i LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành được đề tài này, em đã nhận được sự giúp đỡ từ nhiều
phía. Trước hết, em xin ghi công ơn của cha mẹ em và người thân đã luôn luôn
bên cạnh em, giúp đỡ em vượt qua khó khăn trong suốt thời gian học đại học.
Em sẽ mãi ghi nhớ công lao của thầy cô trong trường Đại học Nha Trang,
đặc biệt các thầy cô trong khoa chế biến đã giúp em những kiến thức chuyen
ngành cơ bản nhưng rất cần thiết sau khi ra trường.
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với thầy T.S Nguyễn
Minh Trí, Th.S Ngô Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn, thôi thúc và tận
tình chỉ bảo, cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện
đề tài.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn tới các Thầy Cô quản lí phòng thí nghiệm
cũng như viện công nghệ sinh học đã nhiệt tình, tạo điều kiện thuận lợi cho cho
em trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng em xin cảm ơn các bạn bè của em, những người không những
động viên mà còn cùng sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài cho đến
khi chỉnh sửa bài cuối cùng.

Sinh viên

Nguyễn Hoàng Bảo Trung.
ii
2.3. TỔNG QAN VỀ ENZYME PROTEASE 7

2.3.1. Giới thiệu chung [3] 7

2.3.2. Phân loại protease 9

2.3.3. Nguồn thu nhận protease [32] 11

2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3] 11

2.4. CÁC NGHIÊN CỨU TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC: 14

2.5. ỨNG DỤNG PROTEASE 16

Chương ΙII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 19

3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát: 19

3.2.1.1. Xử lí đầu tôm: 21

iii 3.2.1.2. Thủy phân dịch chiết từ đầu tôm: 22

3.2.2. Bố trí thí nghiệm: 24


4.3

Đánh giá mức ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ và pH đến khả năng thủy
phân của hệ protease có trong dịch chiết đầu tôm thẻ chân trắng bằng kiểm
định thống kê ANOVA 37

KẾT LUẬN VÀ Ý KIẾN ĐỀ XUẤT 38

TÀI LIỆU THAM KHẢO 40

PHỤ LỤC
iv DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%) 3
Bảng 2.2: Thành phần hóa học cơ bản của đầu tôm [23] 4
Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %) 5
Bảng 3.1: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 40
0
C 26
Bảng 3.2: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 50
0
C 26
Bảng 3.3: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 60
0
C 27
Bảng 3.4: Khảo sát khả năng thủy phân của hệ enzyme protease ở 70


1 Chương I. ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong những năm gần đây, chế biến thủy sản được coi là hướng phát triển
mũi nhọn của nền kinh tế biển. Trong đó, tôm là một mặt hàng có giá trị dinh
dưỡng cũng như giá trị kinh tế cao. Kim ngạch xuất khẩu từ các mặt hàng tôm
ngày càng tăng. Do đó, đây là mặt hàng đã, đang và sẽ mang lại lợi ích vô cùng
lớn cho nền kinh tế quốc dân. Sản lượng tôm xuất khẩu của năm 2010 đạt
241.000 tấn, tăng 13,4% so với năm 2009 và mang về hơn 2 tỷ USD [35]. Chúng
ta tăng sản lượng sản phẩm chế biến từ tôm cũng đồng nghĩa với việc một lượng
lớn phế liệu tôm được thải ra môi trường bên ngoài. Nếu không có hướng giải
quyết thích hợp thì đây sẽ là một thảm họa nghiêm trọng đối với môi trường,
đồng thời chính các doanh nghiệp cũng phải bỏ ra chi phí không nhỏ cho việc xử
lí thải bỏ, thậm chí còn dẫn đến việc đóng cửa do không đủ năng lực giải quyết
vấn đề ô nhiểm, gây ra nhiều hệ lụy về mặt kinh tế, xã hội tiếp sau đó.
Đứng trước tình hình bức thiết của các doanh nghiệp chế biến tôm, hiện
nay đã có nhiều nghiên cứu tận dụng nguồn phế liệu tôm đã được ứng dụng trong
thực tế sản xuất: sản xuất chitin, chitosan, glucosamin, sản xuất xác chất khoáng,
tận thu protein…
Hàm lượng proteine chứa trong phế liệu tôm rất lớn gần 50% [23], tuy
nhiên người ta chỉ mới thực hiện việc tận thu proteine đơn thuần (xay, nghiền
phế liệu rồi phơi khô hay ép láy dịch rồi đi sấy khô làm thức ăn cho gia súc) hay
thực hiện tận thu kết hợp với quy trình sản xuất khác… chính những điều này
làm cho chất lượng proteine thu được không cao, chúng thường bị mất các đặc
tính sinh học. Nhằm hướng đến việc tận thu nguồn các chất có giá trị sinh học từ
đầu tôm:
- Protein, các peptone, peptid có hoạt tính sinh học có lợi.


