BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….

NGUYỄN ANH KHOA PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ
THUẬT ELISA VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU
PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

BẰNG KỸ THUẬT PCR Luận văn kỹ sƣ
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Tp. HCM, 8/2006
Sinh viên thực hiện
NGUYỄN ANH KHOA
Niên khóa: 2002 - 2006
Giáo viên hƣớng dẫn
PGS. TS. BÙI CÁCH TUYẾN
HCMC, 9/2006
Professor
BUI CACH TUYEN
Student
NGUYEN ANH KHOA
Term: 2002- 2006

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
….  ….
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA
PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KỸ THUẬT ELISA
VÀ BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH
CẰN MÍA GỐC BẰNG KỸ THUẬT PCR


 Xin chân thành cảm ơn đến quí Thầy Cô bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã
nhiệt tình chỉ dạy cũng nhƣ đóng góp ý kiến chân thành cho tôi trong suốt thời
gian làm khóa luận này.
 Xin gửi lời cảm ơn đến tập thể lớp Công Nghệ Sinh Học 28 đã luôn ủng hộ,
động viên và giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.

Sinh viên thực hiện Nguyễn Anh Khoa iv TÓM TẮT
NGUYỄN ANH KHOA, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 8 năm 2006.
“PHÁT HIỆN BỆNH KHẢM LÁ MÍA BẰNG KĨ THUẬT ELISA VÀ BƢỚC
ĐẦU NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN BỆNH CẰN MÍA GỐC BẰNG KĨ THUẬT
PCR”
Giáo viên hƣớng dẫn: PGS. TS. Bùi Cách Tuyến.
Đề tài khảo sát sự nhiễm bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic) và cằn mía gốc
(Ratoon stunting disease) đƣợc thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng
(TTNCMĐ) tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực tỉnh Đồng Nai. Đây là nghiên
cứu nhằm góp phần thống kê tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và cằn mía gốc trên
một số giống mía sản xuất và nhập nội tại 2 vùng trồng mía này. Đặc biệt đề tài là
bƣớc đi đầu tiên trong nghiên cứu, phát hiện bệnh cằn mía gốc do vi khuẩn Leifsonia

pathogenic free species, to prevent and to control epidemic diseases on sugarcane
effectively.
The results of this research are as follows:
- DAS-ELISA result data show that all investigatived sugarcane species
produced and imported at sugarcane researching center at Binh Duong, is not
found SCMV.
- Detecting Lxx by microscopy and STM stainning. Results: 70,5% of phloem
vessel do not infected by Lxx on sugarcane species at Binh Duong provine and
75,18% phloem of vessel do not infected by Lxx on sugarcane at Tho Vuc farm.
- Preliminary defining factors effecting the Lxx bacteria culturing process.
- Proposing the method to culture Lxx bacteria and to perfect Lxx bacteria
detecting process by PCR.

vi MỤC LỤC

Nội dung Trang
LỜI CẢM ƠN iii
TÓM TẮT iv
MỤC LỤC vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ SƠ ĐỒ ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ HÌNH CHỤP x
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT xi
Phần 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu 1

2.4.1. Nguồn gốc và phân bố 14
2.4.2. Triệu chứng 14
2.4.2.1. Triệu chứng bên ngoài 14
2.4.2.2. Triệu chứng bên trong cây 15
2.4.3. Tác nhân gây bệnh 16
2.4.4. Quy luật phát sinh phát triển bệnh 16
2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế 17
2.4.6. Kiểm soát bệnh 17
2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía 17
2.4.7.1. Phƣơng pháp chẩn đoán trực tiếp bằng kính hiển vi 17
2.4.7.2. Phƣơng pháp huyết thanh học 17
2.4.7.3. Phƣơng pháp nhuộm STM (dựa vào đáp ứng của kí chủ) 19
2.4.7.4. Phƣơng pháp chẩn đoán dựa vào kỹ thuật sinh học phân tử 19
2.5. Tình hình nghiên cứu về bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc 19
2.5.1. Trên thế giới 19
2.5.2. Trong nƣớc 20
Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1. Nội dung nghiên cứu 22
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22
3.3. Vật liệu nghiên cứu 22
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu 22
3.3.2. Virus gây bệnh 22
3.3.3. Vi khuẩn gây bệnh 22
3.3.4. Hóa chất thí nghiệm 23
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ 23
3.4. Phƣơng pháp tiến hành 23
3.4.1. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu 23 viii


