33
Hình 4.2. Vi khuẩn Lxx dƣới kính hiển vi (độ phóng đại 1000 lần).
Kết quả quan sát sự xuất hiện của vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía dƣới
kính hiển vi cho kết quả: trong 6 giống mía sản xuất đƣợc khảo sát tại TTNNCMĐ thì
chỉ có giống VN84-1437 và R570 là không nhiễm bệnh, còn lại 4 giống mía khác là
C90-127, DLM24, VN85-1427 và ROC26 đều thấy đƣợc sự xuất hiện của vi khuẩn
Lxx dƣới kính hiển vi (xem Bảng 4.1). Tuy nhiên, phƣơng pháp chẩn đoán này cho tỉ
lệ kết quả dƣơng tính giả và âm tính giả khá cao. Nguyên nhân ở đây là sự phát hiện vi
khuẩn Lxx trong dịch chiết dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 1000 lần là rất khó khi
nồng độ vi khuẩn nhiễm bệnh hiện diện trong dịch chiết thấp.

Bảng 4.1. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên các giống sản xuất tại
TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi.
TTNCMĐ
Nông trƣờng Thọ Vực
STT
Giống
Kết quả
STT
Giống

-
+
+
+
Chú thích: - : Mẫu âm tính +: Mẫu dương tính.
Thân mía đƣợc nhuộm bằng dung dịch thuốc nhuộm safranin, sau 30 phút làm tiêu
bản xem dƣới kính hiển vi với độ phóng đại 40 và 100 lần, ta sẽ thấy có sự nhuộm màu 34 hay không nhuộm màu của các bó mạch khoẻ mạnh và bị nhiễm Lxx. (xem hình 4.3).
Mạch đƣợc nhuộm màu đỏ của safranin là kết quả của sự thẩm thấu dung dịch thuốc
nhuộm lên trên thân, còn mạch không đƣợc nhuộm màu là do vi khuẩn Lxx tồn tại
trong bó mạch làm tắt nghẽn sự lƣu thông của dung dịch thuốc nhuộm đi lên lên trên.

Hình 4.3. Mẫu thân nhuộm safranin dƣới kính hiển vi (x 40 lần (A) và x 100 lần (B)).
Chú thích: a: mạch vàng có chứa vi khuẩn; b: mạch đỏ là không có vi khuẩn.
Chẩn đoán bằng phƣơng pháp nhuộm STM cho kết quả: tất cả các giống mía sản
xuất khảo sát tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực đều bị nhiễm bệnh cằn mía gốc
với các mức độ nhiễm bệnh khác nhau. (xem bảng 4.2).
Bảng 4.2. Kết quả chẩn đoán bệnh cằn mía gốc dựa trên phƣơng pháp nhuộm STM.

Chú thích: Tb: Trung bình
TTNCMĐ
Nông trƣờng Thọ Vực
TT
Giống
Tỉ lệ

75,28
80,42
78,82
Tb
Nặng
Nặng
Tb
Tb
Tb
1
2
3
4
5
My55-14
VN84-4137
QĐ368
VĐ85-177
VN85-1427
68,11
82,82
79,18
79,88
65,90
Nặng
Tb
Tb
Tb
Nặng
Trung bình tỉ lệ

