xiv

DANH MỤC BẢNG

TRANG
Bảng 2.1: Một số giống bắp được cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) 11
Bảng 2.2: Quy định một số quốc gia trên thế giới về cây trồng biến đổi gen 17
Bảng 3.1: Mẫu thí nghiệm 38
Bảng 3.2: Các quy trình ly trích 39
Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31] 42
Bảng 3.4: Trang thiết bị thí nghiệm 2 42
Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2 43
Bảng 3.6: Chương trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2 43
Bảng 3.7: Phương pháp phân tích kết quả của thí nghiệm 2 44
Bảng 3.8: Chương trình nhiệt phân tích Melt curve 44
Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29] 47
Bảng 3.10: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 3 48
Bảng 3.11: Chương trình nhiệt của 2 phương pháp 49
Bảng 3.12: Lượng lý thuyết (Số lượng phân tử) của hai chuẩn 55
Bảng 3.13: Xác định độ nhạy phương pháp Real-Time PCR 56
Bảng 3.14: Thành phần phản ứng Real-Time PCR trong thí nghiệm 4 57
Bảng 3.15: Chương trình nhiệt của phản ứng Real-time PCR (mẫu dò Taqman) 57
Bảng 4.1: Kết quả đo OD 3 quy trình ly trích DNA 60
Bảng 4.2: Kết quả tách chiết DNA các mẫu 62
Bảng 4.3: Các mẫu ly trích đạt kết quả tốt 63
Bảng 4.4: Kết quả thí nghiệm sàng lọc bằng phương pháp 1 64
Bảng 4.5: Kết quả sàng lọc các mẫu đối chứng trong thí nghiệm 2 phương pháp 2 65

qua. Trong quá trình xuất nhập khẩu các mặt hàng này, các biện pháp quản lý cũng như
các phương pháp giúp xác định nguồn gốc nông sản nhằm đảm bảo các chỉ tiêu an toàn
về sức khỏe và môi trường là rất quan trọng. Điều này xuất phát từ một thực tế là sự
phát triển ngày càng cao của công nghệ sinh học và công nghệ gen cho phép ta có thể
dễ dàng biến đổi, cải tạo vật chất di truyền sinh vật, bổ sung các tính trạng mới theo ý
muốn nhằm mục đích làm cho cây trồng, vật nuôi ngày càng có phẩm chất và chất
lượng tốt hơn. Tuy nhiên việc các sinh vật biến đổi gen (GMOs) này có thể gây ra các
tác động xấu đến môi trường và sức khoẻ người tiêu dùng khi sử dụng chúng hay
không là việc ta không thể nào kiểm soát được. Vì vậy, trên thế giới, đặc biệt là tại
Châu Âu, chính phủ các nước đã triển khai nhiều biện pháp kĩ thuật nhằm phát hiện và
định lượng được những biến đổi trên vật chất di truyền (DNA) cây trồng, vật nuôi do
tác động của các kĩ thuật công nghệ sinh học. Mục đích là kiểm soát và ngăn ngừa các
tác động xấu có thể có của các sản phẩm biến đổi gen đồng thời cho phép người tiêu
dùng lựa chọn sử dụng các nông sản truyền thống (không biến đổi vật chất di truyền)
hay các nông sản đã được biến đổi di truyền. Trong số các kĩ thuật đã được các nước
trên thế giới ứng dụng, có thể nói Real-time PCR là một trong những kĩ thuật cho phép
phát hiện và định lượng được những thay đổi trên DNA sinh vật một cách chính xác
nhất. Hiện nay, kĩ thuật này được sử dụng rất rộng rãi trên thế giới và gần như là một
qui trình bắt buộc phải thực hiện trong việc phát hiện và định lượng các sản phẩm
GMO trước khi cấp phép lưu hành trên thị trường, đặc biệt là tại các quốc gia Châu Âu.
Do tác động của các qui định này, các sản phẩm nông nghiệp của nước ta trong tương
lai khi tham gia vào thị trường thế giới, bắt buộc phải trải qua bước kiểm tra GMO

2

trước khi được cấp phép. Thực tế này đòi hỏi nước ta phải sớm xây dựng được một qui
trình kiểm tra, phát hiện và định lượng các sản phẩm GMO xuất nhập khẩu ở nước ta.

