54 Hình 4.5: Đối chứng âm
trên gan tụy tôm lớn, X40
Hình 4.6: Đối chứng dƣơng
trên mang tôm lớn, X10
Hình 4.7: ISH phát hiện WSSV
trên mẫu gan tụy tôm lớn, X10
Hình 4.8: ISH phát hiện WSSV
trên mẫu mang tôm lớn, X40
nhuộm bổ sung.
nhuộm bổ sung.
Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau:
Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi trong nhân tạo kết tủa màu xanh đến đen, những
tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng, nhân không bị trƣơng to và
bắt màu thuốc nhuộm bổ sung (màu cam).
Mẫu âm tính không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y (màu
thuốc
nhuộm
bổ
sung)
và có
màu
cam
sau quá
trình lai.


ràng, tín hiệu lai thu đƣợc rất nhiều và rõ khi quan sát dƣới KHV quang học chứng tỏ
rằng quá trình lai đƣợc tiến hành rất tốt và không bị ngoại nhiễm.
Trên cơ sở thử nghiệm lại quy trình In situ hybridization, chúng tôi nhận thấy
rằng khả năng chẩn đoán bệnh đốm trắng trên tôm sú của phƣơng pháp này rất hiệu
quả, với độ chính xác cao và kết quả thu đƣợc ổn định. Do đó, chúng tôi tiến hành ứng
dụng phƣơng pháp này để chẩn đoán và phát hiện mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú
nuôi ở các giai đoạn postlarvae và thƣơng phẩm góp phần vào việc kiểm soát và hạn
chế kịp thời những tác hại do WSSV mang lại. Chẩn đoán theo phƣơng pháp này sẽ
khắc phục đƣợc tính kém đặc hiệu của mô học và tránh đƣợc hiện tƣợng dƣơng tính
giả của PCR.
IV.2.2 Kết quả ứng dụng bộ kit để tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV áp dụng
trong phòng thí nghiệm
IV.2.2.1 Kết quả thí nghiệm theo đúng quy trình của bộ kit nhưng có thay đổi một
số hóa chất thông dụng không có trong bộ kit
Theo cách bố trí này chúng tôi cũng thực hiện lại thí nghiệm trên ba mẫu tôm 1,
2 và 3 trên, đối chứng dƣơng và đối chứng âm. Ở đây, chúng tôi dùng cồn tuyệt đối
(Việt Nam), xylene và paraformaldehyde (Trung Quốc) trong quy trình lai. Sau khi
thực hiện thí nghiệm, chúng tôi thu đƣợc kết quả sau: 56

mô rõ khi quan sát dƣới
KHV.
3
+++
+++
Mẫu dƣơng (+++), lát cắt
không bị trôi và nhuộm
màu rõ.
Mẫu dƣơng (+++), cấu
trúc mô rất rõ khi quan sát
dƣới KHV.
Đối
chứng
dƣơng
+++
+++
Mẫu dƣơng (+++), cấu
trúc mô rất rõ và nhuộm
màu tốt.
Mẫu dƣơng (+++), cấu
trúc mô rất rõ và lát cắt
không bị trôi.
Đối
chứng
âm
-
-
Không phát hiện tín hiệu
lai, mẫu không bị nhiễm
bẩn và chỉ bắt màu thuốc

Bảng 4.10: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm postlarvae
Mẫu
Mô
học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Cấu trúc mô của mẫu hơi mờ
2
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt mẫu không bị trôi
3
+
+
+
+
Mẫu rõ, nhuộm màu tốt
4
+
+

-
Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu
chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ
sung.
Kết quả trên tôm thƣơng phẩm
Bảng 4.11: Kết quả thí nghiệm xử lý mẫu nhanh trên tôm thƣơng phẩm
Mẫu
Mô
học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
++
++
++
Cấu trúc mô của mẫu rất rõ, nhuộm
màu tốt.
2
+
++

sát dƣới KHV.
Đối
-
-
-
-
Mẫu rõ, không bị nhiễm tạp và mẫu
59 Hình 4.9: Mẫu mô học và ISH làm theo quy trình xử lý nhanh
chứng
âm
chỉ nhuộm màu của thuốc nhuộm bổ
sung.