Nông trƣờng Thọ Vực
STT
Giống
Phƣơng pháp
chẩn đoán
STT
Giống
Phƣơng pháp
chẩn đoán
KHV
STM
KHV
STM
1
2
3
4
5
6
C90-127
VN84-4137
DLM24
R570
VN85-1427
ROC26
+
-
+
-
+
rằng ruộng mình bị thiếu dinh dƣỡng hay bị sâu bệnh phá hoại. Kết quả có ý nghĩa
thực tiễn trong việc thống kê tình hình nhiễm bệnh RSD trên các giống mía khảo sát.
4.2.2. Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx
và nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy
Vi khuẩn Lxx là vi khuẩn rất khó nuôi cấy trên môi trƣờng nhân tạo, khuẩn lạc vi
khuẩn theo nghiên cứu là phải mất đến khoảng 22 ngày nuôi cấy trên môi trƣờng đặc
trƣng mới hình thành đƣợc (Stevens Brumbley, 2003). Do vậy thời gian 2 tháng để
nghiên cứu nuôi cấy vi khuẩn Lxx trên môi trƣờng nhân tạo là quá ngắn và kết quả thu
đƣợc cũng hạn chế, không có bào tử của vi khuẩn Lxx hình thành. Tuy nhiên, sau quá
trình nghiên cứu chúng tôi cũng thu đƣợc một số kết quả nhất định cụ thể nhƣ sau:
- Quan sát và theo dõi quá trình hình thành khuẩn lạc của vi khuẩn Lxx trên môi
trƣờng nuôi cấy hàng ngày kể từ lúc bắt đầu cấy đến khoảng 15 - 22 ngày (ủ ở
28
O
C). Theo đó thì chỉ sau khi cấy mẫu dịch chiết vào môi trƣờng nuôi cấy 1 ngày
thì các vi khuẩn đã bắt đầu mọc trên môi trƣờng nuôi cấy. Đặc biệt là vào những
ngày đầu tiên, đã có sự xuất hiện của các khuẩn lạc giống nhƣ khuẩn lạc của vi
khuẩn Lxx đƣợc Davis (1980) mô tả ,đó là khuẩn lạc nhỏ đƣờng kính từ 0,1 - 0,3
mm, không màu. Tuy nhiên sau vài ngày nuôi cấy các khuẩn lạc này lớn dần lên
và có màu vàng (Hình 4.4). Thậm chí sau 15 - 20 ngày nuôi cấy vẫn còn một số
vùng trên đĩa nuôi cấy có các khuẩn lạc có kích thƣớc và hình dạng tƣơng tự, tuy
nhiên khi phân lập ra môi trƣờng trên đĩa khác thì lại không phải Lxx mà vẫn là
loại vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng này.
Song song với việc nuôi cấy vi khuẩn Lxx, chúng tôi cũng tiến hành chạy PCR trực
tiếp trên dịch chiết của cây mía bị bệnh. Sau nhiều lần tiến hành thí nghiệm, thay đổi quy
trình và sử dụng các chất bổ sung khác nhau vào phản ứng PCR, nhƣng kết quả PCR dựa
vào cặp mồi của Stevens Brumbley (2003) đều không đạt đƣợc kết quả mong đợi.
- Kết quả thí nghiệm 1: PCR theo protocol của Stevens Brumbley (2003).
Kết quả điện di: Không có sản phẩm trên gel điện di.
Nhận xét: Nguồn mẫu DNA đƣợc chuẩn bị theo quy trình của Stevens
Brumbley (2003) để chạy phản ứng PCR. Primer đƣợc đặt mới tại công ty
Biorad với trình tự đƣợc blast trên NCBI có kết quả cho bắt cặp đặc hiệu với
vi khuẩn Lxx trên ngân hàng gen. Tuy nhiên kết quả điện di không có thì
nguyên nhân có thể là do quy trình thực hiện chƣa tối ƣu hoặc do DNA mẫu 38 đƣa vào chƣa đƣợc biến tính tốt.
- Thí nghiệm 2: Thay đổi cách chuẩn bị mẫu. Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng
pháp chuẩn bị mẫu: Biến tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx. Chạy
PCR theo thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt nhƣ ở thí nghiệm 1.
Mẫu đƣợc chuẩn bị và đem đi đo OD, tính kết quả lƣợng DNA có trong mẫu
và thêm vào trong thành phần phản ứng PCR với nồng độ thƣờng dùng là 0,5
μM. Kết quả: không có băng DNA trên gel điện di. Nhận xét: Do OD không
có tác dụng trong trƣờng hợp này vì dịch chiết nƣớc mía có chứa nhiều nhân tố
ức chế nên lƣợng DNA đo đƣợc không chính xác với thực tế DNA mẫu vi
khuẩn trong mẫu. Tăng lƣợng DNA mẫu đƣa vào phản ứng PCR lên 1,5 và 2
lần cũng không cho kết quả vì điều này cũng đồng nghĩa với việc tăng các
nhân tố ức chế phản ứng PCR.
Hút DNA từ lớp trên của dịch biến tính đem chạy PCR. Tăng lƣợng DNA mẫu
đƣa vào phản ứng với nồng độ gấp 1,5 lần, 2 lần. Kết quả: không có băng