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1. Định nghĩa sinh vật biến đổi gen (GMO-genetically modified organism)
Vào thế kỷ 20, sinh học đã có những bước tiến vượt bậc trong việc nghiên cứu
sinh học phân tử ở mức độ DNA và protein. Các tiến bộ này đã được ứng dụng vào
thực tiễn và phát triển thành một công nghệ mới, đó là công nghệ gen, bao gồm: các kỹ
thuật tái tổ hợp DNA và chuyển nạp gen. Chúng thật sự là những bước đột phá của
nhân loại trong lĩnh vực sinh học hiện đại, mở ra những chân trời mới với những khám
phá và ứng dụng vô tận cho cuộc sống và lợi ích của con người.
Một trong các ứng dụng đó chính là việc tạo ra các sinh vật biến đổi gen (GMO-
genetically modified organism), đặc biệt là cây trồng biến đổi gen (GMP-genetically
modified plant). Với các ưu điểm nổi bật, các giống thực vật này khi ra đời đã góp phần
nâng cao chất lượng và sản lượng lương thực, thực phẩm, một vấn đề cấp bách của
nhân loại.
Hiện nay, trên thế giới có nhiều định nghĩa khác nhau về sinh vật biến đổi gen
(GMO). Tuy nhiên, hầu hết chúng được định nghĩa là những sinh vật mà vật chất di
truyền của chúng đã được biến đổi theo những cách không xảy ra trong tự nhiên như
các quá trình lai chéo hay biến đổi tự nhiên. Đối với thực vật, thuật ngữ này được dùng
để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã được chuyển nạp ổn định những gen
hữu ích mới bằng các kĩ thuật chuyển nạp gen và trong đa số trường hợp các gen này
được biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng (protein) [33].

2. Quá trình tạo sinh vật GMO
Quá trình cơ bản
Sinh vật biến đổi gen là sản phẩm của những tiến bộ khoa học kĩ thuật tiên tiến
nhất của con người trong công nghệ sinh học thực vật. Mặc dù các kĩ thuật tạo ra chúng
khá đa dạng và phức tạp, quá trình vẫn có những bước tiến hành chung để đạt được kết
quả cuối cùng. Để thực hiện quá trình này, những vấn đề quan trọng về cơ chế sinh lý,
sinh hóa, sự điều hòa và biểu hiện gen cũng như những sản phẩm do gen đó tạo ra cần
phải được chú ý và nghiên cứu nhằm đảm bảo cho sự thành công của quá trình.

5

sử dụng, tuy nhiên trong số đó promoter CaMV 35S được sử dụng nhiều nhất do một số
ưu điểm nổi bật của nó và đây cũng là đối tượng nghiên cứu chính của đề tài này [16].

Hình 2.2: Cấu trúc gen chuyển nạp [46]
Vào đầu thập niên 80, GS. Chua và các cộng sự tại trường Đại Học Rockefeller
đã phân lập được một promoter cho phép phiên mã toàn bộ bộ gen của Cauliflower
mosaic virus (CaMV) xâm nhiễm vào củ cải. Promoter này được đặt tên là CaMV 35S
promoter do hệ số lắng của toàn bộ bản sao promoter là 35S. Nó là một promoter cơ
bản (constitutive promoter) được sử dụng rộng rãi nhất cho nhiều ứng dụng. Promoter
35S là một promoter cơ bản rất mạnh, có thể hoạt hóa phiên mã trong mọi loài thực vật
và cho phép biểu hiện gen ở mức độ cao trong cây hai lá mầm. Tuy nhiên, nó kém hiệu
quả trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc. Sự khác biệt này có lẽ do những
khác biệt về chất lượng, số lượng các yếu tố điều hòa [16]. Hình 2.3: Trình tự vùng promoter 35S [16]
Nhằm khắc phục khuyết điểm này, promoter 35S đã được cải tiến, nâng cao hiệu
quả hoạt động bằng cách thêm vào các trình tự enhancer. Trình tự này dài 162 bp, từ -
208 bp đến -46 bp. Các nghiên cứu cho thấy, hiệu quả hoạt động phiên mã gia tăng từ 3
đến 6 lần trên cây một lá mầm được chuyển nạp nhiều bản sao vùng enhancer [16].

