21
¾ β-glucozitase có tên khác β-D-glucozit-glucohydrolase, hay cellobiase
Theo nhiều tác giả khác nhau thì cơ chế tác động của hệ enzyme cellulase có
nhiều kiểu tác động khác nhau.
Theo Mandels và Reese (1964) thì: Hình 2.2: Sơ đồ tác động enzyme cellulase lên cellulose theo Mandels và Reese

Trong đó C
1
là nhân tố tiền phân hủy nhưng đặc hiệu, chỉ có tác dụng làm trương
tạo thành các chuỗi cellulose mạch ngắn, các chuỗi này lại bị tấn công bởi C
x
. Các vi
sinh vật sinh trưởng trên cellulose phức tạp có trật tự sắp xếp cao thì tổng hợp cả hai
C
1
và C
x
. Trong tự nhiên người ta cũng tìm thấy có hiện tượng phối chéo tức là C
1
sinh
ra từ loài nấm mốc này nhưng C
x
lại sinh ra từ một loài nấm mốc khác.
β-glucozitase ở cuối chuỗi có tác dụng lớn trong việc phân giải hoàn toàn

có khoảng ¾ số nhóm axit bị metyl hóa.
Các nhóm hydroxyl ở C
2
và C
3
của mỗi đơn vị mắc xích có thể bị ester hóa một
phần bởi axit acetic hoặc axit phosphoric. Một phần nhóm axit không ester hóa tham
gia tạo liên kết ngang với ion canxi và magie.
O
COOH
OH
O
O
COOH
OH
OH
O
O
COOH
OH
OH
O
O
OH

8
COOCH
3
9
II I II
Như vậy, sự phân cắt nhóm metoxy sẽ xảy ra một cách tuần tự bắt đầu từ nhóm
−COOH tự do. Kết quả tạo thành axit pectinic hoặc axit pectic và rượu metanol.

23
 Polygalacturonase (PG)
PG còn có tên gọi là poly-α-1,4-galacturonit glucanohydrolase. PG là enzym xúc
tác sự phân cắt các liên kết glucozit 1-4 ở trong các mạch của pectin .
PG là một phức hệ enzym gồm nhiều cấu tử và thường có tính đặc hiệu cao khi
tác dụng với cơ chất.
Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác động trên cơ chất, H.Deuel và E.Stutz (1958)
đã chia ra như sau:
9 Polymetilgalacturonase (PMG):Enzym tác dụng trên axit
polygalacturonic đã được metoxyl hóa (tức là pectin). Enzym này thường
có tên gọi hệ thống là poly-α-1-4-galacturonic metil esteglucanohydrolase
và có mã số 3.2.1.11. PMG lại được phân thành hai nhóm nhỏ phụ thuộc
vào khả năng phân cắt liên kết ở trong hay ở cuối mạch của pectin là:
Endoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu I (endo-PMG-I) và Exo-
glucosidase-polimetilgalacturonase kiểu III (exo-PMG-III).
9 Poligalacturonase: Enzym này tác dụng trên axit pectic hoặc axit pectinic,
chia thành hai nhóm nhỏ: Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II
(endo-PG-II) và Exoglucosidase-polymetilgalacturonase kiểu IV (ex-PG-
IV)

OH
OH
O
H
H
H
H
OH
O
H
3
C
O
H
C
OH
OH
H
H
H
O
O
H
3
C
O
C
O
H
3

Địa điểm thực hiện : đề tài được nghiên cứu và thực hiện tại phòng thí
nghiệm sinh hoá thuộc Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học trường Đại Học Bách Khoa
thành phố Hồ Chí Minh.

3.2 NGUYÊN LIỆU

3.2.1 Trái cacao

Trái ca cao tươi được lấy từ huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre. Trước khi lấy hạt
để lên men trái ca cao được lưu trữ ở nơi thoáng mát trong 7 - 9 ngày. Mục đích của
quá trình này là giúp cho lớp cơm nhầy bao quanh hạt giảm đi giúp làm giảm độ ẩm
của khối lên men sau này. Sau khi lưu trữ hạt được tách khỏi trái tươi. Sau khi tách hạt
cần phải ủ ngay và không được lưu quá 20 ngày (Phạm Hồng Đức Phước, 2004).

