34

3.4. Phƣơng pháp cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khô, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đó lọc,
dịch lọc được cô cạn dưới áp suất thấp còn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
3.4.1. Điều chế các loại cao
3.4.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung môi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia
thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành
2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na
2
SO
4
, cô cạn dưới áp suất thấp thu được
cao ete dầu hỏa.
3.4.1.2 Điều chế cao CHCl
3
Phần dịch nước còn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung môi
CHCl
3
vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm
khan với Na
2
SO
4
và cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl
3
.
3.4.1.3. Điều chế cao n-Butanol
Phần dịch còn lại sau khi đã trích với CHCl
3


Dịch trích
Ete dầu hỏa Cao CHCl
3

Dịch trích
n - Butanol
Cao n - Butanol

Pha nước
Cao nước

Tận trích với
CHCl
3
; 2 lít - Làm khan với Na
2
SO
4
, Lọc
- Cô cạn dưới áp suất thấp
- Lọ c
- Cô cạ n dưới áp suấ t thấ p

- Làm khan với Na

2
SO
4
10 %/EtOH.
Các phân đoạn giống nhau trên sắc ký lớp mỏng được gộp lại. Tiến hành sắc ký
cột tiếp theo các phân đoạn giống nhau, kết tinh thu được hợp chất sạch.
3.4.3. Xác định cấu trúc của hợp chất đã cô lập đƣợc
Sử dụng phương pháp phổ nghiệm IR, MS,
1
H-NMR,
13
C-NMR…để xác định
cấu trúc.
3.5. Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn
[12],[23],[24],[25]26],[28]

Làm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp để xác định nồng độ ức
chế tối thiểu (MIC = Minimum Inhibitory Concentration) của các loại cao Xuân Hoa
đã cô lập được có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng của vi khuẩn.
Tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên hai chủng vi sinh vật đường
ruột: E. coli ATCC 25922 và Salmonella typhimurium. Nguồn: Salmonella
typhimurium lấy từ viện Pasteur TP.HCM, E. coli ATCC 25922 lấy từ công ty Nam
Khoa.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật sử dụng để tiến hành thử nghiệm là môi trường
BHI.
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của 4 loại cao Xuân Hoa: cao
chloroform, cao ete dầu, cao n-butanol và cao nước.
Dung môi sử dụng để hòa tan 4 loại cao là: dimethylsulfoside (DMSO)
3.5.1. Chuẩn bị môi trƣờng
Cân 11,1 g BHI dạng tinh, cho vào 300 ml nước cất, đun và khuấy nhẹ để môi

lúc này là 800 μg/ml.
- Ống số 3C 700 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 600 μg/ml.
- Ống số 2C 800 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 400 μg/ml.
-Ống số 1C 900 μl mỗi ống. Như vậy nồng độ cao chloroform trong ống nghiệm
lúc này là 200 μg/ml.
Pha loãng các loại cao còn lại
Tiến hành tương tự như qui trình pha loãng cao chloroform. Đánh số thứ tự từ 1B
đến 6B đối với cao n-butanol, 1E đến 6E đối với cao ete dầu, 1H đến 6H đối với cao
nước.

38

3.5.3. Chuẩn bị dung dịch chuẩn độ đục
Dung dịch chuẩn độ đục trong ống Mc Farland 0.5 là dung dịch muối
BaSO
4
.2H
2
O.
a. Dung dịch dự trữ A: (0,048 M)
BaCl
2
.2H
2
O 11,75 g
Nước cất vừa đủ 1000 ml
b. Dung dịch dự trữ B: (0,36 N)
H

BHI
Đ/C
Huyền dịch
Salmonella
Dung dịch
Mc Farland 0,5
Huyền dịch
E. coli
39

Dùng pipette hút 1ml canh vi khuẩn cho vào 9 ml môi trường lỏng BHI. Trộn đều
vi khuẩn vào môi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp
canh vi khuẩn và môi trường BHI.
Tiếp tục dùng pipette hút 3 ml dung dịch vi khuẩn vừa pha loãng ở trên cho vào 3
ống nghiệm chứa 9 ml môi trường lỏng BHI, mỗi ống 1 ml. Trộn đều vi khuẩn vào
môi trường bằng cách dùng pipette hút lên, nhả xuống vài lần hỗn hợp canh vi khuẩn
và môi trường lỏng BHI. Lúc này mật độ vi khuẩn trong mỗi ống nghiệm là
10
6
CFU/ml.
Tiến hành pha loãng như trên đối với cả hai chủng vi sinh vật E. coli ATCC
25922 và Salmonella typhimurium. Sau khi pha loãng ta thu được 3 ống nghiệm chứa
30ml huyền dịch vi khuẩn E. coli 10
6
CFU/ml và 3 ống nghiệm chứa 30ml huyền dịch
vi khuẩn Salmonella 10
6
CFU/ml.
3.5.5. Thử nghiệm
Dùng 2 ống nghiệm để tiến hành thử dung môi. Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống

Cao n-butanol Cao CHCl
3Hình 3.2: Các ống nghiệm đã cấy huyền dịch vi khuẩn vào
Sau khi đã cho huyền dịch vi khuẩn vào, ủ các ống nghiệm của hai nhóm, 2 ống
nghiệm đối chứng và 2 ống nghiệm thử dung môi ở nhiệt độ 37
0
C . Sau 16-20 giờ tiến
hành đọc kết quả.
Quan sát sự thay đổi độ đục của môi trường, sự tạo thành cặn ở đáy của ống
nghiệm và sự tạo thành váng ở bề mặt môi trường.
Sau khi ủ, xác định hai nồng độ kế cận nhau mà vi khuẩn làm đục và không làm
đục môi trường. Chia nhỏ hai nồng độ trên thành nhiều khoảng nồng độ và tiến hành
thử nghiệm như trên.
Sau quá trình thử nghiệm ta xác định được nồng độ ức chế tối thiểu của các loại
cao đối với vi khuẩn thử nghiệm. 41

Phần IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Nguyên liệu


42

Bảng 4.1: Tóm tắt kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa học lá cây Xuân Hoa:

Tên hợp chất
Thuốc thử
Kết quả
Loại dung dịch

Ete
Cồn
Nước
Antraglycosid
KOH 10%
Dung dịch màu đỏ
-
+
-
Flavonoid
HCl

2
SO
4
Màu xanh nhạt
+ Phytosterol
Anhydric
acetic+H
2
SO
4
Chỗ tiếp xúc có
màu nhạt
++
Tinh dầu
Bốc hơi tới cắn
Mùi thơm nhẹ
+ Coumarin
Soi UV
Phát huỳnh quang
+


Saponin
Lắc mạnh
Tạo bọt

Bền
Bền
Liebermann
Có vòng tím nâu
chuyển sang đỏ

++
+
Hợp chất
uronic
Pha loãng EtOH
90%
Tủa bông nhiều ++

Chú thích: ++: rất rõ;+: rõ; -: không có
Nhận xét:
- Từ dịch chiết ete ethylic đã xác định sự hiện diện của các cấu tử hữu cơ
trong lá cây Xuân Hoa là: acid béo, carotenoid, phytosterol, tinh dầu,
coumarin, acid hữu cơ.
- Từ dịch cồn đã xác định được các cấu tử hữu cơ: antraglycosid, flavonoid,
alkaloid, polyphenol, đường khử, antracyanosid, saponin.
- Từ dịch nước đã xác định được các cấu tử hữu cơ: polyphenol, đường khử,
saponin và hợp chất uronic.