6

Về sự liên quan của promoter 35S trong việc phát hiện GMO, theo GS.TS. Phạm
Thị Anh Thư, tại hội thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển gen” do hội các phòng thí

7

- Cây trồng bất thụ đực: Giúp sản xuất các giống nông sản lai năng suất cao
[17].
- Kháng bệnh: Mục tiêu của các giống cây trồng chuyển gen này là ngăn chặn
sự phát sinh bệnh do virus và nấm trên cây trồng [17].
- Ngăn chặn sự chín sớm của trái cây: Kéo dài thời gian tồn trữ và phù hợp
cho sản xuất thực phẩm [17].
- Các đặc tính chất béo được thay đổi: Ứng dụng chủ yếu cho tiêu dùng và chế
biến thực phẩm. Mục tiêu là tăng hàm lượng các loại acid béo không bão hòa
đơn và giảm acid béo không bão hòa đa trong các loaị cây lấy dầu như
canola, đậu nành, hoa hướng dương [17].
- Cố định đạm: Ứng dụng cho các giống thực vật không có khả năng cố định
đạm [17].
- Nâng cao giá trị dinh dưỡng : Mục tiêu là chuyển nạp các gene mã hóa các
protein có chứa hàm lượng cao các amino acid thiết yếu: lysine, tyrosine,
tryptophan vào cây trồng giúp nâng cao giá trị dinh dưỡng của chúng [17].
- Thực phẩm chức năng: Đây là một hướng nghiên cứu tuy còn khá mới mẻ
nhưng đã hứa hẹn thành công rực rỡ trong tương lai. Mục tiêu là chuyển nạp
gene biểu hiện các protein kháng nguyên chống lại một số bệnh như: viêm
gan B, cúm… tạo ra các loại vaccine có thể ăn được (edible vaccine). Một
hướng nghiên cứu khác là chuyển nạp gen sinh tổng hợp các hợp chất thứ
cấp quý như: dược phẩm, chất dẻo. Một ví dụ nổi tiếng của thực phẩm chức
năng đó là gạo vàng (Golden rice). Đây là loại gạo có hàm lượng vitamin A
được tăng cao bằng cách chuyển nạp 3 gen mã hóa quá trình sinh tổng hợp
carotene. Các nhà khoa học hy vọng gạo vàng sẽ góp phần xoá bỏ các chứng
bệnh mù do thiếu vitamin A gây ra tại các nước đang phát triển [17].