Chương II. TỔNG QUAN

2.1. TỔNG QUAN VỀ TÔM THẺ CHÂN TRẮNG: [35]
Tôm thẻ chân trắng (Tên tiếng Anh: White Leg shrimp) được phân loại như sau:
Ngành: Arthropoda
Lớp: Crustacea
Bộ: Decapoda
Họ chung: Penaeidea
Họ: Penaeus Fabricius
Giống: Penaeus
Loài: Penaeus vannamei.
2.1.1. Cấu tạo chung của tôm:
Tôm gồm hai phần, phần trước là đầu và ngực, phần sau là thân. Đầu tôm
có cấu tạo nguyên thủy, mắt có cuống, chân có đốt, có hai đôi râu xúc giác, phần
ngực được bao bọc bằng giáp đầu ngực, ba đôi chân đầu tiên được biến hóa thành
chân hàm dung để đón thức ăn, năm đôi chân ngực còn lại dung để làm chân bò.
Phần thân gồm có bảy đốt, có bảy đôi chân phân thành hai nhánh. Đốt
cuối cùng hợp với chân bơi tạo thành đuôi để tạo nên bánh lái trong quá trình di
chuyển.
Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của tôm thẻ (%)
Thành phần khối lượng (%)
Thịt tôm Đầu Vỏ

Tôm thẻ
60.00 31.00 9.00
4 2.1.2. Thành phần hóa học của tôm

nồng độ ion thấp.
- Chất cơ bản:
Colagen và elastin: chiếm khoảng hơn 3% hàm lượng protein liên kết,
trong đó có khoảng 2,5% không hoàn thiện.
2.1.2.2. Nước
Trong tôm hàm lượng nước chiếm tương đối cao từ 70-85%. Vì vậy thân
tôm trở nên bóng và mềm mại tăng tính cảm quan, tuy nhiên cũng chính vì thế
mà tôm dễ bị dập nát trong quá trình vận chuyển cũng như là môi trường thuận
lợi cho enzyme và vi sinh vật phát triển.
2.1.2.3. Vitamin và các chất khoáng
Lượng vitamin và các chất khoáng của tôm đặc trưng theo loại và sự biến
đổi của mùa vụ, nhưng nhìn chung thì giàu vitamin A, B… Về mặt chất khoáng
thì tôm được xem là nguồn quí về calcium, phospho, đồng và sắt.
Bảng 2.3: Thành phần khoáng trong thịt tôm (mg %)
Thành phần khoáng (mg %).
Ca Phosphor

Fe Ne K Mg Cu
29-50 53-67,6 1,2-5.1 11-127 127-565 0,0412 332

2.1.2.4. Các sắc tố
Tôm chứa nhiều sắc tố khác nhau nhưng chủ yếu là astaxanthin, là dẫn
xuất của canden. Trong thành phần vỏ tôm, astaxanthin tham gia vào thành phần
của lipoprotein gọi là cianin. Ngoài ra trong tôm người ta còn phân li được sắc tố
tím và đen là tiền astaxanthin và tetraxanthin.
6 2.1.2.5. Các chất ngấm ra
Các chất ngấm ra chủ yếu là các chất chứa nitơ, là các chất tan được trong