Qua hai bảng kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng kết quả chẩn đoán thu đƣợc
từ ba phƣơng pháp trên trùng hợp hoàn toàn với nhau. Ở hai mẫu tôm postlarvae (mẫu
1 và 4) và một mẫu tôm thƣơng phẩm (mẫu 5) khi xử lý nhanh cho kết quả lai chƣa tốt
có thể do một số khâu trong quy trình xử lý mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt. Mẫu số 5
trên postlarvae và mẫu số 4 trên tôm thƣơng phẩm cho kết quả lai tốt, nhƣng cấu tạo
mô không rõ có thể do ta thực hiện xử lý mẫu chƣa tốt làm hƣ cấu tạo của mô. Điều
này cũng có thể do trong quá trình lai, chúng ta cắt mẫu bằng Proteinase K quá lâu
hoặc thao tác cắt mẫu chƣa đƣợc thực hiện tốt nên cấu trúc mẫu mô không còn rõ nhƣ
ban đầu.
các giai đoạn quyết định nhƣ giai đoạn chuyển từ cồn tuyệt đối qua xylene và từ
xylene qua paraffin. Nếu tuân thủ đúng các bƣớc này, mẫu mô thu đƣợc sau xử lý sẽ
giống với mẫu mô xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng. IV.2.2.3 Trường hợp biến tính mẫu và probe trước khi lai
Nếu lai theo quy trình của bộ kit thì probe phải đƣợc biến tính ở 95
0
C trong 10
phút, làm lạnh nhanh và giữ ở 4
0
C cho đến khi cho lên mô lai. Khi lai, ta cho mẫu dò
lên mẫu mô và thực hiện biến tính một lần nữa ở 95
0
C trong 6 phút. Trong thí nghiệm
này, chúng tôi thực hiện biến tính mẫu lai và probe đồng thời trên lame ở 95
0
C trong 6
phút. Quy trình này đƣợc thực hiện trên bàn lai có điều chỉnh nhiệt độ. Mẫu thực hiện
thí nghiệm này đƣợc xử lý theo quy trình xử lý bình thƣờng và đã đƣợc phƣơng pháp
mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV. Thí nghiệm thực hiện nhƣ bố trí
trên và thu đƣợc kết quả sau hai lần thực hiện nhƣ sau:
Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.12: Kết quả thí nghiệm biến tính mẫu và probe trƣớc khi lai trên
postlarvae
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét

+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
không bị trôi
5
+
+
+
+
Mẫu rõ
Đối chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Mẫu rất rõ, cấu trúc mô
giữ đƣợc hình dạng đầu.
Đối chứng âm
-
-
-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp. Kết quả trên tôm thƣơng phẩm

+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
không bị trôi.
5
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
62 không bị trôi.
Đối chứng
dƣơng
+++
+++
+++
+++
Mẫu lai tốt, cấu trúc mô
giữ đƣợc hình dạng đầu.
Đối chứng âm
-
-
63 có kết quả mô học và PCR dƣơng tính với WSSV. Kết quả sau hai lần thí nghiệm nhƣ
sau:
Kết quả trên tôm postlarvae
Bảng 4.14: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe
trƣớc khi lai trên tôm postlarvae
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Tín hiệu lai rõ, không có
màu nền.
2
+
+
+
+
Cấu trúc mô rất rõ, màu

-
-
-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp,
chỉ nhuộm màu bổ sung.

Kết quả trên tôm thƣơng phẩm
Bảng 4.15: Kết quả thí nghiệm kết hợp xử lý nhanh với biến tính mẫu và probe
trƣớc khi lai trên tôm thƣơng phẩm
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
Nhận xét
Lần 1
Lần 2
1
+
+
+
+
Mẫu rõ, lát cắt trên lame
64 Hình 4.10: Mẫu lai trên mang khi kết hợp xử lý nhanh với biến