chiết nƣớc mía.
Kết quả: không có sản phẩm PCR đích.
Nhận xét: Tăng hàm lƣợng PVP vào phản ứng nhằm mục đích tăng cƣờng khả
năng khử các nhân tố ức chế phản ứng PCR, tuy nhiên có lẽ khi nồng độ PVP
cao thì nó cũng quay lại ức chế phản ứng PCR do đó chúng tôi không tăng
nồng độ PVP trong các thí nghiệm tiếp theo nữa. Do vậy chúng tôi tiếp tục
làm thí nghiệm theo hai hƣớng. Thứ nhất là giữ nguyên cách chuẩn bị mẫu
DNA cho PCR theo Stevens Brumbley (2003) và thay đổi quy trình phản ứng.
Thứ hai là thay đổi quy trình chuẩn bị mẫu DNA cho PCR.
- Thí nghiệm 4: Chuẩn bị mẫu theo quy trình của Stevens Brumbley. Khảo sát ảnh
hƣởng của các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt.
Kết quả thí nghiệm: Không có sản phẩm trên gel điện di.
Tóm lại, PCR là một hệ thống tƣơng thích các thành phần hóa chất và chu trình
nhiệt. Nhiều trƣờng hợp phản ứng PCR đƣợc thực hiện từ dịch DNA mẫu ly trích với
mồi chuyên biệt nhƣng vẫn không ra kết quả. Vì vậy PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía là một vấn đề rất khó thực hiện vì nguồn mẫu ban đầu là dịch chiết nƣớc mía
không sạch, có chứa nhiều nhân tố ức chế phản ứng PCR. Kết quả điện di sản phẩm
sau các lần chạy PCR mà không có băng DNA đích trên gel điện di thì có thể là do rất
nhiều nguyên nhân:
- Có thể là nguồn DNA mẫu đƣa vào trong phản ứng PCR không tinh sạch. Chúng
tôi tiến hành ở đây là do trong dịch chiết có quá nhiều chất lơ lửng, ức chế phản
ứng PCR. Nguồn mẫu dịch chiết mà chúng tôi dùng để chạy phản ứng PCR đƣợc
thu từ những cây có triệu chứng điển hình ngoài đồng ruộng, kết hợp với kiểm
tra quan sát sự xuất hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết mía dƣới kính hiển vi và
dƣơng tính khi nhuộm STM. Tuy nhiên mặc dù đã xác định đƣợc lƣợng mẫu đƣa 40
biến của bệnh tại 2 khu vực này. Đặc biệt là đối với bệnh cằn mía gốc, cần tiến
hành bố trí thí nghiệm trên nhiều giống khác nhau đối chứng với giống không
bị bệnh, để cuối cùng có con số thống kê chính xác về tình hình và mức độ gây
hại của bệnh hiện nay, từ đó có những khuyến cáo thích hợp trong việc phòng
trừ và kiểm soát bệnh.
- Qua quá trình tìm hiểu về bệnh cùng với sự hỗ trợ về kiến thức của GS. Stevens
Brumbley (Australia), ngƣời đã có kinh nghiệm nghiên cứu lâu năm về bệnh
cằn mía gốc và vi khuẩn Lxx, chúng tôi xin đề nghị về quy trình nuôi cấy thu
khuẩn lạc vi khuẩn Lxx, cũng nhƣ quy trình PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía nhƣ sau trong các thí nghiệm tiếp theo nhƣ sau:
 Quy trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx
 Xác định triệu chứng ngoài đồng ruộng.
 Xác định cây nhiễm bệnh cằn mía gốc bằng phƣơng pháp nhuộm STM.
 Thu dịch chiết (tiến hành vô trùng), kiểm tra sự hiện diện của Lxx dƣới
kính hiển vi điện tử hay đối pha (Phụ lục 1).
 Nuôi cấy vi khuẩn trên môi trƣờng MCS có bổ sung các thành phần theo
Stevens Brumbley (2003) và L. E Camargo (2004). 42  Tăng sinh trong môi trƣờng lỏng S8 để thu sinh khối (Thành phần môi
trƣờng nuôi cấy cho ở Bảng phụ lục 2).
 Quy trình PCR phát hiện vi khuẩn Lxx:
 Nuôi cấy thu sinh khối vi khuẩn Lxx, thực hiện li trích DNA vi khuẩn Lxx
theo quy trình cho ở Phụ lục 3.
 Thực hiện phản ứng PCR phát hiện vi khuẩn Lxx
 Sau khi ổn định quy trình rồi thì tiến hành PCR trực tiếp từ dịch chiết nƣớc
mía dựa trên đối chứng dƣơng là vi khuẩn Lxx đã nuôi cấy đƣợc.

12. Trƣơng Lê Bạch Liên, 2005. Điều tra và phát hiện bệnh khảm lá (Sugarcane
Mosaic Virus) trên cây mía (Sacccharum spp) bằng kỹ thuật ELISA và bước đầu
xây dựng kỹ thuật RT-PCR. Luận văn tốt nghiệp kỹ sƣ Nông học, Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Việt Nam.
13. Vũ Triệu Mân, 2003. Chẩn đoán bệnh hại thực vật. Nhà xuất bản Nông nghiệp.
TIẾNG NƢỚC NGOÀI
14. Andreas Westphal and T. Eril Mirkov, 2003. Need for improved detection of
Ratoon stunting disease in Sugarcane in South Texas. Phytopathology 7: p 133 -
136. 44 15. Alfred. Hercules, 2000. Aurum Total RNA Mini Kit Instruction Manual Bio-Rad
Laboratories, p 26-27.
16. Chemicon International, Inc - 28820 Single Oak Drive - Temecula, CA 92590,
Introduction to Antibodies - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
<http://www.chemicon.com/resource/ANT101/a2C.asp>
17. Damann. K.E, Jr. 1988. Alkaline-induced metaxylem autofluorescence: a
diagnostic symptom of ratoon stunting disease of sugarcane. Phytopathology 78: p
233 - 236.
18. Fegan, 1999. Sensitive and specific detection of Clavibacter xyli subsp. xyli,
causal agent of ratoo stunting disease os sugarcane , with a polymerase chain
reaction-based assay. Phytopathology, p 33 - 36.
19. John R. Crowther, 2001, The Elisa Guidebook – Volume 149, p 12 – 34.
20. Gillaspie Jr., A.G. Davis, M.J. (1992): Ratoonstunting disease of sugarcane. In
Plant disease of International Importance. Disease of sugar, Forestand Plantation
Crops, vol4 (A.N. Mukhopadhyay,J. Kamar, H.S. Chaube, U.S.Singh, eds).
EnglewoodCliffs: New Jersey, Prentice Hall, p 41 – 61.


