10 2.3.7. Phòng trừ
Sử dụng giống kháng, chọn nguồn giống khỏe, sạch bệnh làm vật liệu trồng.
Tiêu diệt cây bệnh và cỏ dại, hạn chế bệnh lây lan, ẩn náu trên đồng ruộng.
Luân canh với cây trồng khác họ.
Xử lí hom giống bằng nhiệt độ hoặc thuốc hóa học.
Nuôi cấy mô phân sinh ngọn hoặc nuôi cấy mô kết hợp với xử lí nhiệt.
Tránh trồng và đốn mía vào thời kỳ có mật độ cao của quần thể môi giới.
2.3.8. Các phƣơng pháp xác định bệnh khảm lá mía
2.3.8.1. Dựa vào trạng thái dấu vết bệnh
Phƣơng pháp này đơn giản và nhanh nhất nhƣng hiện tƣợng dƣơng tính giả và âm
tính giả cũng cao nhất. Đơn giản vì vết bệnh dễ biến đổi, nhiều khi cây bị bệnh mà vết
bệnh không phát ra ngoài. Một số trƣờng hợp khác nhƣ vết bệnh không rõ ràng, bệnh
trong giai đoạn tiềm ẩn cũng gây khó khăn trong chẩn đoán.
2.3.8.2. Phƣơng pháp chẩn đoán dùng kính hiển vi
Phƣơng pháp đơn giản là sử dụng dịch chiết từ lá cây bệnh hoặc thông qua làm tinh
khiết cố định bằng hóa chất trên lƣới đồng để quan sát dƣới kính hiển vi điện tử. Đây
là phƣơng pháp trực tiếp và đơn giản.
2.3.8.3. Phƣơng pháp ELISA (Enzym-link immunosorbent assay)
Phƣơng pháp ELISA là phƣơng pháp miễn dịch liên kết enzym. Năm 1972 - 1973,
ELISA đƣợc sử dụng đầu tiên trong y học để chẩn đoán virus. Đến năm 1977 Clark và
Adam lần đầu tiên ứng dụng ELISA để xác định virus hại thực vật tại Scottlen. Đây là
kỹ thuật khá nhạy và tƣơng đối đơn giản, cho phép xác định kháng nguyên (KN) và
kháng thể (KT) ở nồng độ rất thấp (khoảng 0,1ng/ml), rẻ tiền, an toàn và độ chính xác
cao (Phạm Văn Ty, 2001).
Có 3 phƣơng pháp chính làm nền tảng cơ bản cho tất cả các dạng ELISA là:
- Direct ELISA: Đây là dạng đơn giản nhất của phƣơng pháp ELISA. Trong đó,

Sơ đồ 2.1. Tiến trình thực hiện ELISA Sandwich trực tiếp
Phân tích kết quả ELISA dựa trên sự đổi màu của các giếng (Hình 2.5) và bằng
máy đọc ELISA. Máy đọc ELISA hoạt động dựa trên nguyên lí quang phổ kế, đo giá
trị OD của các giếng ở bƣớc sóng 405 nm.
Cho kháng thể vào mỗi đĩa ELISA Ủ, rửa Thêm kháng nguyên vào

Ủ, rửa Bổ sung kháng thể có gắn enzyme Ủ, rửa

Thêm cơ chất tạo màu Ủ, đọc kết quả

mã ngƣợc, một polymerase RNA phụ thuộc DNA để tạo ra một sợi DNA bổ sung
(first-strand cDNA) sử dụng mRNA nhƣ một khuôn mẫu.
 Quá trình PCR
Để khuyếch đại cDNA vừa tạo thành ở quá trình Reverse Transcriptase
Complementary DNA đƣợc xem nhƣ DNA khuôn mẫu để thực hiện phản ứng PCR.
Phản ứng PCR gồm ba chu kỳ: biến tính, bắt cặp và kéo dài. Khởi đầu quá tình
tổng hợp DNA cần cung cấp đoạn mồi oligonucleotit (có độ từ 6 - 30 nucletides).
Đoạn này gắn kết với DNA khuôn tại điểm khởi đầu sao chép và đƣợc enzym DNA-
polymerase điều khiển để tổng hợp nên một sợi DNA đặc thù.
Sơ đồ 2.2. Sơ đồ tổng quát của kỹ thuật RT-PCR (Trích dẫn Vương Hồ Vũ, 2005).
Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi đƣợc chọn nằm ở 2 đầu đoạn DNA cần nhân
lên, sao cho các sợi DNA đƣợc tổng hợp mới đƣợc bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài
về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa 2 đoạn mồi này.
Độ dài của sản phẩm PCR có thể từ vài trăm đến hàng ngàn cặp nucleotid. 14 Nhƣ vậy sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi
DNA mới đƣợc tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng lại đƣợc nâng nhiệt độ thích hợp sao cho
các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới đƣợc tổng hợp, các sợi này sau đó đƣợc dùng làm
khuôn cho chu kỳ tiếp theo.
Kết quả cuối cùng của phản ứng PCR là sau n chu kỳ (thƣờng từ 25-35 chu kỳ),
tính theo lý thuyết ta có: 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm giữa 2 đoạn mồi.
Nhƣ vậy, từ một đoạn DNA định trƣớc đƣợc nhân lên với một số lƣợng rất lớn.
2.4. Bệnh cằn mía gốc
2.4.1. Nguồn gốc và phân bố
Bệnh cằn mía gốc hiện nay đƣợc xếp vào loại bệnh có tầm quan trọng kinh tế lớn
trên thế giới (Davis và Bailey, 2000). Nguyên nhân là do sự phân bố rộng khắp của nó