BẢNG TRANG
Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh. 6
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt 30
Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp
quan sát dƣới kính hiển vi 34
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại
TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp nhuộm STM. 35
Bảng 4.3. So sánh kết quả chẩn đoán của hai phƣơng pháp:
dùng kính hiển vi và nhuộm STM. 36
Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp 11
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT - PCR 13
Sơ đồ 3.1. Sơ đồ điều tra 24
Sơ đồ 3.2. Sơ đồ tách chiết mẫu lá cho ELISA 25
Sơ đồ 3.3. Sơ đồ bố trí giếng trên đĩa ELISA 25 x DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1. Cây mía 3
Hình 2.2. Bệnh hại phổ biến trên cây mía 6
Hình 2.3. Triệu chứng bệnh khảm lá mía 7
Hình 2.4. Sugarcane mosaic virus 8
Hình 2.5. Cơ chế phản ứng đổi màu trong DAS- ELISA 12
Hình 2.6. Lxx gây những vết chuyển màu ở thân mía. 15
Hình 2.7. Vi khuẩn Leifsonia xyli subsp xyli dƣới kính hiển vi điện tử

ddNTP: Dideoxyribonucleoside triphosphate.
DEPC: Diethyl pyrocarbonate.
dNTP: Deoxyribonucleoside triphosphate.
p-NPP: p - nitrophenol phosphate.
PVP: Polyvinylpyrrolidone.
BSA: Bovine serum albumin.
PBS: Dung dịch chứa PVP, BSA, Tween–20 và sodium azide.
RNA: Ribonucleic acid.
bp: Base pair.
EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid.
mRNA: Messenger RNA.
PCR: Polymerase chain reaction.
RNase: Ribonuclease.
SCMV: Sugarcane Mosaic Virus.
RSD: Ratoon stunting disease.
Lxx: Leifsonia xyli subsp. xyli.
STM: Stainning transpiration.
TTPT: Trung tâm phân tích.
Taq: Thermus aquaticus.1 Phần 1. MỞ ĐẦU

1.1. Cơ sở tiến hành và ý nghĩa của nghiên cứu
Hiện nay cây mía (Saccharum spp.) đang là một trong những loại cây công nghiệp
cho hiệu quả kinh tế cao ở nƣớc ta cũng nhƣ nhiều nƣớc trên thế giới nhƣ Cuba, Ấn
Độ, Australia,.v.v. vì vậy diện tích trồng mía cũng nhƣ sự ra đời của nhiều giống mới

độ tuổi. Do vậy ngƣời sản xuất thƣờng lầm tƣởng hay lẫn lộn nguyên nhân của sự
chậm lớn trên là do vùng đất trồng kém dinh dƣỡng, độ ẩm không thích hợp hay cây bị
thiếu chất. Các phƣơng pháp phát hiện Lxx nhƣ là nhìn dƣới kính hiển vi, phát hiện
bằng phƣơng pháp miễn dịch học,.v.v. cũng đƣợc phát triển nhƣng độ chính xác và độ
nhạy chƣa cao. Do vậy, việc ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn đoán
nhanh và chính xác bệnh là một yêu cầu cần thiết, có ý nghĩa rất quan trọng, phục vụ
cho công tác chọn giống, kiểm định giống từ đó đề ra các khuyến cáo nhằm kiểm soát
và quản lí bệnh có hiệu quả.
Trƣớc tình hình trên, đƣợc sự hƣớng dẫn của PGS. TS. Bùi Cách Tuyến và sự hỗ
trợ từ TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng chúng tôi đã thực hiện đề tài “Phát hiện bệnh
khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA và bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn
mía gốc bằng kỹ thuật PCR”. Đề tài đƣợc thực hiện trên một số giống mía nhập nội
và sản xuất tại tỉnh Bình Dƣơng (Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng) và Đồng Nai
(Nông trƣờng Thọ Vực)”.
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
- Đánh giá tình hình nhiễm bệnh khảm lá mía và bệnh cằn mía gốc trên một số
giống mía sản xuất tại TTNCMĐ tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng Thọ Vực
tỉnh Đồng Nai.
- Kiểm định các giống mía mới nhập nội năm 2005.
- Phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp quan sát vi khuẩn Lxx dƣới kính
hiển vi và phƣơng pháp nhuộm STM (Stainning transpiration).
- Nuôi cấy phân lập vi khuẩn Lxx.
- Phát hiện trực tiếp vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía bằng kỹ thuật PCR.
1.3. Giới hạn đề tài
- Thời gian thực hiện đề tài có hạn vì vậy không thể tiến hành điều tra khảo sát và
theo dõi diễn biến bệnh trên các giai đoạn tăng trƣởng đƣợc.
- Nghiên cứu phân lập vi khuẩn Lxx cần thời gian dài vì đây là loại vi khuẩn khó
nuôi cấy trên môi trƣờng.
 S. spontaneum xuất hiện trong quần thể hoang dại ở phía đông và nam Châu
Phi, từ suốt vùng trung đông đến Ấn Độ, Trung Quốc, Triều Tiên và Malaysia,
và từ suốt vùng Thái Bình Dƣơng đến New Guinea.