1. Cắt hết lá của thân bị nhiễm bệnh.
- Phụ thuộc vào chiều dài của mắt mía mà cắt đoạn thân ra có chứa 3 - 4 mắt mía
- Vì nồng độ vi khuẩn cao nhất ở dƣới thân cho nên lấy phần thân ở sát gốc mía.
2. Rửa thân bằng bàn chải và lau cho khô bằng giấy lau.
3. Rửa sạch bằng nƣớc.
4. Ngâm thân mía vào trong dung dịch thuốc tẩy 10 % trong 10 phút.
5. Rửa sach dƣới vòi nƣớc máy.
6. Khử trùng thân mía bằng cồn 70 % và đốt để cho hết cồn còn dƣ.
7. Cắt một đoạn thân mía ra và khử trùng đoạn thân này.
8. Dùng bơm đẩy khí từ một đầu và thu dịch chiết ở đầu kia bằng eppendorf
vô trùng.
9. Đổ dịch chiết trên vào môi trƣờng nuôi cấy MSC. Kiểm tra môi trƣờng
nuôi cấy hàng ngày. xiii Phụ lục 2: Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Leifsonia xyli subsp. xyli
(Quy trình đƣợc đƣa ra bởi Stevens Brumbley - 2006)

MÔI TRƢỜNG MSC ( CHO 1L MÔI TRƢỜNG)

 Thành phần hấp vô trùng:
Corn meal agar = 17 g
Bacto-agar = 4 g
Bacto-peptone = 8 g
MgSO
4

chúng ở 55
O
C bằng một màng lọc vô trùng 0.22 m.

MÔI TRƢỜNG LỎNG S8
 Thành phần hấp vô trùng
Bacto - Soytone = 8 g
Hemin chloride = 15 ml
MgSO
4
.7H
2
O = 0.2 g
K
2
HPO
4
= 0.35 g
KH
2
PO
4
= 1.1 g
H
2
O = 885 ml
 Thành phần lọc:
Glucose = 2 g
Cysteine = 0.5 g
Bovine serum albumin = 2 g

10) Thu DNA bằng pipet, rửa cẩn thận bằng cồn 70%.
11) Xử lí bằng Rnase.
12) Tiếp tục thêm phenol : chloroform để kết tủa ethanol.
13) Thu DNA bằng pipet và rửa bằng cồn 70%.
14) Huyền phù DNA trong TE. xv Phụ lục 4: Danh sách bệnh hại mía quan trọng và phổ biến. Tên Việt Nam
Tên tiếng Anh
Tác nhân gây hại
I
Bệnh do nấm

1
Bệnh sọc nâu
Brown stripe
Cohliobalus stenospilus (Drechs)
2
Bênh mốc sƣơng
Downy mildew
Peronosclerospora sacchri (T. Miyake)
3
Bệnh đốm mắt én
Eye spot

Bệnh than
Smut
Ustilago senaminea Syd
12
Bệnh đốm vàng
Yellow spot
Mycovellosiella koepket
13
Bệnh đốm vòng
Ring spot
Leptosphaeria sacchari van Berda de Haan

Bệnh do vi khuẩn 14
Bệnh gôm
Gumming diease
Xanthomonas camestris pv. Vasculorum
15
Bệnh thân ngọn đâm
chồi
Leaf scald
Xanthomonas alibilineans (Ashby 1929)
16
Bệnh cằn mía gốc
Ratoon stunting
disease
Leifsonia xyli subsp xyli (Davis et al, 1980)
17

Bệnh đốm sọc
Streak
Sugarcane streak virus
24
Vàng gân lá

Sugarcane yellow leaf virus xvi Phụ lục 4: Một số hình ảnh về quá trình nghiên cứu bệnh khảm lá mía và cằn
mía gốc. Hình PL1. Nhận dạng triệu chứng
và thu mẫu.
Hình PL2. Lá mía có triệu chứng khảm.

Hình PL3. Kết quả âm tính trong phân tích