3.2.2 Giống vi sinh vật

Chủng được sử dụng là Aspergillus niger được lấy từ hai nguồn:
¾ Nguồn thứ nhất: từ phòng thí nghiệm công nghệ sinh học bộ môn Công nghệ
sinh học đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh
¾ Nguồn thứ 2: từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Khoa học tự nhiên
Chủng Aspergillus niger
Thuộc nhóm: Aspergillus niger
Giống: Aspergillus
Họ: Aspergillaceae

26
Giống đưa vào nghiên cứu được bảo quản trong môi trường PGA giữ ở nhiệt độ
4
o
C.


3.3.1 Môi trường thạch malt

Chúng tôi sử dụng môi trường malt để cấy truyền và phục hồi giống.
Cách tiến hành làm môi trường Malt như sau

27
Lấy 200 g malt đã được xay nát cho vào becher 1000 ml. Thêm nước cất cho đủ
1000 ml. Đặt becher trong bể điều nhiệt ở nhiệt độ 55
o
C trong 1 giờ, sau đó tăng lên
65
o
C trong 1 giờ sau. Trong quá trình thủy phân dịch malt được khuấy trộn để tăng
khả năng thủy phân tinh bột. Quá trình thủy phân tinh bột tạo một lớp nước có màu
nâu đục phía trên. Khi kết thúc quá trình thủy phân ta gạn thu phần dịch malt có màu
nâu đục ở phía trên. Lọc qua bông gòn thấm nước để loại bỏ một số tạp chất còn sót
lại.
Dịch malt sau khi lọc được bổ sung agar với hàm lượng 18 ‰ thể tích dịch malt
Đun sôi dịch malt và agar trên bếp ở nhiệt độ không quá cao và tiến hành khuấy
liên tục tránh hiện tượng caramel hóa
Chuẩn bị ống nghiệm sạch, cho vào mỗi ống khoảng 3 ml dịch malt
Làm nút bằng bông gòn y tế không thấm nước và bao đầu ống nghiệm bằng giấy
báo.
Đem thanh trùng ở 121
o
C, 1 atm, trong 15 phút
Đặt nghiêng ống nghiệm tạo môi trường thạch nghiêng. Giữ môi trường malt ở
nhiệt độ 4
o
Cấy Asp. niger trên môi
trường thạch malt
Thêm 10ml nước cất
vào mỗi ống
48 giờ; 34,5
o
C
Dùng que cấy mài nhẹ
trên mặt thạch tách bào
tử
Cân 75% cám, 9% cà rốt,
15% trấu, 1% (NH
4
)SO
4
Thêm nước (V ml), trộn
đều và cho vào erlen
Thanh trùng ở 121
o
C,
1atm, 20 phút
Lưu trữ ở nhiệt độ 34,5
o
C
tron

: độ ẩm của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt
m
1
, m
2
, m
3
: khối lượng của các thành phần cám gạo, trấu và cà rốt
10: thể tích nước cất thêm vào để tách bào tử Asp. niger từ môi trường thạch malt

3.3.3 Chế phẩm sinh học

Mục đích của việc tạo chế phẩm là tạo môi trường dinh dưỡng cho nấm mốc phát
triển, dễ sử dụng, và dễ bảo quản

29
Aspergillus niger sau khi được nhân giống trên môi trường bán rắn được trộn với
bột mì rang vàng. Thêm nước cất để chỉnh độ ẩm của môi trường chế phẩm về độ ẩm
mong muốn. Chế phẩm sau đó được đưa vào bịch nylon có sử dụng bông gòn làm nút.
Mục đích của việc sử dụng bông gòn làm nút để giúp cho môi trường chế phẩm ở
trạng thái hiếu khi nhưng vẫn không làm phát tán bào tử Asp. niger ra ngoài môi
trường. Chế phẩm sau đó được cất giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 34,5
o
C trong 3 ngày.

3.4 DỤNG CỤ, HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ

3.4.1 Dụng cụ và thiết bị

Máy khúc xạ kế


Nước cất
NaOH
HCl
CMC (sodium carboxymethyl – cellulose)
H
2
SO
4
Cồn (C
2
H
5
OH) 96
o
Thuốc thử anthrone
Antron
Glucose C
6
H
12
O
6
Saccharose
Phenol
Thuốc thử orcinol
Dextrin
Acid acetic
DNS (dinitrosalicylic acid)
Pectin