tương ứng với các epitope của cùng một kháng nguyên. Đáp ứng như vậy gọi
là đa dòng. Các kháng thể đa dòng, mỗi kháng thể liên kết với một epitope khác
nhau
1.3.3.2. Kháng thể đơn dòng
Là những kháng thể được tổng hợp từ một dòng tế bào Lympho B. Chúng chỉ
nhận biết một epitope đặc hiệu trên một kháng nguyên cho sẵn.[3]
Để tăng hiệu quả điều trị của các kháng thể đơn dòng, các nhà khoa học đã
kết hợp các gene tái tổ hợp mã hoá các kháng thể đơn dòng có vùng gắn kết với
Hình 5: Cấu tạo của kháng thể và kháng thể đơn chuỗi
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Chúng dễ dàng được sản xuất với số lượng lớn và giá thành.
- Kích thướng nhỏ của chúng cho phép chúng dễ dàng xâm nhập vào mô và khối
u rắn, có tính hướng đích cao.
- Kháng thể đơn chuỗi dễ dàng được dung hợp với một protein khác như enzym
hap protein phát huỳnh quang để tạo thành phân tử hoàn chỉnh dùng cho những
thử nghiệm miễn dịch.
1.4 Phương pháp Real-time PCR
1.4.1. Kỹ thuật PCR
1.4.1.1. Định nghĩa
PCR là tên gọi tắt của phản ứng chuỗi polymedase (Polymedase Chain Reaction =
PCR) để nhân các bản của đoạn DNA trong ống nghiệm.
1.4.1. 2. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi polymedase (PCR) được Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên và đã
góp phần đem lại cho Mullis giải thưởng Nobel y học và sinh lý năm 1993. PCR
là quá trình tương đối đơn giản cho phép nhân nhanh 1 số lượng không hạn chế
nguyên bản 1 đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn. Quá trình
nhân bản bằng Enzyme này bao gồm 3 bước lặp lại nhiều lần.
- Bước 1: Biến tính DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng cách nâng cao
nhiệt độ lên 94-95
o
C trong khoảng thời gian ngắn.
- Bước 2: Tiếp hợp đoạn mồi (primer) thông qua hạ nhiệt độ xuống 40-60
o
C. Hai
đoạn mối là các oligonucletid dài khoảng 18-24 bazo sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc
bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.
- Bước 3: Phản ứng polymedase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai
phản ứng DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử
: threshold cycle) tương quan chặt chẽ với hàm lượng DNA
đích ban đầu. Người ta thường sử dụng 3 dạng đầu dò để định lượng DNA bằng
Real-time PCR:
- Các chất liên kết DNA như: SYBA Green…
- Các đầu dò thủy phân như: TaqMan, Beacons, Scorpions….
-Các loại đầu dò lai như: Light Cycler…
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
20
20
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Chu kỳ ngưỡng: là chu kỳ mà tại đó phần mềm máy tính bắt đầu đọc được
ΔRn, deltaRn là tham sử dụng trong định lượng. Giá trị C
T
là 40 hay hơn 40 có
nghĩa là không diễn ra sự khuếch đại và không thể tính toán được lượng sản
phẩm.[6]
1.4.2.2. Cơ chế hoạt động của Real-time PCR
Số chu kỳ PCR và tín hiệu huỳnh quang từ phản ứng tỷ lệ với lượng sản
phẩm khuếch đại trong ống.
Sự khuếch đại thể hiện qua 2 giai đoạn: giai đoạn một theo hàm mũ và giai đoạn
hai bão hoà không theo hàm mũ.
-Trong giai đoạn một, lượng sản phẩm PCR gần như được gấp đôi sau mỗi
chu kỳ. Khi phản ứng tiếp diễn, các thành phần phản ứng được sử dụng.
- Trong giai đoạn hai, một hay nhiều thành phần đã trở nên cạn kiệt, phản ứng
bắt đầu chậm lại và bước vào giai đoạn bão hoà.[6]
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
21
21
Hình 6: Đồ thị khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền
huỳnh quang
- Kháng nguyên: Kháng nguyên Cyfra 21-1 (Phòng Công nghệ Tế bào Động
vật - Viện Công Nghệ Sinh Học - Viện Khoa học Việt Nam).
- Mẫu máu do bệnh viện Bạch Mai và bệnh viện Phổi Trung Ương cung cấp.
- Cặp mồi:
+ CyfprobF: 5'-GGC GGT AGT GCA CTT GAG A-3'
+ CyfprobR: 5'-AAG GGT GAC AGG TGA GGA GA-3'
+ Probe N
o
115: GA CCC AGA
2.1.2. Hoá chất
Kháng sinh (Ampicilin, Kanamycine), cao nấm men, Tryptone, Agar,
Agarose, NaCl, TAE, PBS, TMB, H
2
SO
4
, PEG, ……
2.1.3. Trang thiết bị
- Máy ly tâm lạnh (Eppendorf, CHLB Đức).
- Máy Real-time PCR (Roche).
- Máy đo nồng độ Nanodrop.
- Máy đo ELISA.
- Máy xác định trình tự ABI PRISM 3100-Avant Genetic Analyzer (ABI,
Mỹ).
- Máy lắc ổn nhiệt; Bể ổn nhiệt; Tủ lạnh (4
o
. -20
o
. -80
o
).
- Sau đó bổ sung tiếp vào môi trường 50μ phagemid;
- Nuôi lắc trong 2 giờ ở 37
o
C (đến khi OD
600
= o,5);
- Cho hyper phage vào với mật độ 1 vi khuẩn/20 hyper phage;
- Ủ trong nước 30 phút cở 37
o
C (không lắc);
- Ly tâm các tế bào nhiễm ở 3300g trong 10 phút;
- Loại bỏ dịch, thu phần cặn tế bào;
- Lấy 30 ml môi trường 2xTY, bổ sung 25μg/ml Kanamycine và 100μg/ml
Ampicilin;
- Hòa lại cặn tế bào thu được ở trên vào trong môi trường;
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
24
24
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Nuôi lắc qua đêm ở 30
o
C;
- Ly tâm dịch nuôi cấy qua đêm ở 10800g trong 10 phút;
- Thu dịch nổi chứa phage;
- Kết tủa các hạt phage bằng cách cho thêm 1/5 thể tích PEG/NaCl;
- Để ở 4
o
C trong ít nhất 1 giờ;
- Sau đó, ly tâm 10800g trong 30 phút;
- Loại bỏ dịch sau ly tâm, thu phần cặn;
C trong bể ổn nhiệt;
- Lấy 100μl dịch cấy trải trên đĩa thạch, để qua đêm trong tủ 37
o
C;
- Đếm số khuẩn lạc trên các đĩa thạch;
Nồng độ phage= (a/b).(c/d)/m
Trong đó: a: số khuẩn lạc có trên đĩa thạch
b: thể tích dung dịch dùng để trải đĩa
c: thể tích dịch nuôi
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
25
25
Copyright: Tài liệu đại học ©