Trong lĩnh vực chế biến các sản phảm tôm bỏ đầu, bỏ vỏ thì tỉ lệ thịt tôm
chỉ chiếm khoảng 55-65%, phần nguyên liệu còn lại chiếm đến 35-45% (định
mức sản xuất trong nhà máy chế biến tôm đông lạnh). Như vậy, giả sử trong nhà
máy chế biến, một ngày chế biến khoảng 10 tấn tôm thì lượng phế liệu thật đáng
kể. Đây là nguồn thưc ăn của nhiều vi sinh vật gây thối, hơn thế đặc thù của
ngành thủy sản lại gắn với việc sử dụng một lượng nước rất lớn. Vì vậy mà
ngành chế biến thủy sản nói chung, ngành chế biến tôm nói riêng trở thành ngành
công nghiệp gây ô nhiễm nặng nề nếu phế liệu không được lí xử tốt.
2.3. TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE
2.3.1. Giới thiệu chung [3]
Nhóm enzyme protease (peptit-hidrolase 3,4 ) xúc tác trong quá trình thủy
phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử proteine, polypeeptide đến các
sản phẩm cuối cùng là các acid amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng
thủy phân liên kết este và vận chuyển acid amin.
Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng, từ mức
độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rộng rải trên nhiều đối tượng như
vi sinh vật (vi khuẩn, nấm móc, virus…) đến thực vật (đu đủ, dứa…) và động vật
(gan, dạ dày bê, đầu tôm…).
Bản chất, cấu trúc và cơ chế tác dụng của enzyme
 Bản chất của enzyme
Enzyme đa phần là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ
tính chất như một protein thông thường
Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn 12000 Dalton. Giống như các
protein khác, enzyme có thể hóa tan trong nước, trong dung dịch muối loãng
nhưng không tan trong dung môi phân cực Enzyme dễ dàng bị kết tủa bởi các
yếu tố vật lý và hóa học vốn làm kết tủa protein.
8 Enzyme không bị mất hoạt tính ở nhiệt độ thấp ngược lại dưới tác dụng

enzyme dẫn đến sự kéo căng và phá vỡ các liên kết đồng hóa trị tham gia phản
ứng này. Kết quả làm cho cơ chất được hoạt hóa dễ dàng tham gia phản ứng hơn.
o Trong giai đoạn thứ ba : sản phẩm tạo thành, còn enzyme được giải
phóng dưới dạng tự do để tiếp tục tham gia tác dụng với cơ chất khác.
2.3.2. Phân loại protease
Protease (peptidase) thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) [32].
Peptidase (protease) (E.C.3.4)
Exopeptidase Endopeptidase
(E.C.3.4.11-17) (E.C.3.4.21-99) Aminopeptidase Carboxypeptidase Serine Aspartic Metallo Cystine
proteinase proteinase proteinase proteinase Exopeptidase: peptidase thủy phân các phân tử peptid có phân tử nhỏ
(pepton, polypeptid) thành các acid aminr tự do. Những enzyme này đòi hỏi phải
các nhóm –COOH và nhóm -NH2 tự do tận cùng ở gần kề liên kết peptid.
Peptidase có tính đặc hiệu tương đối hẹp, chủ yếu phân cách các liên kết ở hai
đầu phân tử proteine. Dựa vào vị trí tác động lên mạch polypeptid, exopeptidase
được phân chia thành hai loại:
+ Amino peptidase: xúc tác thủy phân liên kết peptid ở đầu N tự do của
chuỗi polypeptid để giải phóng ra một acid amin, dipeptid, hay tripepetid.
+ Carboxypeptidase: xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C của mỗi
polypeptid và giải phóng ra một acid amin, một dipeptid.
10



+ Protease acid: pH 2-4
+ Protease trung tính: pH 7-8
+ Protease kiềm: pH 9-11
2.3.3. Nguồn thu nhận protease [32]
+ Nguồn vi sinh vật:
Enzyme protease phân bố chủ yếu ở vi khuẩn, nấm móc, xạ khuẩn… gồm
nhiều loại thuộc PergillAsus, Bacillus, Penicillium, Streptomyces, và một số loại
nấm men.
+ Nguồn thực vật:
Có ba loại protease thực vật phổ biến là bromelin (thu từ quả, chồi, vỏ
dứa), papin (thu từ nhựa, lá, thân, quả đu đủ), prein (thu từ nhựa cây cọ).
+ Nguồn động vật:
- Dạ dày bê: trong ngăn thứ tư của dạ dày bê có tồn tại enzyme thuộc
nhóm protease tên là renin.
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme lớn nhất (chứa nhiều enzyme nhất) được
phát hiện sớm nhất và lâu đời nhất.
2.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme [3]
Tốc độ phản ứng của enzyme phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như
bản chất và nồng độ các chất phản ứng, nộng độ enzyme, nhiệt độ, pH môi
trường, nồng độ ion trong môi trường, nồng độ các chất kìm hãm, các chất hoạt
hóa enzyme
 Ảnh hưởng của nhiệt độ : giống như các phản ứng hóa học, các phản
ứng cho enzyme xúc tác phụ thuộc rất nhiều vào nhiệt độ. Theo quy luật của
phản ứng hóa học thì khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng, nhưng vì bản
chất của enzyme là protein nên nhiệt độ chỉ tăng cao đến mức nhất định. Đa số
12 các enzyme sẽ bị mất hoạt tính ở nhiệt độ 60

