43

4.3. Cô lập một số hợp chất hữu cơ từ cây Xuân Hoa
Lấy 500 g mẫu khô, chiết với hệ Soxhlet trong 48 giờ với EtOH 70 %, sau đó lọc,
dịch lọc được cô cạn dưới áp suất thấp còn 1lít, thêm một1 lít nước cất vào dịch lọc.
4.3.1. Điều chế các loại cao
4.3.1.1. Điều chế cao ete dầu hỏa
Cho 1500 ml dung môi ete dầu hỏa vào 2 lít dung dịch mẫu thu được ở trên (chia
thành 5 lần, mỗi lần 300 ml), lắc đều. Lúc này dung dịch trong bình gạn sẽ chia thành
2 lớp, thu phần dịch ở trên, làm khan với Na
2
SO
4
, cô cạn dưới áp suất thấp thu được
cao ete dầu hỏa 5,6 g.
4.3.1.2. Điều chế cao CHCl
3
Phần dịch nước còn lại sau khi đã trích với ete dầu hỏa, cho 1500 ml dung môi
CHCl
3
vào (chia làm 5 lần, mỗi lần 300ml), lắc đều, thu phần dịch ở bên dưới, làm
khan với Na
2
SO
4
và cô cạn dưới áp suất thấp thu được cao CHCl
3
9,8 g.
4.3.1.3. Điều chế cao n-butanol
Phần dịch còn lại sau khi đã trích với CHCl
3

1,98
n-butanol
15,2
3,04
Nước
25,7
5,14
44

0
1
2
3
4
5
6
Ete dầu hỏa Chloroform n-butanol Nước
%

Biểu đồ 4.1: Hiệu suất chiết suất của các loại dung môi
4.3.2. Cô lập một số hợp chất từ cao ete dầu hỏa
Cao ete dầu hỏa sau khi thu được, lấy 3 g để tiến hành chạy sắc ký cột, chất hấp
phụ là silicagel, dung môi giải ly là hỗn hợp ete dầu hỏa và EtOAc với độ phân cực
tăng dần.
Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa cho 15 phân đoạn
Ở phân đoạn 9 với dung môi giải ly Ete dầu : EtOAc 92 : 8 và phân đoạn 10 với
dung môi giải ly E : EtOAc 90 : 10 sau khi cô cạn cho cặn màu vàng nhạt (0,235 g).
Sắc ký lớp mỏng silicagel trên cặn này với hệ dung ly là CHCl
3
: E 9 : 1, thuốc thử

Bảng 4.3 : Kết quả sắc ký cột silicagel trên cao ete dầu hỏa (3g)

Phân
đoạn
Dung ly
Thể tích
(ml)
Trọng lượng
cặn (mg)
Sắc ký lớp mỏng
Ghi chú
1
E(100%)
100
2
E:EtOAc 99:1
200
75
Vệt dài

3
E:EtOAc 98:2
200
86
Vệt dài

4

E:EtOAc 92:8
400
116
2vết,R
f
=0,23;R
f
=0,17
Khảo sát
10
E:EtOAc 90:10
400
119
2vết,R
f
=0,23;R
f
=0,17
Khảo sát
11
E:EtOAc 85:15
600
142
Nhiều vết

12
E:EtOAc 80:20
600
155
Nhiều vết

2
SO
4
10 %/EtOH cho một vết màu nâu R
f
= 0,23. 46

Sơ đồ 4.1: Tóm tắt quá trình sắc ký cột 3 g cao ete dầu hỏa


C (MeOH).
* Phổ khối lƣợng MS (Phụ lục số 1)
m/z: 414 (M
+
); 329; 255; 213; 161; 145; 105; 81; 69.
* Phổ hồng ngoại IR (phụ lục số 2)
ν, cm
-1
:3452,45 (dao động O–H); 2906,52; 2783,90 (Dao động C–H bão hòa);1662,98
(dao động C = C); 12,82,94 (dao động C – O).
* Phổ
1
H-NMR, CDCl
3
, δ, ppm (phụ lục số 3)
5,35 (d, 5Hz, – CH =); 5,14 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; – CH =); 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz; –
CH=); 3,52 (t, >CH – O –); 0,68 – 1,02 H của 6 nhóm –CH
3
.
* Phổ
13
C-NMR kết hợp với kỹ thuật DEPT, CDCl
3
, δ, ppm (phụ lục số 4)
140,77 (>C =); 138,32 (– CH =);129,31 (– CH =); 121,73 (– CH =); 71,83 (CH – O –)
Biện luận cấu trúc S:
S cho phản ứng dương tính với các thuốc thử đặc trưng của triterpen và steroid
như Liebermann Burchard, Salkowski và Noller.
Từ các tín hiệu trên phổ IR (3452,45cm
-1