nhánh của các bó mạch. Sự đổi màu do RSD không diễn ra ở phẩn giữa đốt. Màu của
mô nhiễm bệnh khác nhau về mức độ đậm nhạt và cƣờng độ phụ thuộc vào mức độ
nhiễm bệnh và các giống mía khác nhau, và nó cũng có thể khác nhau bên trong các
giống. Một vài giống thì không biểu hiện các triệu chứng này. Các vùng bị biến đổi
màu này rất đa dạng có thể là màu vàng, cam, hồng, đỏ, và hơi đỏ nâu và những màu
này thƣờng nổi bật lên trên trên nền màu trắng sáng của mô tế bào. Có trƣờng hợp
bệnh tạo ra những vết đổi màu kem, khó có thể phân biệt trong toàn bộ đốt khi so sánh
với mô của cây khỏe mạnh. Nhƣng khi các vệt này xuất hiện tại một nốt mà nốt kế cận
lại không biểu hiện thì vẫn không chắc là nó có bị bệnh cằn mía gốc hay không. Để
chẩn đoán chính xác, thì các vệt đổi màu phải xuất hiện trên tất cả các nốt của cây.
Triệu chứng của RSD trên chồi mía 1 - 2 tháng tuổi là sự chuyển hồng tại các đốt
còn non, nhƣng nó diễn ra chỉ trong vài dòng mía và dƣới những điều kiện canh tác
khác nhau. Sự đổi màu diễn ra và khuyếch tán từ nốt lên 1 - 2 cm đến đỉnh sinh trƣởng
của nốt kết cận. Phần đầu của đỉnh sinh trƣởng không liên kết với RSD. Những triệu
chứng ban đầu đƣợc thấy rõ nhất khi cắt các chồi non theo chiều dọc.

A B C
Hình 2.6. Triệu chứng của cây mía bị bệnh cằn mía gốc (Irvine, 1999).
Chú thích: A: Cây bệnh cằn cọc kém phát triển; B: Đốt thân ngắn; C: Vết đổi màu
trong thân cây mía bị bệnh. 16


khuẩn này đã lan truyền từ vùng này sang vùng khác và từ quốc gia này sang các quốc
gia khác thông qua các chƣơng trình trao đổi giống cây trồng.

Hình 2.7. Vi khuẩn Lxx
dƣới kính hiển vi điện tử
(x30.000 lần)
(K. E. Damann, 2002) 17 2.4.5. Tầm quan trọng kinh tế
Hình hƣởng của RSD gây ra trên cây mia chủ yếu là làm giảm năng suất của cây,
tác động này phụ thuộc vào yếu tố giống và điều kiện thời tiết.
Năng suất giảm mạnh mẽ khi cây bị hạn hán và có thể giảm đáng kể trong điều
kiện đƣợc tƣới tiêu hợp lí.
Bệnh trầm trọng hơn khi mía bƣớc vào vụ mía gốc do đó bệnh làm giảm tốc độ
phát triển của mía gốc và số vụ mía gốc của giống mía. Hàm lƣợng đƣờng thƣờng
không bị ảnh hƣởng ngoại trừ khi cây bị chết.
2.4.6. Kiểm soát bệnh
Giữ vệ sinh dụng cụ thu hoạch: trƣớc và sau mỗi lần thu hoạch chúng ta đều phải
làm sạch các dụng cụ thu hoạch trƣớc khi cắt sang vƣờn cây sạch bệnh. Chúng ta có
thể dùng cách đốt, hay sử dụng hóa chất không lây nhiễm.
Làm sạch cây giống trƣớc khi trồng ta dùng phƣơng pháp ngâm chúng trong dòng
nƣớc nóng ở 52
O
C trong vòng 4 tiếng là có thể loại Lxx ra khỏi vật liệu trồng.
Dùng giống kháng với bệnh cằn mía gốc.
2.4.7. Các phƣơng pháp chẩn đoán bệnh cằn mía gốc trên cây mía