13 tùy theo lượng muối bổ sung vào, ở nồng độ giới hạn cho phép thì thúc đẩy
enzyme hoạt động mạnh, nếu vượt qua giới hạn cho phép thì sẽ kìm hãm sự hoạt
động của enzyme.
 Ảnh hưởng của ion kim loại: một số enzyme không bị ảnh hưởng rõ rệt
của sự có mặt hay không có mặt đối với ion kim loại, nhưng có nhiều enzyme
khác chịu ảnh hưởng sâu sắc của nồng độ và bản chất của ion kim loại. Có những
ion kim loại hầu như tuyệt đối cần thiết cho sự hoạt động của một số enzyme,
nhưng một số ion kim loại lại ức chế hoạt động của enzyme này.
 Ảnh hưởng của chất kìm hãm: chất kìm hãm là chất làm yếu hoặc
chấm dứt toàn bộ phản ứng của enzyme. Có hai loại chất kìm hãm :
Kìm hãm cạnh tranh: là những chất kìm hãm thuận nghịch enzyme, có cấu
trúc tương tự với cấu trúc cơ chất, do đó có khả năng kết hợp vào trung tâm hoạt
động của enzyme, do vậy nó chiếm chổ kết hợp của cơ chất làm giảm vận tốc xúc tác.
Kìm hãm không cạnh tranh: là chất kết hợp ở vị trí khác với trung tâm
hoạt động làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme theo hướng
không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme, làm giảm vận tốc phản ứng xúc tác.
 Ảnh hưởng của chất hoạt hóa : chất hoạt hóa là những chất có khả năng
làm tăng hoạt động xúc tác của enzyme hoặc làm cho enzyme ở dạng không hoạt
động thành dạng hoạt động. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hổi hoạt độ
của enzyme một cách gián tiếp hay trực tiếp.
Hoạt hóa không gián tiếp: làm tăng tốc độ phản ứng của enzyme bằng
cách loại trừ chất kìm hãm ra khỏi hỗn hợp phản ứng hoặc tham gia trực tiếp
phản ứng, nhưng không tác dụng trực tiếp với phân tử enzyme.
Hoạt hóa gián tiếp: chất này có tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động
của enzyme hoặc làm thay đổi cấu hình không gian của phân tử enzyme theo
hướng có lợi cho hoạt động xúc tác.

Nguyễn Văn Lệ (1996) nghiên cứu về protease đầu tôm bộp cho thấy khi
tách protease đầu tôm qua cột lọc gel sephadex H-75 thu được hai protease có
nhiệt độ thích hợp là 60
0
C và 50
0
C với pH tương ứng là 7,5 và 8,5. Tác giả còn
cho thấy có thể sử dụng protease đầu tôm bộp để thủy phân thu bột đạm từ phế
liệu đầu tôm và ứng dụng trong thủy phân cá [11].
Nguyễn Việt Dũng đã thực hiện việc tách chiết protease từ thịt tôm sú và
xác định hoạt động của chúng ở các nhiệt độ, pH khác nhau, qua đó bước đầu
nhận thấy protease trong loại tôm này hoạt động thích hợp nhất ở pH 6,6 và nhiệt
độ 50˚C [7].
Nguyễn Thị Mỹ Trang (2004), công bố công trình nghiên cứu protease
chiết xuất từ đầu tôm bạc nghệ (Metapenaeus bevicornis). Kết quả thu được
protease có nhiệt độ thích hợp là 50
0
C và pH thích hợp từ 8,5-9,5. Chế phẩm
enzyme thu được dùng thủy phân cá mối thu bột đạm [21].
Nguyễn Văn Truyền (2006) đã nghiên cứu chiết xuất protease từ đầu tôm
càng xanh và thu được enzyme protease có nhiệt độ tối thích là 55
0
C, pH tối
thích là 8 [24].
Các nghiên cứu trên còn cho thấy rằng hệ enzyme protease trong tôm
không những bao gồm nhiều loại protease khác nhau, mà còn các đặc tính của hệ
cũng thay đổi khi tách chiết từ các phần khác nhau trên tôm.
Trên thế giới, các nhà nghiên cứu cũng dành sự quan tâm đến khía cạnh