dƣơng
+++
+++
+++
+++
Kết quả lai rất tốt, cấu
trúc mô rõ và đẹp, không
có màu nền.
Đối chứng âm
-
-
-
-
Mẫu không bị nhiễm tạp,
chỉ nhuộm màu bổ sung.
Qua kết quả trên chúng tôi nhận thấy rằng khi kết hợp quy trình xử lý mẫu
nhanh và biến tính mẫu và probe trên cùng một lame khi thực hiện lai đều cho kết quả
trùng hợp với kết quả của phƣơng pháp PCR và mô học. Mức độ trùng hợp giữa ba
phƣơng pháp đạt 100% sau hai lần lặp lại thí nghiệm. Mẫu mô thu đƣợc sau khi lai đa
số rõ nhƣng có một số trƣờng hợp mẫu mô không rõ do thao tác thực hiện chƣa tốt,
hoặc do hóa chất rửa mẫu lai mất hoạt tính hay có thể do nhuộm màu bổ sung chƣa đạt
yêu cầu…nhƣng những điều này không ảnh hƣởng nhiều đến kết quả lai và chúng tôi
có thể
khắc phục
đƣợc.
Xử lý mẫu
Mẫu P. vannamei
Cố định (R-F)
Xử lý mẫu trƣớc khi lai
Đúc, cắt và đính lên lame
Lai, thực hiện biến tính probe ở
95
0
C trong 6 phút, giữ lạnh ở 4
0
C.
khi lai cho dung dịch lai có probe
đã biến tính lên mẫu và biến tính
mẫu ở 70
0
C trong 5 phút .
Rửa và phát hiện tín hiệu lai
Mẫu P. monodon
Cố định (Davidson)
Xử lý nhanh giảm thời gian
Tẩm paraffin
Đúc, cắt, đính mẫu
Lai, thực hiện biến tính
mẫu và probe đồng thời
trên lame ở 95
0
C trong 5
phút, ủ qua đêm ở 42
0
C.

Mô học
PCR
ISH
1
-
+
-
2
-
+
-
3
-
+
-
4
-
+
-
5
-
+
-
6
-
-
-
7
-
-

-
-
-
Đối chứng dƣơng
+++
+++
+++
Đối chứng âm
-
-
-
68 Sau khi thực hiện thí nghiệm so sánh trên, chúng tôi nhận thấy rằng tất cả các
mẫu đem kiểm tra đều âm tính với TSV. Nhìn chung, kết quả chẩn đoán của ba
phƣơng pháp đa số trùng hợp với nhau, kết quả giữa mô học và ISH trùng hợp nhau
100% (15/15). Trong số 15 mẫu trên thì có 5 mẫu đầu có kết quả PCR dƣơng nhƣng
mô học và ISH đều âm tính. Hiện tƣợng không trùng hợp này có thể do hiện tƣợng
dƣơng tính giả của PCR, hoặc có thể do chúng tôi thực hiện thu mẫu chƣa đảm bảo
chính xác, mẫu thu đƣợc chƣa đại diện đƣợc cho cả quần thể tôm nuôi tại trại giống
nên cùng một mẫu khi chia thành nhiều phần, mỗi phần thực hiện một phƣơng pháp
chẩn đoán khác nhau thƣờng cho kết quả không trùng hợp với nhau. Hiện tƣợng này
cũng có thể do probe bị bất hoạt nhƣng trƣờng hợp này rất ít xảy ra vì khi lai chúng tôi
có thực hiện song song một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm, kết quả vẫn phát
hiện tín hiệu lai trên đối chứng dƣơng và đối chứng âm không bị nhiễm tạp; điều này
một lần nữa khẳng định tính ổn định của phƣơng pháp ISH. Trong thí nghiệm này kết

6
+
++
+
7
+
++
-
8
+
-
-
69 9
+
-
-
10
+
-
-
11
-
-
-

rất nhiều. Nhìn chung kết quả mà chúng tôi thu đƣợc không chênh lệch nhiều giữa ba
phƣơng pháp, một số trƣờng hợp không trùng hợp giữa ba phƣơng pháp có thể đƣợc
giải thích nhƣ sau:
Trƣờng hợp mô dƣơng, ISH dƣơng và PCR âm nhƣ ở mẫu số 4 và 5. Trƣờng
hợp này có thể do thao tác thực hiện RT – PCR không chính xác, cũng có thể là do
lƣợng RNA tách chiết quá thấp, tạp nhiễm nhiều hay có thể do có sự hiện diện của một
tác nhân ức chế phản ứng PCR nên không phát hiện đƣợc tác nhân gây bệnh trong
mẫu. Ngoài ra hiện tƣợng này cũng có thể do tính đa hình của virus Taura, mặc dù tính
đa hình này rất ít xảy ra nhƣng khi nó xuất hiện thì có thể gây ra hiện tƣợng âm tính
giả.
Trƣờng hợp mô dƣơng, PCR dƣơng nhƣng ISH âm ở mẫu số 7. Hiện tƣợng này
có thể mẫu dò bị bất hoạt nhƣng điều này không thể xảy ra vì có tín hiệu lai trên đối
chứng dƣơng. Vì vậy, nguyên nhân của hiện tƣợng này có thể do hiện tƣợng ngoại
70 A
B
C
D
E
F
Hình 4.11: Một số hình ảnh thu đƣợc khi chẩn đoán TSV đồng thời bằng ba phƣơng
pháp trên tôm lớn. Hình A: ISH dƣơng tính trên chân bơi, X10; hình B: ISH dƣơng
tính trên mang, X40; hình C: ISH dƣơng tính trên phụ bộ, X10; hình D: mô học
dƣơng tính trên mang, X100; hình E: ISH dƣơng tính trên gan tụy, X40; hình F: ISH
dƣơng tính trên biểu mô, X10.

