Trung Tâm Kiểm nghiệm VSATTP khu vực phía Nam
Labo Vi sinh thực phẩm

NOROVIRUS VÀ
PHÁT HIỆN
NOROVIRUS BẰNG
KỸ THUẬT
REALTIME-PCR

TS.NGUYỄN ĐỖ PHÚC
Phó giám đốc Trung tâm Kiểm nghiệm ATVSTP KV phía nam-
Viện Vệ sinh-Y tế công cộng Tp.HCM
TS.BS. PHẠM HÙNG VÂN
Trưởng đơn vị Gene -TT Phòng chống chấn thương
và các bệnh không lây-Viện VS-YTCC Tp.HCM
Giảng viên trường đại học Y dược TP.Hồ Chí Minh Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011

Bệnh tiêu chảy do

TÀI LIỆU THAM
KHẢO
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT 2
TỔNG QUAN 1
1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV) 1
2. Ph}n loại, hình th{i học v| tổ chức bộ gen 1
3. Sự l}y truyền, đặc điểm l}m s|ng v| ph{t sinh bệnh 3
4. Chẩn đo{n 5
5. C{c kỹ thuật sinh học ph}n tử 7
5.1 Phương pháp RT-PCR 7
5.2 Real – time PCR 7
5.3 Tạo dòng 8
QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ 8
1. PHẠM VI ÁP DỤNG 9
2. TÀI LIỆU ÁP DỤNG 9
3. NGUYÊN TẮC 9
4. DỤNG CỤ- THIẾT BỊ 9
4.1 Dụng cụ 9
4.2 Thiết bị 9
5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT 10
5.1 Bộ hóa chất t{ch chiết RNA to|n phần
NK
RNAPREP 10
5.2 Bộ hóa chất dùng tổng hợp cDNA NK 10
5.3 Bộ hóa chất dùng điện di 11
5.4 C{c th|nh phần bộ kít Real Time PCR 11
5.5 Bộ kít Real Time PCR 12

1

TỔNG QUAN
1. Bệnh tiêu chảy do nhiễm Norovirus (NoV)
C{c bệnh về tiêu chảy l| nguyên nh}n chính của dịch bệnh v| tử vong ở trẻ
em tại c{c nước đã v| đang ph{t triển
[44,27]
. Điều đó được chứng minh ở Ch}u
Phi, Ch}u Á v| Mỹ Latinh đã có 744 triệu đến 1 tỷ trường hợp viêm dạ d|y
cấp v| 2,4 đến 3,3 triệu trường hợp tử vong h|ng năm ở trẻ em dưới 5 tuổi
[27,36]
. Mặc dù, c{c b{o c{o cho thấy có ít nhất 25 loại vi sinh vật v| động vật
nguyên sinh có thể g}y ra bệnh tiêu chảy ở trẻ em, trong đó hơn 75% của c{c
trường hợp nguyên nh}n l| do c{c virus, v| 7 nhóm virus thường g}y tiêu
chảy l| Rotavirus, Norovirus, Sapovirus, Adenovirus, Astrovirus,
Parechovirus, v| Aichivirus được coi l| c{c t{c nh}n chính v| phổ biến của
bệnh viêm dạ d|y ruột cấp ở người
[44,28,29]
.
Noroviruses (NoVs) được ph{t hiện lần đầu
tiên bởi Kapikian v| cộng sự v|o năm 1972
[11]
dưới kính hiển vi điện tử (EM). Trước
đ}y, c{c virus được kí hiệu l| “Norwalk-like
viruses”. Chủng nguyên thủy của NoV l|
virus Norwalk, chúng được ph{t hiện từ
một đợt bùng ph{t viêm dạ d|y ruột cấp
tính tại một trường tiểu học ở Norwalk,
Ohio năm 1968
[11]