Cho phép canh tác trên những vùng đất trước đây không thể sử dụng.
- Môi trường:
Giảm dư lượng phân bón nhờ cố định đạm, giảm áp lực đất trồng.
Giảm sử dụng thuốc trừ sâu.
Chỉ thị và chuyển hóa ô nhiễm.
Bảo vệ môi trường sinh thái.
- Sức khỏe con người:
Giảm các tác động độc hại do thuốc trừ sâu gây ra với sức khỏe.
Tạo ra được các loại thực phẩm mới có chất lượng tốt hơn, có khả năng
chữa bệnh phục vụ cho con người.
Nâng cao dinh dưỡng cho con người.
Những tác động có lợi này đã giúp cho cây trồng chuyển gen được sản xuất và
thương mại hóa ngày càng rộng rãi trên thế giới [17] [24]. 9 4. Tình hình cây trồng chuyển gen trên thế giới
Lịch sử phát triển và thương mại hóa cây trồng biến đổi gen là một lịch sử phát
triển khá nhanh. Từ một sản phẩm cà chua Flavr Savr biến đổi gen làm chậm quá trình
chín được trồng và thương mại hạn chế tại Mỹ năm 1994, đến nay, cây trồng biến đổi
gen đã được trồng và thương mại hóa tại nhiều quốc gia trên thế giới. Chúng không
ngừng được bổ sung các chủng loại, giống cây mới cũng như những tính trạng, chức
năng hữu ích mới làm phong phú thêm bộ sưu tập cây trồng chuyển gen. Đồng thời,
việc ngày càng nhiều quốc gia trên thế giới cũng như số lượng người nông dân tham gia
trồng trọt cây chuyển gen ngày càng tăng cho thấy một số tác động tích cực do chúng


Hình 2.6: Các quốc gia trồng cây chuyển gen trên thế giới [18]

11

Với tỷ lệ gia tăng rất nhanh, trong tương lai, cây trồng biến đổi gen có thể sẽ
chiếm tỷ lệ lớn trong cơ cấu cây trồng hiện đại. Hình 2.7: Tỷ lệ các loại cây chuyển gen trên thế giới [19]
Tình hình bắp chuyển gen trên thế giới

Bảng 2.1: Một số giống bắp đƣợc cấp phép tại châu Âu (Quy định 1829/2003) [41]
Tên giống
Đặc tính
Công ty
- MON810
- MON863
- NK 603
- GA 21
- NK 603 X MON 810

- GA21 X MON 810
- MON863 X MON603
- Bt176 maize

- Bt 11

Bayer

Theo báo cáo năm 2004 thì hiện nay, diện tích trồng bắp chuyển gen là 19,3
triệu ha, chiếm 23% diện tích cây trồng chuyển gen trên toàn thế giới. Diện tích trồng

12

bắp đã liên tục tăng trưởng trong những năm gần đậy, đạt tỷ lệ 27% trong năm 2003 và
25% trong năm 2004. Dự đoán diện tích này sẽ tiếp tục tăng mạnh trong thời gian tới
do nhu cầu về bắp đang ngày càng tăng và có nhiều giống bắp mới đã được cấp phép.
Như vậy liệu trong tương lai, cây trồng biến đổi gen có thể thay thế các loại cây
trồng truyền thống để phục vụ cho nhu cầu lương thực của con người hay không? Và có
thật sự là cây trồng chuyển gen chỉ mang lại những hiệu quả và tác động có lợi “thần
kỳ” hay không? [3] [21].

5. Ảnh hƣởng bất lợi và dƣ luận xã hội đối với cây trồng biến đổi gen
Các rủi ro có thể gặp [34]
Quả thật, sự phát triển của cây trồng chuyển gen được thể hiện qua những con số
rất đáng kể. Tuy nhiên, vấn đề nào cũng có mặt trái của nó. Việc được trồng và thương
mại hóa ngày càng tăng tại nhiều quốc gia trên thế giới không có nghĩa là các sinh vật
biến đổi gen này hoàn toàn không có một rủi ro hay tác hại nào đối với môi trường và
sức khỏe con người. Theo nhiều nhà khoa học trên thế giới, những rủi ro và tác hại có
thể có của thực vật chuyển gen có thể do những nguyên nhân sau:
- Gen chuyển nạp chèn vào vị trí ngẫu nhiên, phá vỡ trình tự gen hiện hữu.
- Thiếu kiểm soát thông thường đối với gen chuyển nạp dẫn đến các gen
chuyển nạp thường biểu hiện liên tục trong mọi tế bào, kể cả sau khi được
mua bán và tiêu dùng.