các tỉnh Sóc Trăng, Cà Mau, Bạc Liêu và thực hiện chẩn đoán đồng thời các phƣơng
pháp mô học, PCR, ISH. Kết quả thu đƣợc nhƣ sau:
IV.3.2.1 Đối tôm postlarvae
Bảng 4.18: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên postlarvae
Mẫu
Mô học
PCR
ISH
1
+
++
+
2
++
-
+
3
+
-
-
4
+
+
+
5
-
+
-
6
+

14
-
-
-
15
-
-
-
Đối chứng dƣơng
+++
+++
+++
Đối chứng âm
-
-
-

72 IV.3.2.2 Đối với tôm thương phẩm
Bảng 4.19: Kết quả thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên tôm thƣơng
phẩm
Mẫu

-
8
-
-
-
9
-
-
-
10
-
-
-
11
+
+
-
12
+
+
+
13
-
+
+
14
-
+
+
15

của tôm postlarvae và mẫu 13, 14 của tôm thƣơng phẩm. Hiện tƣợng này có khả năng
do tỷ lệ và cƣờng độ nhiễm WSSV trên tôm thấp, bệnh chỉ biểu hiện ở một số tế bào.
Trong quá trình nhuộm mô, lát cắt mô có kích thƣớc nhỏ nên không đi qua hết các tế
bào bị nhiễm bệnh nên có khả năng không tìm thấy bệnh. Ngoài ra với phƣơng pháp
mô học, ta chỉ xác định đƣợc bệnh khi bệnh đã biểu hiện ra các tế bào, còn ở giai đoạn
bệnh mới phát dấu hiệu bệnh lý chƣa đƣợc biểu hiện ở các bào quan thì mô học không
thể định dạng đƣợc bệnh. Trong khi đó, với phƣơng pháp PCR và ISH thì chỉ cần tôm
có dấu hiệu bệnh dù là ở giai đoạn đầu của qua trình nhiễm bệnh thì PCR và ISH vẫn
có thể xác định đƣợc bệnh. Qua đó ta có thể nói đƣợc là phƣơng pháp PCR và ISH có
độ nhạy cao hơn mô học truyền thống.
Trƣờng hợp PCR và ISH âm nhƣng mô học dƣơng nhƣ ở mẫu số 3 của tôm
portlarvae. Hiện tƣợng này có thể do có một tác nhân gây bệnh khác có biểu hiện bệnh
lý trên tế bào tƣơng tự nhƣ dấu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng. Do đó, bằng phƣơng
pháp mô học ta có thể dễ nhầm lẫn trong việc phát hiện mầm bệnh do WSSV trên tôm
sú P. monodon. Điều này khẳng định một lần nữa phƣơng pháp mô học có độ chính
xác kém hơn PCR và ISH.
Trƣờng hợp PCR cho kết quả dƣơng tính nhƣng ISH và mô học cho kết quả âm
tính ở mẫu số 5 của postlarvae. Điều này có thể do hai khả năng. Thứ nhất là do ngoại
nhiễm trong quá trình làm PCR hoặc do primer bắt cặp không đặc hiệu với DNA của
tác nhân gây bệnh. Thứ hai là do mẫu dò (probe) đã bị bất hoạt nên không phát hiện
74 đƣợc tác nhân gây bệnh và ở phƣơng pháp mô học do tôm bị nhiễm bệnh ở giai đoạn
đầu, bệnh chƣa biểu hiện ra các bào quan nên mô học không phát hiện đƣợc bệnh. Cả
hai khả năng trên đều có thể xảy ra nhƣng xác suất khả năng thứ nhất xảy ra cao hơn vì
khi thực hiện PCR rất dễ bị ngoại nhiễm và khi thực hiện lai chúng tôi có làm đối