tả đặc điểm NoV đã n}ng cao thêm sự hiểu biết của chúng ta về dịch tễ học
của sự l}y nhiễm NoV
[42]
. Những kỹ thuật n|y đã chứng minh rằng c{c virus
NoV có tính di truyền v| đa dạng về kh{ng nguyên
[43]
. Dựa v|o trình tự giống
nhau v| ph}n tích ph{t sinh chủng lo|i, NoVs có thể được ph}n loại theo
nhóm gen (genogroup), kiểu gen (genotype) v| cụm gen (genocluster). Hiện
nay, NoVs được ph}n loại th|nh năm nhóm gen kh{c nhau: GI đến GV
[6,30]
.
NoVs ở người thuộc GI, GII v| GIV, nhưng hầu hết c{c chủng g}y bệnh ở
người thuộc đều thuộc nhóm gen GI và GII. NoVs GIII v| GV cho đến nay đã
được tìm thấy ở lo|i bò v| c{c lo|i chuột. Trong c{c nhóm gen (genogroups),
NoVs được chia tiếp th|nh c{c kiểu gen (genotypes), trong số đó có ít nhất 29
kiểu gen đã được b{o c{o. Hiện nay nhóm gen GI được chia th|nh t{m kiểu
gen (GI/1 đến GI/8), GII bao gồm ít nhất 17 kiểu gen (GII/1 đến GII/17), GIII có
hai kiểu gen (GIII/1-GIII/2) v| mỗi GIV v| GV bao gồm một kiểu gen
[43]
.
C{c ph}n tích về trình tự to|n bộ chiều d|i bộ gen của NoV đã chỉ ra rằng c{c
chủng virus trong một nhóm gen thường có nhiều hơn 69% tương đồng về
nucleotide, trong khi c{c chủng trong c{c nhóm gen kh{c chỉ chiếm 51-56% sự
tương đồng. Ngo|i ra, sự ph}n loại dựa trên trình tự nucleotide của gen cho
protein vỏ capsid cho thấy rằng c{c trình tự chệch nhau bởi 60% giữa c{c
genogroups v| 20- 30% giữa c{c genotypes. Trong cùng genocluster, trình tự
vỏ capsid của virus thường rất giống nhau
[5]
. Bộ gen của NoV bao gồm mạch dương (positive-sense), 7.400-7.700 nucleotide
của sRNA. Bộ gen được chia th|nh 3 khung đọc mở (ORF1, ORF2, v| ORF3).
ORF1 mã hóa cho một polyprotein được t{ch ra từ enzym thủy ph}n protein,
tạo th|nh NTPase, protease, v| RNA polymerase phụ thuộc RNA (RdRp).
ORF2 chủ yếu mã hóa cho protein vỏ VP1, v| ORF3 mã hóa một protein VP2
cơ bản nhỏ chưa biết chức năng
[6]
.
3. Sự lây truyền, đặc điểm lâm sàng và phát sinh bệnh
C{c NoV thường l| nguyên nh}n phổ biến của c{c bệnh viêm dạ d|y ruột cấp
ở hầu hết c{c nhóm tuổi. Nhìn chung, c{c NoV GII l| chủng phổ biến nhất
được b{o c{o trong c{c vụ dịch trên to|n thế giới
[17]
. Sự lan truyền phổ biến l|
thông qua thức ăn, nước v| môi trường bị ô nhiễm, sự tiếp xúc giữa người với
người, trong không khí, v| có thể do một số phương thức kh{c chưa biết. C{c
NoV được tìm thấy trong mẫu ph}n v| mẫu nôn của một người bị nhiễm
bệnh.
Hình 1.3: Cấu trúc bộ gen NoV
Hình 1.2: Cấu trúc của NoV

. Điều trị chỉ
tập trung v|o chăm sóc hỗ trợ, đặc biệt l| ngăn ngừa v| điều trị mất nước.
Những người không thể duy trì sự chống mất nước, đặc biệt l| trẻ em v|
người cao tuổi, có nguy cơ mất nước rất cao, dẫn đến rối loạn sự điện giải v|
có thể phải nhập viện. C{c biến chứng từ nhiễm NoV có thể thường thấy ở trẻ
sơ sinh v| người cao tuổi. Tuy nhiên, dữ liệu mới cho thấy rằng c{c dấu hiệu
v| c{c biến chứng l}m s|ng bất thường từ sự l}y nhiễm NoV có thể xảy ra ở
những người suy giảm miễn dịch v| căng thẳng tinh thần
[14]
.
Do không có khả năng nuôi NoV ở người, nên hầu hết c{c dữ liệu về bệnh học
v| miễn dịch học đều thu được từ c{c cuộc nghiên cứu trên những người tình
nguyện. C{c nghiên cứu trên những người tình nguyện khỏe mạnh bị nhiễm
virus cho thấy sự nhiễm trùng chính thường xảy ra ở phần dưới của ruột non
với sự dãn nỡ của lông nhung v| sự co ngắn của vi lông nhung
[44]
. Những vết
viêm loét của niêm mạc ph{t triển sau đó, kết quả cuối cùng l| dẫn đến tiêu
chảy. Nhiễm trùng do NoV kích thích cơ thể sinh ra kh{ng thể IgG, IgA đặc
hiệu v| kh{ng thể IgM trong huyết thanh, ngay cả khi đã có sự phơi nhiễm
trước đó. Hầu hết c{c bệnh nh}n đều có sự đề kh{ng với sự t{i l}y nhiễm
trong khoảng 4 - 6 th{ng. Tuy nhiên, không có sự miễn dịch l}u d|i
[44]
.
Nghiên cứu ban đầu trong c{c nhóm tình nguyện đã chứng minh rằng khoảng
30% trường hợp nhiễm bệnh m| không có triệu chứng đi kèm v| có khoảng
50% dẫn đến bệnh
[33,45]
. Gần đ}y, nghiên cứu cho thấy rằng những người