tích. 96 mẫu dịch chiết đã trộn với PBS đƣợc lọc qua màng màng lọc NCM kích thƣớc
lỗ 0,45 μm trên thiết bị lọc. Tháo màng lọc ra khỏi thiết bị và đem sấy ở 80
O
C trong 60
phút trƣớc khi đem nhuộm bằng phƣơng pháp EIA/TBIA. Các phản ứng dƣơng tính
đƣợc nhận diện bằng các đốm màu xanh đậm trên màng.
 Evaporative - binding Enzym Linked immunosorbent assay (EB - ELISA)
Phƣơng pháp EB - ELISA do Croft và ctv đƣa ra năm 1994 để chẩn đoán RSD.
Dịch chiết nƣớc mía thu đƣợc ly tâm ở 3000 vòng trong 15 phút hay 13000 vòng trong
5 phút. Dịch nổi đƣợc loại bỏ và tái huyền phù phần cặn lắng bằng 550 μl dịch đệm.
Mẫu phân tích đƣợc cho bay hơi hoàn toàn trong buồng ủ thoáng khí ở 35
0
C. Sau khi ủ
mẫu đƣợc đem đổ đĩa với hỗn hợp sữa không kem và kháng thể.
Phƣơng pháp EB - EIA có thể phát hiện vi khuẩn nuôi cấy trong môi trƣờng với
mật độ thấp hơn 10
5
tế bào/ml và 5.10
5
tế bào/trong dịch nhiễm.
 Liquid Transfer Enzyme immunoassay (LT - EIA)
Leaman và ctv (1991) sử dụng phƣơng pháp LT- EIA để chẩn đoán RSD và so
sánh phƣơng pháp này với phƣơng pháp FADCF. LT - EIA phát hiện đƣợc Lxx ở mật
độ 5.10
1
tế bào/ml chiết và cho độ chính xác đến 98%. FADCF có khả năng phát hiện
5.10
1
tế bào/ml và với độ chính xác đến 100%. Tuy nhiên, FADCF khó có khả năng
thực hiện đƣợc trên nhiều mẫu cùng lúc. Phƣơng pháp LT - EIA thích hợp cho việc

suất mía 30 - 40% tại quốc gia này.
- Jang và Zhuo (2002) phát hiện đƣợc SCMV gây bệnh trên bắp ở Trung Quốc
bằng phƣơng pháp RT - PCR.
 Bệnh cằn mía gốc
- Năm 1945, Steind đã có những báo cáo đầu tiên về triệu chứng của bệnh tại Australia.
- Năm 1980, Davis tiến hành nuôi cấy vi khuẩn Lxx 20 - Năm 1998, Y Pan và các cộng sự đã đƣa ra protocol để chẩn đoán Lxx dựa vào
cặp mồi Cxx trong dịch khuẩn lạc nuôi cấy và trong dịch chiết nƣớc mía.
- Năm 2003, Stevens Brumbley đã phát triển cặp mồi để phát hiện Lxx trong dịch
chiết nƣớc mía có tính đặc hiệu hơn và đƣợc chứng minh là có độ nhạy cao.
- Năm 2004, Luis E. A. Camargo và ctv đã giải đƣợc trình từ genome của vi
khuẩn Gram dƣơng Lxx tác nhân gây bệnh trên cây mía.
- Viện khoa học nông nghiệp Tây Nam Trung Quốc năm 2004 cũng đã phát hiện
đƣợc vi khuẩn Lxx ở Quảng Tây bằng kỹ thuật PCR.
2.5.2. Trong nƣớc
 Bệnh khảm lá mía
Nƣớc ta do điều kiện lịch sử hình thành nên việc nghiên cứu bệnh hại mía nói
chung và bệnh khảm lá mía nói riêng còn rất mới mẻ so với các nƣớc trong khu vực,
cụ thể là:
- Theo nghiên cứu của Đỗ Ngọc Diệp và ctv (1987) đã kết luận rằng bệnh khảm
lá mía ở nƣớc ta chỉ xuất hiện rải rác, thiệt hại chƣa ở mức đáng quan tâm.
Bệnh sau đó đƣợc công bố gây hại vào năm 1996 (Lê Lƣơng Tề và Vũ Triệu
Mân, 1999)
- Nguyễn Huy Ƣớc (1999) cũng đã đề cập đến 4 bệnh virus phổ biến trên mía,
trong đó có bệnh khảm mía và đƣa ra một số phƣơng pháp phòng trừ.