kỳ tổ chức nào nhƣ mang, gan tụy, dạ dày, ruột, phụ bộ…của cơ thể khi tôm bị bệnh,
nhƣng mang là cơ quan bị virus tấn công nhiều nhất. Đa số các mẫu lai thu đƣợc đều
rõ, ít có các tín hiệu nền, các cơ quan của tôm đều thấy rõ nên đây là phƣơng pháp rất
hữu hiệu dùng để chẩn đoán mầm bệnh đốm trắng trên tôm sú.
IV.5 Nhận xét chung
Sau khi thực hiện chẩn đoán mầm bệnh WSSV trên P. monodon và TSV trên P.
vannamei, chúng tôi có một số nhận xét sau:
Do probe mà bộ kit cung cấp có dạng DNA mạch đôi nên khi thực hiện chẩn
đoán mầm bệnh WSSV dễ dàng hơn vì cả probe và WSSV đều có cấu trúc DNA mạch
đôi. Do đó, chúng tôi có thể bỏ qua giai đoạn biến tính probe riêng mà thực hiện biến
tính mẫu và probe đồng thời trên lame. Ở mầm bệnh do TSV thì hai thao tác này phải
thực hiện tách riêng.
76 Tín hiệu lai mà chúng tôi nhận đƣợc ở tiêu bản WSSV rõ ràng hơn rất nhiều tín
hiệu lai từ tiêu bản TSV. Sở dĩ nhƣ vậy vì là do virus đốm trắng có vật chất di truyền
là DNA nên DNA của virus tập trung trong nhân và làm cho nhân trƣơng to; do đó tín
hiệu lai tạp trung trong nhân và đậm hơn rất nhiều. Còn đối với TSV, là virus RNA
nên RNA của virus tập trung trong tế bào chất, do đó các tín hiệu lai nhận đƣợc không
tập trung, rải rác trong tế bào chất nên tín hiệu lai mờ, không rõ nhƣ ở WSSV.
ISH khi thực hiện trên DNA đơn giản hơn rất nhiều khi thực hiện trên RNA.
Quy trình ISH chuẩn dùng trong nghiên cứu này gồm năm bƣớc chính: chuẩn bị
probe, chuẩn bị mẫu mô, xử lý mẫu trƣớc khi lai, lai và rửa mẫu và bƣớc sau cùng là
phát hiện các tín hiệu sau khi lai. Trong thí nghiệm này, chúng tôi sử dụng bộ kit do
công ty Diagxotics của Mỹ cung cấp, nên không trải qua bƣớc chuẩn bị probe mà sử
dụng probe là DNA mạch đôi đƣợc đánh dấu bằng Digoxigenin do công ty cung cấp.

Mẫu ít bị tạp nhiễm trong khi thao tác mẫu.
Phƣơng pháp này rất đặc hiệu, không bị nhầm lẫn với các mầm bệnh khác.
Có thể thực hiện chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu.
IV.6.2 Khó khăn
Mẫu dễ bị trôi do thao tác bơm hóa chất lên mẫu với áp lực mạnh.
Mẫu dễ bị khô trong quá trình làm, do thao tác chậm.
Nhuộm màu chƣa làm nổi bậc đƣợc mẫu do hóa chất nhuộm đã bị mất hoạt
tính.
Proteinase K có thể bị mất hoạt tính do tan giá lặp lại nhiều lần.
Probe là đoạn DNA mạch đôi nên độ nhạy kém hơn các loại probe khác.
Đối với những mẫu có mức độ nhiễm bệnh thấp, tín hiệu lai phát ra rất yếu nên.
gặp khó khăn khi phát hiện dƣới kính hiển vi quang học.

IV.7 Ƣu nhƣợc điểm của phƣơng pháp In situ hybridization
IV.7.1 Ƣu điểm
Độ đặc hiệu của phƣơng pháp cao
Phƣơng pháp này không bị tạp nhiễm nhƣ PCR
Chúng ta có thể chẩn đoán đồng thời nhiều mẫu
IV.7.2 Nhƣợc điểm
Mẫu dễ bị hƣ trong quá trình làm.
Đối với những mẫu nhiễm virus với nồng độ thấp, tín hiệu lai phát ra yếu nên
rất khó khăn khi quan sát dƣới kính hiển vi quang học.
78