tính địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá…nên hiện nay, qui trình
sản xuát mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử dụng chế phẩm enzyme
từ thực vật (bromeline, papaine)và vi sinh vật đẻ rút ngắn thời gian chế biến và
cải thiện hương vị của nước mắm.
Trong công nghiệp sữa: prootease được dùng trong sản xuất pho mát nhờ
hoạt tính làm đông của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như: A. candidus, P.
roquerti, B. mesentericus…được duungf trong sản xuất pho mát.
17 Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh qui…protease làm giảm thời
gian trộn, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột và tạo độ xốp, nở tốt hơn.
Trong công nghiệp da, protease được dùng để làm mềm da nhờ sự thủy
phân một phần proteine của da, chủ yếu là collagene, thành phần chính làm cho
da cứng. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt, làm cho da có độ mềm dẻo
nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da.
Trước đây, để làm mềm da, người ta dùng protease được phân lập từ cơ
quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa protease tách từ vi khuẩn (B.
mesentericus, B. subtilis), nấm móc (A. oryzae, A. flavus), xạ khuẩn (S .fradiae,
S. griseus, S. rimonus…) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và
dần dần chiếm một vị trí quan trọng.
Trong công nghiệp dệt: protease vi sinh vật được sử dụng để làm sạch tơ
tằm, tẩy tơ nhân tạo (các sợi tơ nhân tạo được tạo bằng các dung dịch caseine,
gelatine) để sợi tơ được bóng và dễ nhuộm hơn. Protease có tác dụng thủy phân
lớp proteine serisine đã làm dính kết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các
loại tơ tằm, do đó mà giảm được lượng hóa chất sử dụng để tẩy trắng.
Trong sản xuất bột dinh dưỡng cho trẻ em: tại nhà máy sản xuất bột dinh
dưỡng trẻ em Nam Định, người ta đã sử dụng chế phẩm prozima có chứa
promelain hoạt động cực đại ở pH trung tính, nhiệt độ thích hợp ở 50-60
0

hoạt tính được cải thiện hoặc đọ bền nhiệt hoặc khả năng hoạt động trên cơ chất
mới hoặc ở pH cao hơn.
Tuy nhiên, với lượng phế liệu đầu tôm lớn như hiện nay và có xu hướng
tăng theo như mục tiêu đề ra của hiệp hội xuất khẩu Thủy sản thì ngoài các biện
pháp tận thu để sản xuất chitin, chitosan, glucosamin. thì việc chiết rút, sử dụng
enzyme protease từ đầu tôm cũng là một biện pháp góp phần đa dạng nguồn cung
cấp enzyme protease, cũng nhu góp phần giảm thải ô nhiễm môi trường và cung
cấp một lượng enzyme đáng kể đồng thời giải quyết vấn đề tận dụng tối đa phế
liệu từ sản xuất.
19 Chương ΙII. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đầu tôm thẻ:
Nguyên liệu đầu tôm được nghiên cứu mua tại công ty TNHH F17, đường
2/4- Nha Trang- Khánh Hòa.
Đầu tôm thẻ này là phế liệu của quá trình chế biến tôm đông lạnh. Chúng
được mua về đóng gói và bảo quản tại phòng thí nghiệm Khoa Chế biến, Viện
Công nghệ sinh học của trường Đại học Nha Trang. Nếu được sử dụng ngay, các
túi đầu tôm được bảo quản bằng đá xay ở nhiệt độ 0-4
0
C, thời gian không quá 2
giờ. Nếu cần cất giữ lâu hơn thì cấp đông nhanh và bảo quản ở nhiệt độ -20
0
C
trước khi sử dụng, thời gian bảo quản không quá bốn tuần.
3.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát:

Xử lí đầu tôm
Dịch chiết
đ
ầ
u tôm

Thủy phân

Đánh giá khả
năng thủy phân