Hình 2.1. Cây mía
(Nguồn: Philipe
Rott, 2000) 4  Trung tâm xuất xứ của cây mía có thể là ở miền nam Ấn Độ nơi đã xuất hiện
giống S. robustum có số lƣợng NST nhỏ nhất dọc theo bờ sông ở New Guinea
và một ít ở các đảo liền kề và đã trở thành cây bản xứ của khu vực này.
 S. officinarum còn gọi là “noble cane” giống với các cây mía nguồn gốc ở
New Guinea. Loại mía này chỉ phù hợp với vùng nhiệt đới với điều kiện đất
đai và khí hậu thuận lợi.
 S. barberi có thể có nguồn gốc ở Ấn Độ.
 S. sinense có xuất xứ một phần ở Ấn Độ, Indonesia, Trung Quốc, nam Trung
Quốc và Triều Tiên.
 S. edule là loại không thể sản xuất mùa màng nhƣ S. robustum và chỉ tìm thấy
đƣợc ở New Guinea và các đảo kế cận.
Cây mía hiện tại là cây trồng chính tại nhiều nƣớc vùng nhiệt đới. Vĩ độ cao nhất
mà cây mía đƣợc trồng là tại Natal, Argentina và tại cực nam của Australia (khoảng 30
độ S), và khoảng 34 độ N phía tây nam Pakistan, và 37 độ N ở nam Tây Ban Nha.
2.1.4. Nhân giống
Để nhân giống mía ngƣời ta thƣờng trồng bằng thân mía cắt từ cây mía chƣa
trƣởng thành có thời gian trồng từ 6 - 8 tháng tuổi. Những đoạn thân này đƣợc gọi là
"setts", "seed", "seed - cane" hay "seed - pieces". “Sett” đƣợc cho là tốt nhất nếu đƣợc

thô màu nâu này có thể đƣợc tinh chế thành đƣờng trắng sạch hơn.
- Cây mía đƣợc sử dụng trong nhiều mục đích khác hơn nữa chứ không riêng gì
việc sản xuất ra đƣờng:
 Mật đƣờng là sản phẩm phụ trong quá trình chế biến đƣờng, nó là chất lắng
xuống khi không còn khả năng kết tinh thành đƣờng. Gần 2,7% mật đƣờng
hình thành khi chiết xuất 1 tấn mía. Mật đƣờng đƣợc sử dụng cho nhiều mục
đích khác nhau: dùng để làm phân bón cho đất trồng mía, đƣợc vô trùng và lên
men để tạo ra nhiều loại sản phẩm khác nhau nhƣ cồn vô trùng, rƣợu rum, hay
ethyl alcohol.
 Sản phẩm còn lại sau quá trình ép nƣớc mía đó là bã mía đƣợc dùng nhƣ là
nguồn nhiên liệu chính của các nhà máy đƣờng, nó còn đƣờc dùng để làm
giấy, bìa cứng, bảng và tƣờng bằng giấy ép cứng.
2.2. Bệnh trên cây mía
Theo thống kê ở các nƣớc trồng mía hiện nay thì có tất cả 126 bệnh hại mía trên thế
giới (Philippe Rott, 2000), trong đó có 73 bệnh hại phổ biến. Bệnh hại đƣợc gây ra bởi
8 nhóm tác nhân chính cho ở Bảng 1.1.
Trong đó bệnh do virus là loại bệnh khó kiểm soát nhất và gây thiệt hại nghiêm
trọng nhƣ bệnh khảm lá mía (Sugarcane Mosaic), bệnh vàng gân lá (Yellow leaf
syndrome), bệnh Fiji (Fiji disease),.v.v.
Bệnh do nấm gây ra có số lƣợng nhiều nhất cũng nhƣ là gây thiệt hại nhiều nhất
nhƣ bệnh đốm vòng (Ring spot), bệnh mốc sƣơng (Downy mildew), bệnh than (Smut). 6 Bảng 1.1. Thống kê về nhóm tác nhân gây bệnh và số lƣợng bệnh đang xảy ra trên cây
mía (Haø Ñình Tuaán, 2004).
Nhóm tác nhân gây bệnh Số lƣợng bệnh gây ra
1. Bệnh do virus 9

