Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Mở đầu
Theo thống kê của Tổ chức Nghiên cứu ung thư Thế giới (International
Agency for Research on Cancer_ IARC), ung thư phổi là nguyên nhân gây tử
vong hàng đầu trong số các bệnh về ung thư. Tổng số người chết vì ung thư phổi
hàng năm cao hơn tổng số người chết vì ung thư vú, ung thư ruột và ung thư
tuyến giáp, và đứng thứ hai trong tổng số tử vong vì bệnh sau các bệnh về tim
mạch. Các thống kê từ hiệp hội Ung thư quốc gia của Việt Nam cũng đưa ra
những cảnh báo tương tự, số bệnh nhân ung thư phổi gia tăng liên tục trong
những năm gần đây. Phần lớn bệnh nhân ung thư khi được phát hiện đã ở giai
đoạn cuối không chữa trị được, đa số bệnh nhân bị tử vong. Vì rất nhiều lí do
như: hút thuốc lá, môi trường sống bị ô nhiễm, thực phẩm không an toàn…..nên
căn bệnh nguy hiểm này ngày càng trở nên phổ biến. Mặc dù đây là một căn
bệnh rất nguy hiểm nhưng nếu bệnh nhân được phát hiện sớm và được điều trị
theo những phác đồ thích hợp thì người bệnh vẫn có cơ hội được cứu sống, thậm
chí là khỏi bệnh. Ngoài những phương pháp chẩn đoán ung thư truyền thống
như: chụp hình phổi bằng X_quang, chụp CT Scan phổi….các nhà khoa học
đang nỗ lực nghiên cứu nhằm tìm ra cách chẩn đoán nhanh và chính xác bệnh
ung thư. Sự phát triển như vũ bão của ngành sinh học phân tử đã mở ra một
hướng mới trong nghiên cứu Sinh_Y_Dược học. Việc tìm ra những chỉ thị sinh
học đã giúp cho các bác sĩ chẩn đoán và phát hiện bệnh một cách nhanh chóng,
có độ chính xác cao hơn. Các chỉ thị sinh học có liên quan đến chẩn đoán bệnh
ung thư cũng đang được quan tâm. Trong đo, Cyfra21-1 là một chỉ thị có độ
nhạy tương đối cao đối với ung thư phổi và đang được nghiên cứu.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
1
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Do đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Định lượng kháng nguyên
Cyfra 21-1 bằng kỹ thuật Real-time PCR”. Để từ đó nghiên cứu và tạo ra một bộ
Kít định lượng để có thể chẩn đoán Ung thư phổi một cách nhanh chóng, có độ
chính xác cao.

thường gặp hơn ung thư phổi tế bào nhỏ. Nó thường phát triển và lan chậm hơn
ung thư phổi tế bào nhỏ. Có ba loại ung thư phổi không phải tế bào nhỏ chủ yếu,
chúng được đặt tên theo loại tế bào mà từ đó ung thư phát triển.[3]
+ Ung thư tế bào tuyến (adenocarcinoma, AC): xuất phát từ tế bào tuyến nhầy
trong thành phế quản, chiếm tỷ lệ khoảng 30-45% trong các loại ung thư phổi.
Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở phụ nữ và những người không hút
thuốc.[3]
+ Ung thư tế bào sừng (squamous_cell carcinoma; SCC): hay xuất hiện ở phế
quản lớn và làm chít hẹp lòng phế quản.Đây là loại ung thư phổi phổ biến nhất ở
nam giới, chiếm tỷ lệ khoảng 30-35% trong các loại ung thư phổi.[3]
+ Ung thư tế bào lớn (large_cell carcinoma; LCC): hình thành gần bề mặt
phổi, chiếm tỷ lệ khoảng 10-15% trong các loại ung thư phổi.[3]
1.1.3. Triệu chứng của bệnh ung thư phổi
Những người mắc bệnh ung thư phổi thường có các triệu chứng sau:
- Ho không khỏi và ngày càng nặng hơn.
- Thường xuyên thấy đau ngực.
- Ho ra máu.
- Khó thở, ngạt mũi, khản giọng.
- Phù nề vùng mặt và cổ.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
4
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
- Mệt mỏi.
- Mất cảm giác ngon miệng, sút cân.
- Thường xuyên bị viêm phổi và viêm phế quản.
1.1.4. Chẩn đoán bệnh ung thư phổi
Khi người bệnh bị nghi ngờ mắc ung thư phổi, các bác sĩ sẽ xem xét tiền sử
người bệnh, tiền sử hút thuốc, tiếp xúc với các chất ở môi trường tự nhiên và môi
trường lao động, các yếu tố di truyền…..Sau đó, các bác sĩ có thể cho chụp
X_Quang lồng ngực, xét nghiệm tế bào trong đờm (quan sát dưới kính hiển vi