1
H-NMR cho biết nối đôi – CH = CH – tồn tại dưới dạng trans (dựa vào các
mũi cộng hưởng δ 5,13(dd, 8,5Hz; 14,5Hz) và δ 5,03 (dd, 8,5Hz; 14,5Hz).
Các nhận định ban đầu cho thấy S có thể là stigmasterol, khảo sát kỹ cường độ
các mũi cộng hưởng tại các vị trí δ 5,35; δ 5,13 đến 5,03 và δ 3,52 cho thấy các giá trị
tích phân gần bằng nhau, kết hợp với phổ
13
C- NMR (xuất hiện 42 tín hiệu cộng
48

hưởng) chúng tôi dự đoán S là hỗn hợp của stigmaterol và β-sitosterol với tỉ lệ 1:1,
điều này dựa vào phổ
1
H NMR của các vị trí 5,35; 5,13; 5,03.
Các số liệu phổ
13
C-NMR và DEPT của S được so sánh với các phổ tương ứng
của stigmasterol và β-sitosterol. Kết quả so sánh phổ
13
C-NMR của hợp chất S với
stigmasterol và β-sitosterol (phụ lục 5) cho thấy sự trùng khớp ở các vị trí của cả hai
hợp chất. Như vậy S là hỗn hợp của stigmasterol và β-sitosterol.

β-Sitosterol Stigmasterol

Hình 4.2: Cấu trúc hóa học của β-Sitosterol và Stigmasterol
4.4. Thử nghiệm vi sinh

3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28, 29H
5

16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28,29
49

Bảng 4.4: Kết quả thử nghiệm các loại cao trong khoảng nồng độ 100-600 μg/ml
Loại cao
Ete dầu hỏa
CHCl
3

n-butanol
H
2
O
Nồng dộ (μg/ml)

E.coli
Sal
E.coli

+
+
400
+
+
–
–
+
+
+
+
500
+
+
–
–
+
+
+
+
600
+
+
–
–
+
+
+
+


+
340
–
–
350
–
–
360
–
–
370
–
–
380
–
–
390
–
–

Ghi chú: +: Môi trường nuôi cấy bị đục
–: Môi trường nuôi cấy không bị đục
Hình 4.4: Kết quả thử nghiệm trên E. coli. Hình 4.5: Kết quả thử nghiệm trên Salmonella
Bảng 4.6: Kết luận

C-NMR, DEPT. Hợp chấy S được nhận
danh là hỗn hợp của Stigmasterol và β-sitosterol tỉ lệ 1 : 1.
5.2. Thử nghiệm khả năng kháng khuẩn
Tiến hành thử nghiệm khả năng kháng khuẩn trên hai đối tượng vi sinh là E. coli
ATCC 25922 và Salmonella typhimurium với 4 loại cao: ete dầu hỏa, chloroform, n-
butanol và cao nước.
Kết quả cho thấy chỉ có cao chloroform có khả năng ức chế sự phát triển của hai
chủng vi sinh vật trên.
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của cao chloroform đối với hai chủng vi sinh vật
lần lượt: E. coli ATCC 25922 là 330 μg/ml và Salmonella typhimurium là 340 μg/ml.
II. Đề nghị
Trong khoảng thời gian ngắn làm khóa luận tốt nghiệp những kết quả thu được
chỉ là những kết quả bước đầu. Nếu có thời gian, xin đề nghị tiếp tục nghiên cứu sâu
hơn để có thể tìm hiểu thêm về tác dụng sinh học và thành phần hóa học của cây Xuân
Hoa. Đặt biệt là phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất hữu cơ trên cao
chloroform và thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một số dòng vi khuẩn đường
ruột khác. Từ đó làm cơ sở cho việc chuẩn hóa và tạo ra chế phẩm có khả năng thay
thế kháng sinh trong điều trị các bệnh nhiểm khuẩn đường tiêu hóa.