22 Phần 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Nội dung nghiên cứu
Đề tài thực hiện gồm có 2 nội dung chính sau:
- Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên một số giống mía sản
xuất và nhập nội tại Trung tâm nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng.
- Bƣớc đầu nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR trên một
số giống mía sản xuất tại TTNCMĐ và nông trƣờng Thọ Vực.
+ Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng pháp
nhuộm STM.
+ Khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình nuôi cấy vi khuẩn Lxx và
nhận dạng khuẩn lạc của nó trên môi trƣờng nuôi cấy.
+ PCR phát hiện vi khuẩn Lxx trong dịch chiết nƣớc mía.
3.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 10 tháng 05 đến ngày 10 tháng 08 năm 2006.
Địa điểm thực hiện: Phòng Công Nghệ Sinh Học Thực Vật - Trung tâm Phân tích
Thí nghiệm (TTPT) Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm
nghiên cứu mía đƣờng tỉnh Bình Dƣơng và nông trƣờng ThọVực tỉnh Đồng Nai.
3.3. Vật liệu nghiên cứu
3.3.1. Các giống mía nghiên cứu
6 giống mía sản xuất đƣợc trồng tại TTNCMĐ gồm: C90-127, VN84-4137,
DLM24, R570, VN85-1427, ROC26.
10 giống mía Thái Lan nhập nội năm 2005 là: KU00-1-58, K95-2-156, KU00-1-92,
K95-161, K95-156, KU60-1, U-THONG483, K95-50, KU98-009 , KU60-2.

2
, dNTPs, polyvinyl pyrolidone (PVP), primer C2.
- Hóa chất sử dụng trong điện di: Agarose, TAE 0,5X (Tris acetate 40 mM;
EDTA 0,1 mM; pH 8), blue/orange loading dye 6X (Promega), ethium bromide
(nồng độ 5.10
-3
% theo thể tích).
3.3.5. Thiết bị và dụng cụ
- Cối chày, eppendorf, bình cồn, bông gòn, đĩa petri, ống đong, dao, ống bơm.
- Micropipet 10-100-1000 μl, đầu típ các loại, eppendorf (các loại).
- Đĩa ELISA, máy rửa ELISA, tủ ủ, máy đọc ELISA, máy in.
- Nồi hấp vô trùng (autoclave), tủ sấy, tủ cấy vô trùng (microflow).
- Máy cất nƣớc, máy đo pH, máy khấy từ, máy đánh sóng, máy ly tâm.
- Que trang, que cấy các loại, bercher, màng lọc vô trùng (0,2 và 0,45 μm)
- Máy PCR, bồn điện di, lò viba, máy chụp gel, kính hiển vi quang học.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.5. Phƣơng pháp điều tra lấy mẫu
Để đảm bảo tính ngẫu nhiên trong quá trình thí nghiệm thì công tác điều tra lấy
mẫu trên mỗi giống đƣợc thực hiện nhƣ sau:
- Liên hệ bộ môn Bảo vệ thực vật và bộ môn giống ở TTNCMĐ để xác định các
giống mía cần thu thập và lấy mẫu.
- Tại mỗi ruộng điều tra (trung bình là 1 hecta) chọn 5 điểm khảo sát.
- Lấy mẫu ngẫu nhiên 5 mẫu/ruộng. 1 mẫu lá (hay mẫu thân) dùng trong phân
tích bệnh khảm lá mía hay cằn mía gốc tại 1 điểm điều tra đƣợc lấy ngẫu nhiên 24 từ 3 cây của 3 hom mía nằm trên 3 hàng xen kẽ nhau (ví dụ nhƣ hàng 1, 3, 5

bằng kéo (có sự vô trùng bằng cồn sau mỗi lần cắt mẫu) để dễ dàng nghiền mẫu. Cụ
thể quy trình làm đƣợc tóm tắt ở Sơ đồ 3.2.