Radon là một chất khí phóng xạ không màu, không mùi và không nhìn thấy bằng
mắt thường. Trong tự nhiên radon có trong sỏi đá. Nó có thể làm tổn hại tới phổi
và từ đó có thể dẫn đến ung thư phổi. Những người làm việc trong hầm mỏ có
thể tiếp xúc với khí radon. Ở một số vùng ở Mỹ, người ta còn tìm thấy khí radon
ở trong những ngôi nhà.
1.1.5.3. Amiang
Amiang là tên gọi của một nhóm các chất khoáng, chúng tồn tại trong tự nhiên
dưới dạng sợi và được sử dụng trong một số nghành công nghiệp. Amiang có hai
nhóm chính là nhóm amphibole và nhóm serpentine. Nhóm amphibole khi hấp
thụ qua đường hô hấp và lưu lại trong phổi sẽ rất khó bị đào thải ra ngoài. Các
sợi thuộc nhóm amphibole là nguyên nhân chính gây ra các bệnh ung thư phổi, u
trung biểu mô.
1.1.5.4. Nghề nghiệp
Các thống kê bệnh học cho thấy, chất phóng xạ đóng vai trò quan trọng trong
phát sinh bệnh ung thư. Những người thường xuyên tiếp xúc với các chất phóng
xạ, niken, cromat, amian và các chất sinh ra do chưng cất hắc ín thường dễ bị
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
6
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
ung thư. Các chất này cũng là nguyên nhân dẫn đến Ung thư phổi ở những người
không hút thuốc (chiếm khoảng 15-20%).
Nghiên cứu của Doll (1958) cho thấy: công nhân làm việc trong công nghiệp
niken bị chết do Ung thư phổi là 26%, cao hơn 9 lần so với những công nhân làm
việc trong các ngành công nghiệp khác.
1.1.5.5. Môi trường
Các nhà nghiên cứu đã tìm ra mối liên kết giữa bệnh ung thư phổi và sự phơi
nhiễm với một số chất gây ô nhiễm môi trường không khí nhất định (ví dụ: các
sản phẩm phụ sinh ra trong quá trình đốt dầu Diezen và những nguyên liệu hóa
thạch). Tuy nhiên, mối quan hệ này vẫn chưa được xác định một cách rõ ràng và
vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu.

kháng nguyên được cơ thể nhận biết như một chất ngoại lai và kích thích phản
ứng miễn dịch thích ứng. Để đơn giản hóa, kháng nguyên và chất gây miễn dịch
đều được xem là kháng nguyên.[2,3]
1.2.1.2. Bản chất hóa học của kháng nguyên
Về bản chất hóa học, kháng nguyên là những phân tử protein có khối lượng phân
tử lớn (kể cả các protein cộng hợp như các glycoprotein, lipoprotein và
nucleoprotein) và các polysaccharide (kể cả lipopolysaccharide). Các kháng
nguyên protein và polysaccharide này được tìm thấy trên bề mặt của virus, tế
bào vi khuẩn, nấm, đơn bào và tế bào người.[3]
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
8
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
1.2.1.3. Nguồn gốc kháng nguyên
1.2.1.3.1. Kháng nguyên ngoại sinh
Kháng nguyên ngoại sinh là kháng nguyên xâm nhập vào cơ thể từ bên ngoài do:
hít, ăn, tiêm. Bằng quá trình nhập nội bào hoặc thực bào, các kháng nguyên này
được đưa vào tế bào trình diện kháng nguyên (ACP) và được xử lí thành các
mảnh nhỏ. Sau đó các ACP trình diện các mảnh nhỏ này cho tế bào Lympho T
giúp đỡ (CD4+) bằng cách dung phân tử phù hợp mô loại II trên bề mặt của
chúng. Một số tế bào Lympho T đặc hiệu cho phức hợp peptide: MHC. Chúng
trở nên hoạt hoá và bắt đầu tiết Cytokine. Cytokine là các chất có khả năng hoạt
hoá Lympho bào T độc tế bào (CLL), tế bào Lympho B tạo kháng thể, đại thực
bào và các tế bào khác.
1.2.1.3.2. Kháng nguyên nội sinh
Kháng nguyên nội sinh là các kháng nguyên được sản xuất bên trong tế bào, là
kết quả của quá trình chuyển hoá tế bào bình thường, hoặc do nhiễm khuẩn nội
bào hay nhiễm virus. Sau đó các mảnh kháng nguyên được trình diện trên bề mặt
tế bào trong phức hợp phân tử phù hợp mô loại I. Nếu tế bào Lympho T CD8+
độc tế bào nhận ra chúng, các tế bào Llympho T này bắt đầu tiết các loại độc tố
khác nhau gây ly giải hoặc chết theo chương trình (apoptosis) tế bào bị nhiễm.