2.3.1. Nguồn gốc và phân bố
Bệnh khảm đƣợc công nhận đầu tiên vào năm 1892, đƣợc xem nhƣ là một đặc tính
bất thƣờng trên mía bởi Musschenbrock ở Java. Ông đã đặt tên cho nó là bệnh đốm
sọc vàng “gelestrepenziekte”.
Nguồn gốc của bệnh khảm trên mía thì không đƣợc biết rõ, nhƣng qua các lần quan
sát, theo dõi thì Brandes đã kết luận rằng kí chủ là virus có cùng một điểm phát sinh.
Nên theo ông virus này phải xuất phát từ New Guinea, nơi mà mía là một loài địa
phƣơng. Ngƣời ta phỏng đoán rằng bệnh có từ thời kì tiền sử và lan đến các vùng khác
cùng với sự di chuyển của cây mía từ New Guinea.
2.3.2. Triệu chứng
Theo Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu Mân (1999), triệu chứng đặc trƣng của bệnh là các
vết khảm xanh nhợt hoặc vàng trên lá. Vết bệnh sau đó sẽ chuyển thành vết chết hoại,
hiện tƣợng này đôi khi còn thấy trên thân. Sự biểu hiện triệu chứng còn phụ thuộc vào
chủng virus, cây kí chủ và điều kiện môi trƣờng, đặc biệt là yếu tố nhiệt độ.
Bênh khảm virus đƣợc xác định chủ yếu trên lá, mức độ khác nhau tùy vào dòng
mía, điều kiện sinh trƣởng, nhiệt độ và chủng virus có liên quan. Triệu chứng thông
thƣờng là vết đốm đặc trƣng màu xạnh nhạt mờ ảo, tƣơng phản trên phiến lá, hoặc
những vùng màu xanh nhạt hay biến vàng là kết quả phân bố của các mức độ hàm
lƣợng diệp lục tố khác nhau (Hình 2.3).
A B C
Hình 2.3. Triệu chứng của bệnh khảm lá mía. (Bailey, 1998)
Chú thích: A: Cây còi cọc và vàng lá; B: Vết khảm màu xanh nhợt trên lá; C: Vết
khảm vàng trên lá non.
8 Những vùng biến vàng thông thƣờng thấy rõ nhất ở lá non, lá đang sinh trƣởng

Nhiều đặc tính của virus SCMV cũng đƣợc nghiên cứu. Hệ số lắng đọng là 176 ±
5S và mật độ lơ lửng là 1,3327 của SCMV-D, và giá trị 148 ± 2 – 170 ± 5S tƣơng ứng
với 1,285 – 1,3421 của SCMV –J. Hình 2.4. SCMV dƣới kính
hiển vi điện tử (x 30.000 lần)
(Nguồn: www. Plantpathology) 9 2.3.4. Các chủng virus gây bệnh khảm lá mía
Có nhiều chủng virus khác nhau, khác biệt trong khả năng gây nhiễm và mức độ
thiệt hại do chúng gây ra. Những chủng virus khác nhau thƣờng tạo ra những triệu
chứng tƣơng tự nhau trên hầu hết các dòng mía thƣơng mại hiện nay. Tuy nhiên chúng
cũng có thể đƣợc phân biệt bằng các dòng chỉ thị chọn lọc.
Theo Koike và Gillaspie (1989) thì có tổng cộng 14 chủng virus SCMV gây bệnh
khảm lá phân bố khắp thế giới là A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L, M, N.
2.3.5. Qui luật phát sinh phát triển bệnh
Virus khảm lá mía lan truyền qua nhiều loại rệp muội theo phƣơng thức nửa bền
vững. Rệp ngô Rhapalosiphum maidis Fitch, rệp bông Aphis gossipii, rệp đào Myzus
persicae, rệp mía Melanaphis sacchari … là môi giới chủ yếu truyền bệnh. Ngoài ra
bệnh còn có thể truyền qua con đƣờng nhân giống vô tính. Virus gây bệnh cũng có thể
truyền qua hạt ngô.
Cây mía mẫn cảm với bệnh ở giai đoạn cây con. Sự phát triển của bệnh trên đồng
ruộng phụ thuộc vào nhiều yếu tố nhƣ: sức chống chịu của giống mía, sự có mặt của
các chủng virus gây bệnh và sự tồn tại của quần thể rệp trên đồng ruộng. Điều kiện
canh tác cũng ảnh hƣởng đến sự mẫn cảm của cây và hoạt động của rệp.