trường nuôi cấy tế b|o, chẩn đo{n ban đầu viêm dạ d|y ruột liên quan đến sự
nhiễm NoV được dựa v|o quan s{t trực tiếp bằng c{ch sử dụng EM
[11]
. Vì kỹ
thuật n|y ph{t hiện một lượng virus > 10
6
/ml trong dịch huyền phù ph}n, nó
chỉ có thể th|nh công khi {p dụng trong giai đoạn sớm của bệnh
[38]
. Trong khi
c{c hạt virus n|y có thể được quan s{t trong mẫu lọc của ph}n tiêu chảy ở giai
đoạn rất sớm, quan s{t được tăng cường bằng kỹ thuật IEM với huyết thanh
miễn dịch thêm v|o. Trong kỹ thuật n|y, huyết thanh miễn dịch được sử dụng
để n}ng cao sự ph{t hiện virus bởi sự ngưng kết của c{c hạt virus trong dịch
huyền phù ph}n. Sự kết cụm virus xảy ra trong sự hiện diện của kh{ng thể
đặc hiệu có thể ph{t hiện v| cải thiện khả năng chẩn đo{n đặc hiệu. Tuy
nhiên, kỹ thuật n|y chỉ được sử dụng cho c{c mẫu ph}n thu nhận trong giai
đoạn đầu của bệnh
[19]
.
Thử nghiệm ngưng kết hồng cầu miễn dịch (IAHA) v| RIA đang được ph{t
triển. IAHA l| thử nghiệm để đ{nh gi{ nồng độ kh{ng thể NoV trong một
lượng lớn huyết thanh vì thế c{c nghiên cứu dịch tễ học về huyết thanh có thể

6

được thực hiện bằng thử nghiệm n|y
[12]
. Những hạt virus được l|m sạch từ
mẫu ph}n có thể được dùng như một kh{ng nguyên, v| tương t{c của phức

hiện hình th{i v| kh{ng nguyên giống với c{c hạt virus nguyên thể. C{c VLPs
rất hữu ích cho việc tạo miễn dịch của nhiều lo|i động vật kh{c nhau (chuột,
chuột lang, v| thỏ) để sản xuất sản phẩm huyết thanh miễn dịch đa v| đơn
dòng v| sau đó có thể được sử dụng để thiết lập c{c thử nghiệm chẩn đo{n cơ
bản EIA như thử nghiệm ELISA v| thử nghiệm IC
[37]
. Một số bộ kít ELISA
dùng để ph{t hiện NoV trong c{c mẫu ph}n đã được ph{t triển v| thương mại
hóa. Mặc dù c{c mẫu ph}n có thể được thử nghiệm trực tiếp bằng những bộ
kít ELISA m| không cần bước tinh chế v| cô đặc qu{ phức tạp, độ nhạy của
phương ph{p ELISA thì thấp hơn nhiều so với phương ph{p RT-PCR
[3,2,16]
. Độ
nhạy thấp l| hạn chế của phương ph{p ELISA, điều đó l|m cho nó không phù
hợp cho việc ph{t hiện trực tiếp NoV trong c{c mẫu ph}n, mẫu hải sản m|
không có sự cải thiện độ nhạy. Gần đ}y, thử nghiệm ph{t hiện nhanh bằng bộ