-Dị ứng nguyên: đây là chất gây phản ứng dị ứng. Chúng có thể xâm nhập
vào cơ thể qua nhiều con đường như: ăn, hít, tiêm hoặc tiếp xúc với da.
Tế bào trình diện với kháng nguyên của chúng qua phân tử phù hợp mô. Các tế
bào miễn dịch khác nhau có thể được hoạt hoá tuỳ thuộc vào kháng nguyên được
trình diện và loại phân tử phù hợp mô.
1.2.2. Kháng nguyên Cyfra 21-1
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
10
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Trên thế giới hiện nay có khá nhiều chỉ thị sinh học liên quan đến ung thư phổi,
trong đó các nhà khoa học đang rất quan tâm đến một chỉ thị mới, có độ nhạy
cao với ung thư phổi là Cyfra 21-1 nằm trong nhóm chỉ thị Cytokeratin, một cấu
trúc trong bộ khung tế bào.
1.2.2.1. Cytokeratin
Cytokeratin thuộc họ sợi trung gian, đặc biệt hữu ích trong chẩn đoán bất thường
ở tế bào, chẳng hạn như ung thư. Bởi vậy, các nhà ung thư học hiện nay đang
tích cực nghiên cứu kỹ hơn về cấu trúc và vai trò của Cytokeratin, nhằm tìm ra
giải pháp chống lại sự hoành hành của căn bệnh toàn cầu – Căn bệnh ung thư.
Cấu trúc sợi đã được quan sát trong nhân và tế bào chất từ rất lâu. Nhưng chỉ
ngần đây, những kiến thức về chức năng thực sự của bộ khung tế bào mới được
tìm hiệu cặn kẽ và chi tiết. Ở tế bào nhân chuẩn, bộ khung tế bào được tạo thành
từ 3 loại cấu trúc sợi, khác nhau về hình thái: vi sợi (microfilament), sợi trung
gian (intermidiatefilament) và vi ống (microtubules). Bộ khung xương tế bào
hợp nhất được hình thành từ hệ thống 3 loại sợi là yếu tố then chốt trong một quá
trình như phân bào, vận động và tương tác tế bào với tế bào.
Trong cấu trúc sợi, họ protein sợi trung gian là phức tạp nhất, bao gồm vài trăm
thành viên khác nhau. Dựa trên những đặc điểm như sự tương đồng về trình tự
và cách biểu hiện, người ta phân loại chúng thành một vài nhóm. Sợi trung gian
nhóm I và II tạo thành Cytokeratine (theo thứ tự là các protein axit và bazo),
trong khi đó sợi trung gian nhóm III gồm các protein axit dạng sợi desmin,

Hình 2: Cấu tạo của Cytokeratin
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Cytokeratin biểu hiện khác nhau ở các dạng tế bào biểu mô, ở quy mô phát triển
và quá trình biệt hóa của các mô. Trong suốt quá trình biến đổi của tế bào từ bình
thường thành tế bào ác tính, đặc tính của Cytokeratin thường được duy trì. Ưu
điểm này làm cytokeratin được ứng dụng như các chỉ thị khối u. Những biến đổi
sau khi dịch mã của các vùng ở trung tâm rất hiếm thấy, nhưng những biến đổi
này xuất hiện khá nhiều ở vùng đầu N và C, bao gồm sự phosphoryl hóa,
glycosyl hóa và sự vận chuyển glutamine hóa. Những biến đổi này làm tăng tính
tan và gây ra sự sắp xếp lại các sợi.
Trong bộ khung, Cytokeratin là điển hình cho tính tan rất thấp, nhưng khi lưu
thông người ta nhận thấy rằng các Cytokeratin đều bắt nguồn từ các sợi protein
nguyên vẹn bị biến tính một phần tạo thành các phức hệ nhỏ hoặc các polymer
protein lớn. Các phân tử Cytokeratin nguyên vẹn không tham gia trong lưu
thông. Thời gian bán hủy của sợi Cytokeratin trong lưu thông khoảng 10-15h,
phụ thuộc vào kích thước sợi. Quá trình giải phóng sợi Cytokeratin tan vào lưu
thông diễn ra rất phức tạp và chưa được làm sáng tỏ hoàn toàn.
Trong lúc giải phóng tự khối u, có thể nhận ra Cytokeratin với một lượng lớn
trong dịch thể gồm: máu, nước tiểu, dịch tế bào và dịch màng phổi. Thông
thường trong các cá thể khỏe, nông độ Cytokeratin lưu thông rất thấp. Nồng độ
tăng một cách đặc biệt trong những người bệnh có bệnh Ung thư biểu mô.[10]
1.2.2.2. Cyfra 21-1
Cyfra 21-1 là một phân đoạn của cytokeratin 19 (đặt tên theo chữ viết tắt của
cytokeratin fragment) tiết ra mạnh khi tế bào biểu mô phổi tăng sinh bất thường.
Cytokeratin 19 có cấu trúc giống các cytokeratin khác với kích thước khoảng 40
kDa, gồm 400 axit amin. Gene mã hóa cho cytokeratin 19 nằm trên nhiễm sắc
thể 17 có kích thước 4667bp với 6 exon mã hóa cho mARN kích thước 1382bp.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
13
Hình 3: Sơ đồ gene mã hóa cho Cytokeratin 19