1

2

5 4

3 25 Mẫu lá mía

Cân 0,5 g

Cắt nhỏ

Cho vào cối nghiền + Extractionbuffer (2,5ml)

Nghiền


B
Substrate
BF
1
4
7
10
13
16
19
22
25

C
Substrate
BF
1
4
7
10

26

F
Substrate
NC
3
6
9
12
15
18
21
24
27

G
Substrate
NC
3
6
9
12
15
18
21
24
27

H


tƣơng đƣơng trong suốt quá trình phân tích. Ủ đĩa ở 37
O
C trong vòng 2 giờ. Sau
đó rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 2: Cho 100 μl dịch đệm ly trích vào mỗi giếng BF, pha đối chứng dƣơng
và đối chứng âm trong 1ml nƣớc cất siêu sạch, cho 100 μl đối chứng âm vào
giếng NC và 100 μl đối chứng dƣơng vào giếng PC. Với các giếng mẫu, cho
100 μl dịch trích mẫu ở giai đoạn ly trích vào mỗi giếng. Ủ đĩa ở 4
O
C qua đêm.
Rửa đĩa 3 lần với dung dịch PBS - Tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 3: Pha dung dịch kháng thể gắn enzym đến nồng độ 1/100. Cho 100 μl
hỗn hợp trên vào giếng BF, NC, PC, và các giếng mẫu. Ủ đĩa ở 37
O
C trong
vòng 2 giờ. Rửa đĩa 2 lần bằng dung dịch PBS - tween bằng máy rửa ELISA.
- Bƣớc 4: Hòa tan pNPP dạng viên trong dung dịch đệm, cho vào tất cả các giếng
substrate, BF, NC, PC và các giếng mẫu với thể tích 100 μl/giếng. Ủ đĩa ở 37
O
C
trong 30 phút, đọc kết quả bằng máy đọc ELISA hoặc quan sát sự đổi màu của
giếng bằng mắt thƣờng. Sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ đọc lại kết quả ELISA.
 Các mẫu lá mía đƣợc chẩn đoán có nhiễm bệnh hay không dựa vào:
- Sự đổi màu trong phản ứng DAS-ELISA: giếng nào nếu màu vàng giống mẫu
đối chứng dƣơng thì mẫu đó dƣơng tính (+), bị nhiễm SCMV. Các giếng không
màu trùng với giếng đối chứng âm là mẫu âm tính (-), sạch bệnh khảm lá mía.
- Kết quả đọc bằng máy đọc ELISA.

O
và nƣớc cất). Để khoảng
30 phút lấy ra và gọt lấy phần ruột mía phía trong (cách gốc khoảng 5 cm). Gọt mỏng
ngang thân mía đem soi trên kính hiển vi ở độ phóng đại 40 - 100 lần, thu đƣợc kết quả
các mạch dẫn có màu đỏ hoặc màu vàng. Chỉ tiêu đánh giá nhƣ sau:
- < 70 % mạch đỏ: Giống nhiễm nặng. 28 - 70 – 84,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm trung bình.
- 85 – 99,9 % mạch đỏ: Giống nhiễm nhẹ.
- 100 % mạch đỏ: Giống khỏe mạnh.
(Trích dẫn: Hà Đình Tuấn, 2004).
3.4.5. Phƣơng pháp nuôi cấy và nhận dạng khuẩn lạc vi khuẩn Lxx
Thành phần môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn Lxx gồm các thành phần sau:
Thành phần hấp
- Nƣớc cất = 1000 ml
- Bacto agar = 17 g
- Pepton = 8 g
- K
2
HPO4 = 1 g
- KH
2
PO4 = 1 g
- MgSO
4
.7H
29 3.4.6. Phƣơng pháp PCR phát hiện vi khuẩn Lxx
 Phƣơng pháp chuẩn bị DNA mẫu cho PCR trực tiếp: Dịch chiết từ thân mía
(100 μl) đƣợc đem ly tâm 20.000 vòng trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Dịch
lắng thu đƣợc rửa hai lần bằng nƣớc cất vô trùng (100 μl) trƣớc khi tái huyền
phù lại với nƣớc cất vô trùng (100 μl). Toàn bộ dung dịch đƣợc đun sôi trong
vòng 5 phút và làm lạnh nhanh trong vòng 10 phút. Một thể tích khoảng 2 μl
của dịch này đƣợc nhƣ mẫu để chạy phản ứng PCR
 PCR phát hiện Lxx dựa vào cặp mồi và quy trình của Stevens Brumbley
(2003) gồm các thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt cho ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Thành phần các chất trong phản ứng PCR và chu kỳ nhiệt
Sản phẩm PCR sau phản ứng đƣợc điện di trên gel agarose 1,5 % (w/v), với
ethidium bromide trong dung dịch đệm TAE 1X , hiệu điện thế là 90V trong 20 phút.
Chỉ tiêu đánh giá: Sự xuất hiện băng DNA khuyếch đại chuyên biệt (520 bp) của vi
khuẩn trên gel điện di.
 Thực hiện phản ứng PCR
- Thí nghiệm 1: PCR sử dụng quy trình chuẩn bị mẫu, thành phần các chất
phản ứng, và chu kỳ nhiệt do S. Brumbley (2003) đƣa ra.
Hóa chất
Nồng độ
đầu
Nồng độ
cuối
Thể tích/
phản ứng( μl)
Chu kỳ nhiệt