7

kít IC cũng đã trở th|nh thương mại hóa, có sẵn để ph{t hiện NoV. Bộ kít IC
n|y đã chứng minh có độ nhạy cao hơn so với c{c thử nghiệm bằng ELISA.
Tuy nhiên, hạn chế của c{c thử nghiệm chẩn đo{n EIA cơ bản để ph{t hiện
NoV l| chỉ có kiểu gen NoV m| c{c kh{ng thể đơn dòng đặc hiệu có thể được
ph{t hiện.
5. Các kỹ thuật sinh học phân tử
5.1 Phương pháp RT-PCR
L| phương ph{p PCR m| nucleic acid đích cần phải ph{t hiện l| RNA. Để có
thể thực hiện được PCR n|y thì trước hết RNA đích phải được phiên mã
ngược (RT-reverse transcription) th|nh cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để
khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự n|y.

bắt nguồn từ một tế b|o vi sinh vật ban đầu có mang vector t{i tổ hợp cần tìm.
Vector thường được sử dụng l| một plasmid thuộc thế hệ thứ 3 pGEM-T easy.
 Đặc điểm của vector pGEM - T easy
- Đầu thừa Thymidine 3’ để tách dòng sản phẩm PCR: pGEM-T Easy vector
được thiết kế với một 3’- thymidine ở cả hai đầu. T- nhô ra ở vị trí gắn
tăng hiệu quả của qu{ trình gắn sản phẩm PCR bằng c{ch ngăn chặn
việc tự gắn vòng vector v| cung cấp một đầu T tương thích với đầu A
của sản phẩm PCR đã được tạo ra bởi c{c enzym tổng hợp.
- Lựa chọn các thể biến nạp Xanh/ Trắng: pGEM-T Easy l| vector có số lượng
bản copy cao, chứa c{c promoter T7 v| SP6 RNA polymerase nằm cạnh
vùng MCR (Multiple Cloning Region), bên trong đoạn mã cho α-peptite v|
đoạn mã cho enzym β-galactosidase. Sự bất hoạt do hoạt động chèn v|o của
đoạn α-peptite cho phép x{c định c{c thể chuyển nạp hay không chuyển
nạp bằng c{ch s|ng lọc m|u sắc xanh/trắng trên đĩa thạch.
- Vị trí enzym giới hạn cho việc cắt đoạn sản phẩm gắn: Vector chứa một số
lớn vị trí cắt của enzym giới hạn trong vùng đa chọn lọc MCR. Vị trí
MCR của vector pGEM-T Easy nằm dọc theo c{c vị trí nhận biết của
enzym EcoRI, BstZI v| NotI, cho phép 3 enzym riêng rẽ cắt đoạn chèn.
- Gắn nhanh chóng: Phản ứng gắn có thể được ủ trong vòng 1 giờ ở nhiệt
độ phòng. Khoảng thời gian ủ có thể tăng thêm để tăng số lượng khuẩn
lạc được biến nạp.
Hình 1.4. Promoter và trình tự đa nối của vector pGEM-T Easy. Sợi trên chịu
trách nhiệm tổng hợp RNA nhờ enzym T7 RNA polymerase. Sợi dưới chịu trách
nhiệm tổng hợp RNA nhờ SP6 RNA polymerase.

9

QUI TRÌNH PHÁT HIỆN NOROVIRUS TRONG NHUYỄN
THỂ HAI MẢNH VỎ
1. PHẠM VI ÁP DỤNG

- M{y vortex
- M{y ủ nhiệt khô
- M{y dập mẫu.
- Tủ cấy vô trùng
- M{y trộn mẫu
- Tủ cấy vô trùng (Lab hood)
- M{y Vortex
- M{y ly t}m eppendorf
- M{y PCR
- M{y Real Time PCR
- Bộ dụng cụ điện di
- M{y chụp UV
- M{y l|m khô
5. MÔI TRƯỜNG, HÓA CHẤT
5.1 Bộ hóa chất tách chiết RNA toàn phần
NK
RNAPREP
Phương ph{p t{ch chiết thô RNA to|n phần {p dụng cho hầu hết c{c mẫu thử,
c{c mục đích sử dụng vì đ}y l| phương ph{p rất hiệu quả cho tất cả c{c loại
RNA từ virus, vi khuẩn, nấm men,… mẫu thử có thể l| c{c canh cấy tế b|o có
nh}n hay mô nghiền, vi khuẩn hay virus trong c{c dịch sinh học như m{u,
huyết thanh, huyết tương v| c{c dịch kh{c.
Bộ thuốc thử
NK
RNAPREP do công ty Nam Khoa cung cấp. Bộ thuốc thử bao
gồm c{c th|nh phần đủ để t{ch chiết RNA.
Tên thuốc thử Th|nh phần Điều kiện bảo quản
R1RNAPREP Guanidine, ure, phenol, chất tẩy 4
o
C/tối

o
C
RNAse H, dNTP, oligo (dT)
Random hexamer

5.3 Bộ hóa chất dùng điện di

Bộ hóa chất bao gồm c{c th|nh phần đủ để có thể điện di sản phẩm PCR
trên gel agarose.