Là những kháng thể được tổng hợp từ một dòng tế bào Lympho B. Chúng chỉ
nhận biết một epitope đặc hiệu trên một kháng nguyên cho sẵn.[3]
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH
15
Hình 4: Cấu tạo của kháng thể
Đinh Thị Thu Hằng Lớp KSCNSH 06_01
Để tăng hiệu quả điều trị của các kháng thể đơn dòng, các nhà khoa học đã
kết hợp các gene tái tổ hợp mã hoá các kháng thể đơn dòng có vùng gắn kết với
cùng một vị trí (một epitope) của kháng nguyên. Các kháng nguyên đơn dòng có
thể là:
- Kháng thể đơn dòng chuột
- Kháng thể đơn dòng khỉ
- Kháng thể đơn dòng gà
- Kháng thể đơn dòng người
1.3.3.3. Phương pháp sản xuất kháng thể đơn dòng
- Kỹ thuật hybridoma
- Tạo mảnh kháng thể đơn dòng bằng kỹ thuật gene
- Kỹ thuật phage display (được dùng để tạo kháng thể đơn dòng dạng đơn
chuỗi_scFv).
1.3.3.4. Kháng thể đơn chuỗi (scFv)
Cùng với sự phát triển của công nghệ sản xuất kháng thể, các mảnh kháng
thể được tạo ra bằng kỹ thuật sinh học đã đạt được những tiến bộ đáng kể. Kháng
thể đơn chuỗi (scFv) là một trong những kháng thể phổ biến nhất.
Kháng thể đơn chuỗi bao gồm vùng biến đổi của chuỗi nặng và chuỗi nhẹ (V
L
và V
H
) của phân tử kháng thể hoàn chỉnh được nối với nhau bằng linker
polypeptide linh động.
Viện Đại học Mở Hà Nội Khoa CNSH

o
C. Hai
đoạn mối là các oligonucletid dài khoảng 18-24 bazo sẽ tiếp hợp theo nguyên tắc
bổ sung với đoạn DNA tương đồng ở hai đầu của đoạn DNA cần nhân.
- Bước 3: Phản ứng polymedase tổng hợp phân tử DNA kéo dài từ đoạn mồi. Hai
phản ứng DNA mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu phân tử
ban đầu.
Để tránh hiện tượng tiếp hợp không đặc thù, phản ứng tổng hợp được thực hiện ở
72
o
C
Loại polymedase thường dùng trong PCR là loại chịu nhiệt (Taq DNA
polymedase) được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus hoặc chủ yếu là
enzyme tái tổ hợp.
Như vậy, mỗi vòng phản ứng sẽ có 2 lần số lượng DNA của đoạn DNA cần nhân
được tổng hợp, hệ số nhân bản tính theo số chu kỳ n là 2
n
.[6]
Vd: Sau 20 chu kỳ có tới trên 30 triệu bản của 1 đoạn DNA được nhân lên.
1.4.2. Kỹ thuật Real-time PCR
1.4.2.1. Nguyên lý
Real-time PCR là PCR tại thời điểm thực, nghĩa là quá trình khuếch đại DNA
đang diển ra theo từng chu kỳ nhiệt được theo dõi trực tiếp. Real-time PCR gồm
hai quá trình diễn ra đồng thời:
- Quá trình khuếch đại DNA bằng PCR
- Đo độ phát quang tỷ lệ thuận với số lượng phân đoạn DNA tạo thành.
Hệ thống Real-time PCR bao gồm máy chu trình nhiệt (PCR) được nối với
máy phát hiện quang phổ huỳnh quang và máy vi tính. Nguyên lý chủ yếu của
Real-time PCR là dựa trên cơ sở phát hiện và định lượng thể thông báo huỳnh
quang (fluorescent reporter). Hàm lượng sản phẩm PCR bắt đầu tăng lên cao từ