2,5
3
0,24
2,5
2,5
2,5

0,2
2
9,56 96 – 5 phút – 1 chu kỳ
94 – 15 giây
57 – 30 giây 40 chu kỳ
72 – 30 giây
72 – 10 phút – 1 chu kỳ

Tổng thể tích 25 μl
30 - Thí nghiệm 2: Khảo sát hiệu quả của hai phƣơng pháp chuẩn bị mẫu: Biến
tính bằng nhiệt và li trích DNA vi khuẩn Lxx.
Đo OD sản phẩm dịch chiết biến tính và thêm vào thành phần phản ứng
PCR
Lọc dịch chiết bằng màng lọc 0,4 μm trƣớc khi biến tính

+ Bƣớc 8: Rửa nhẹ gel dƣới vòi nƣớc chuyên dụng.
+ Bƣớc 9: Đọc kết quả dƣới tia UV, thẩm định kết quả với marker.
+ Bƣớc 10: Chụp bản gel để lƣu lại kết quả. 31 Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA
Kiểm tra và phát hiện bệnh khảm lá mía bằng kỹ thuật ELISA trên 6 giống mía sản
xuất và 10 giống nhập nội tại TTNCMĐ.
 Kiểm tra bằng phƣơng pháp nhìn trực tiếp bằng mắt thƣờng: quan sát sự đổi
màu của các giếng tuy nhiên trong 5 đĩa phân tích thì chỉ thấy giếng đối chứng
dƣơng xuất hiện màu vàng, còn tất cả các giếng còn lại đều không có màu. Kết
quả lập lại tƣơng tự sau khi kiểm tra lại sau 30 phút, 1 giờ, 2 giờ (hình 4.1).
- Kết luận: Tất cả các mẫu chẩn đoán đều âm tính (-) với SCMV. A B

Hình 4.1. Kết quả chẩn đoán SCMV qua quan sát sự đổi màu trên đĩa ELISA.
Chú thích: A: 2 giếng đối chứng dương có màu vàng
B: 2 giếng đối chứng âm không màu.
 Kiểm tra bằng máy đọc ELISA: Kết quả cho ra âm tính với tất cả các mẫu
phân tích, ngoại trừ đối chứng dƣơng (PC) là ra kết quả dƣơng tính (+). Kết

nhiều. Do vậy chƣa thể kết luận đƣợc toàn bộ các giống mía đƣợc trồng tại đây là
không bị nhiễm bệnh.
Do vậy để chứng minh chính xác tác nhân gây bệnh là SCMV cần phải có những
nghiên cứu sâu hơn bằng kỹ thuật sinh học phân tử, cụ thể là kỹ thuật RT - PCR. Để
tiến hành nghiên cứu này cần phải thực hiện ly trích RNA virus từ lá cây mía bị bệnh
khảm lá mía, sau đó tiến hành tổng hợp cDNA và thực hiện phản ứng PCR với cặp
mồi chuyên biệt đƣợc thiết kế nhằm phát hiện SCMV.
4.2. Nghiên cứu phát hiện bệnh cằn mía gốc bằng kỹ thuật PCR
4.2.1. Phát hiện Lxx bằng phƣơng pháp quan sát dƣới kính hiển vi và phƣơng
pháp nhuộm STM.
Công tác điều tra và phát hiện bệnh cằn mía gốc đƣợc thực hiện trên 6 giống mía
sản xuất tại TTNCMĐ và 5 giống mía tại nông trƣờng Thọ Vực bằng phƣơng pháp
quan sát dƣới kính hiển vi (Hình 4.2) và nhuộm màu STM (Hình 4.3).