Tên thuốc thử th|nh phần ĐK bảo quản
NK
TBE10X tris HCl, boric acid, EDTA T
o
PTN
NK
Agarose agarose (MB grade) T
o
PTN
NK
Loading buffer bromo phenol blue, glycerol T
o
PTN
tris-EDTA
NK
Ethidium bromide ethidium bromide T
o
PTN
NK
DNA ladder thang DNA từ 100 đến 1000bps 2-8

mix
Thể tích phải lấy cho
20 Real Time PCR mix
20µl/mix
PCR master mix 2X
1x
500µl
Mồi GI JJ-V1 F (100µM)
12pm
2,4µl
Mồi JJ-V1 R (100µM)
12pm
2,4µl
JJ V1- Probe (100µM)
5pm
1µl
Mồi GII JJ-V2 F (100µM)
12pm
2,4µl
Mồi CO-G2 R (100µM)
12pm
2,4µl
RIN-G2- Probe (100µM)
5pm
1µl
MgCl2 (50mM)
3,5µM
70µl
dNTP (100mM)
0,2mM

RING2-P
TGG GAG GGC GAT CGC AAT
CT
5048 – 5067 13

6.1.1 Chuẩn bị mẫu thực phẩm ph{t hiện Norovirus
C{c mẫu được t{ch chiết riêng biệt, số lượng tối thiểu 10 con/mẫu, được cắt
nhỏ, cho v|o m{y nghiền, dập đều mẫu để giải phóng hạt virus ra khỏi tế b|o.
Hút dịch lỏng của mẫu 200µl, cho v|o ống eppendorf loại 1,5ml v| tiến h|nh
t{ch chiết mẫu thu RNA bằng bộ kít chiết t{ch mẫu
NK
RNAPREP của Công ty
Nam Khoa.
6.1.2 T{ch chiết RNA to|n phần bằng bộ thuốc thử
NK
RNAPREP
Nguyên tắc
Dựa trên phương ph{p do Chomczynski v| Sacchi s{ng chế. Nguyên tắc l|
dùng guanidine 14M v| ure, phối hợp với phenol v| chất tẩy kh{c để l|m c{c
chất g}y biến tính c{c protein, kết quả l| c{c protein trong mẫu thử sẽ bị vón
lại, DNA sẽ tan trong pha phenol, còn RNA thì nằm trong phase nước v| sẽ
được t{ch khỏi pha phenol nhờ thêm v|o chloroform v| quay ly t}m lắng t{ch.
RNA trong phase nước sau đó sẽ được kết tủa nhờ isopropanol
Các bước tiến hành

C trong 10-15 phút trong m{y ủ nhiệt khô
- Cho v|o tủa khô 30l R5
- Giữ ở 55-60
o
C trong 10 phút
6.1.3 Tổng hợp cDNA bằng bộ thuốc thử
NK
cDNA synthesis
Nguyên tắc
Phương ph{p n|y sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random hexamer
primers) m| không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp to|n bộ RNA từ mẫu
thử th|nh cDNA từ RNA nhờ men Reverse Transcriptase. Ngo|i ra trong hệ
thống phản ứng còn có men RNAse H để cắt bỏ RNA bị bắt cặp v|o cDNA sau
khi phiên mã ngược th|nh cDNA.

Nguyên tắc phiên mã ngược tổng hợp cDNA
Các bước tiến hành
 Cho 40µl mẫu t{ch chiết RNA v|o tube PCR có chứa sẵn 3µl
NK
RTmix
đang ng}m trong đ{
 Thực hiện tổng hợp cDNA trong m{y lu}n nhiệt theo chương trình như
sau: 5 phút: 25
o
C, 30 phút: 42
o
C, 5 phút: 85
o
C, Giữ 4
o
Ct
Kết quả dương tính với NoV khi Ct trên chu kỳ ngưỡng

16

TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Buesa, J., et al., Sequential evolution of genotype GII.4 norovirus variants
causing gastroenteritis outbreaks from 2001 to 2006 in Eastern Spain, J. Med.
Virol., 80, 1288, 2008.
2. Burin, E., et al., Diagnosis of norovirus outbreaks by commercial ELISA or
RT-PCR, J. Virol. Methods, 137, 259, 2006.
3. Burton-MacLeod, J. A., et al., Evaluation and comparison of two commercial
enzym-linked immunosorbent assay kíts for detection of antigenically diverse
human noroviruses in stool samples, J. Clin. Microbiol., 42, 2587, 2004.
4. Caul, E. O., Small round structured viruses: Airborne transmission and
hospital control, Lancet, 343, 1240, 1994.
5. Donaldson, E. F., et al., Norovirus pathogensis : Mechanisms of persistence
and immune evasion in human populations, Immunol. Rev., 225, 190, 2008.
6. Green, Y. K., Caliciviridae: The noroviruses, Chapter 28 in Fields Virology, eds.

16. Khamrin, P., et al., Evaluation of immunochromatography and commercial
enzym-linked immunosorbent assay for rapid detection of norovirus antigen
in stool samples, J. Virol. Methods, 147, 360, 2008.
17. Lopman, B., et al., Increase in viral gastroenteritis outbreaks in Europe and
epidemic spread of new norovirus variants, Lancet, 363, 682, 2004.
18. Lindesmith, L., et al., Human susceptibility and resistance to Norwalk virus
infection, Nat. Med., 9, 548, 2003.
19. Lewis, D. C., Three serotypes of Norwalk-like virus demonstrated by solid-
phase immune electron microscopy, J. Med. Virol., 30, 77, 1990.
20. McEvoy, M., et al., An outbreak of viral gastroenteritis on a cruise ship,
Commun. Dis. Rep. CDR. Rev., 6, 188, 1996.
21. McIntyre, L., et al., Gastrointestinal outbreaks asscociated with Norwalk virus
in restaurants in Vancouver, British Columbia, Can. Commun. Dis. Rep., 28,
197, 2002.
22. Marks, P. J., et al., Evidence for airbone transmission of Norwalk-like (NLV)
in a hotel restaurant, Epidemiol. Infect., 120, 481, 2000.
23. Marionneau, S., et al., ABH and Lewis histo-blood group antigens, a model
for the meaning of oligosaccharide diversity in the face of a changing world,
Biochimie, 83, 565, 2001.
24. Marina Hoehne and Eckart Schreier, 2006, Detection of Norovirus genogroup
I and II by multiplex real time RT-PCR using a 3’-minor groove binder-DNA
probe. BMC infection deseases, 69, 2006.
25. Nguyen, T. A., et al., Diversity of viruses associated with acute gastroenteritis
in children hospitalized with diarrhea in Ho Chi Minh City, Vietnam, J. Med.
Virol., 79, 582, 2007.
26. Narayanan Jothikumar, James A. Lowther, Kathleen Henshilwood, David N.
Lees, Vincent R.Hill and Fan Vinje, 2004, Rapid and Sensitive detection of
Norovirus by using Taqman-Based one-step RT-PCR assay and Aplication to
naturally contaminated Shellfish samples. Applied and Environmental.
Microbiology, p. 1870-1875, 2004.

2004.
39. Tan, M., et al., Conversation of carbohydrate binding interfaces: Evidence of
human HBGA selection in norovirus evolution, PLoS One, 4, 1, 2009.
40. Tian, P., and Mandrell, R., Detection of norovirus capsid proteins in faecal
and food samples by a real time immune-PCR method, J. Appl. Microbiol.,
100, 564, 2006.
41. Xi, J. N. et al., Norwalk virus genome cloning and character-ization, Science,
250, 1580, 1990.
42. Yan, H., et al., Detection of norovirus (GI, GII), Sapovirus and astrovirus in
fecal samples using reverse transcription single-round multiplex PCR, J. Virol.
Methods, 114, 37, 2003.
43. Zeng, D. P., et al., Norovirus classification and proposed strain nomenclature,
Virology, 346, 312, 2006.
44. Wilhelmi, L., Roman, E., and Sanschez-Fauquier, A., Viruses causing
gastroenteritis, Clin. Microbiol. Infect., 9, 247, 2003.
45. Wyatt, R. G., et al., Comparison of three agents of acute infectious
nonbacterial gastroenteritis by cross-challenge in volunteers, J. Infect. Dis.,
129, 709, 1974.

19

Quantitative Polymerase Chain Reaction:TaqMan®Probe Detection

(1) Nucleotide
(Probe) coupled with
fluorescence
dye and quencher