CHẨN ĐOÁN PHÂN LOẠI KÝ SINH TRÙNG
BẰNG CÁC PHƯƠNG PHÁP TRUYỀN THỐNG VÀ SINH HỌC
PHÂN TỬ

KÝ SINH TRÙNG VÀ VẤN ĐỀ PHÂN LOẠI
Ký sinh trùng (KST) được coi là có vị trí quan trọng thứ hai sau vi sinh vật
trong mối quan hệ lây nhiễm và phát sinh bệnh tật giữa con người và động vật với
hệ sinh thái và môi trường. Hàng năm, tỷ lệ gây nhiễm, gây bệnh và gây chết của
bệnh do ký sinh trùng gây ra là rất cao buộc các nhà khoa học thực sự phải xem
xét lại và tìm phương pháp mới trong việc giám định, chẩn đoán nhằm tìm ra
phương pháp tối ưu trong việc nghiên cứu quy luật dịch tễ, điều trị và nguyên lý
lập phả hệ quần thể sinh học xác định nguồn gốc lây nhiễm của ký sinh trùng
(10)
.
Hiện nay, ký sinh trùng được coi là tập hợp đa dạng nhất, nên việc phân
loại về nhóm, loài, chủng trước đây đã có phần thiếu chính xác, đặc biệt đối với
một số loài anh em (sibling species). Do vậy, nhiều khi hình thái học ký sinh trùng
dễ gây nên phức tạp dẫn đến nhầm lẫn trong công tác chẩn đoán, điều trị, cũng
như việc phân loại tiến hoá của loài và họ KST. Phân loại và giám định bằng các
phương pháp truyền thống như dựa vào hình thái học, vào sự phân bố địa lý hay
theo đặc tính dịch tễ học và vòng đời, nhiều khi đã gộp nhầm những cá thể hoặc
quần thể ký sinh trùng mà thực chất chúng có những đặc tính di truyền học hoàn
toàn khác biệt nhau. Những thành quả gần đây trong nghiên cứu KST, nhờ sử
dụng các phương pháp nghiên cứu di truyền học hiện đại, nhờ sự tiến bộ của các
phương pháp kỹ thuật gen và công nghệ ADN đã cho phép và bắt buộc chúng ta
phải nhìn nhận lại mối quan hệ phân loại ký sinh trùng theo các phương pháp
truyền thống, trước hết là phương pháp hình thái học
(3,6,10)
.
Việt Nam là một nước nhiệt đới với mức sống và trình độ dân trí về vệ sinh
môi trường chưa cao, nên hàng năm bệnh do KST gây ra vẫn là một gánh nặng đối

hiện nay khái niệm về chủng và sự sử dụng đơn vị “chủng” trong thực tế còn thiếu
chính xác, lạm dụng, nhiều khi chỉ thích hợp với tiêu chuẩn này mà không thích
hợp với điều kiện đánh giá khác. Thông thường, chủng là tập hợp của các cá thể
phát hiện trong một vùng địa lý, có chung đặc tính di truyền học và thích ứng vật
chủ như nhau đã được xác định. Thực chất, loài và chủng là những đơn vị phân
loại được sử dụng một cách phổ biến, còn khái niệm dưới loài có tính chất trung
gian và có giá trị ước định trong phân loại.
Mẫu (isolate)
Không phải là đơn vị phân loại sinh học hay di truyền học, không có cấp
bậc trong tiến hoá, đơn giản chỉ là một/nhiều cá thể sinh học có chung hình thái
học và bước đầu được xác định quan hệ giống nhau. Một khi, các đặc tính hình
thái học và gen học của chúng được xác định chính xác, thì lúc này mẫu (isolate)
mới được coi và trở thành chủng (strain) đại diện cho loài đang nghiên cứu.
Biến chủng (variants)
Quy luật sinh học chính là sự bảo tồn (conservation) và biến đổi (variation),
góp phần vào tiến hoá qua thời gian của sinh vật. Sự thay đổi đa dạng trong cùng
một loài, hay còn gọi là biến đổi sinh học (biological variation), tạo ra các biến
chủng, mà các biến chủng (variants) nhiều khi chưa hẳn đại diện cho sự biến đổi di
truyền học (genetic variation hay genetic polymorphism). Các biến chủng xuất
hiện nhất thời, tồn tại ngắn, do vậy không phù hợp với nguyên lý tiến hoá của loài,
thậm chí nhiều khi còn thiếu nhiều đặc tính sinh - di truyền học để có thể kết luận
chúng thuộc loài này hay loài khác.
Mối quan hệ chủng - loài
Loài, dưới loài và chủng, như đã nói, được coi là các khái niệm đại diện
cho quần thể, và là mốc đánh giá sự tiến hoá của quần thể. Do vậy các đơn vị phân
loại này có ảnh hưởng rất lớn đến hệ thống phân loại quần thể sinh học
(population systematics) do tính phức tạp của biến động di truyền, do sự chưa
chuẩn xác của phân nhóm đơn vị phân loại và do tiến hoá của loài, dưới loài và
chủng luôn xảy ra, nên hiện nay đánh giá hệ thống phân loại quần thể sinh học và
lập phả hệ của loài gặp rất nhiều khó khăn. Cũng tương tự, sự phức tạp và thiếu

phẩm độc, các enzym phân giải và nhiều protein cấu trúc có tính đặc hiệu theo
từng cá thể riêng. Phương pháp sử dụng nhiều nhất vẫn là phương pháp điện di
protein (electrophoresis). Bất kỳ một protein nào cũng cho thông số điện di có tính
chất đặc trưng cho từng cá thể. Loại protein được sử dụng điện di thông thường là
các enzym có hoạt tính sinh học cao của ký sinh trùng.
Có hai phương pháp chính trong giám định và phân loại: điện di enzym
đồng phân (isoenzyme analysis) và điện di enzym dị phân (alloenzyme analysis).
Hai phương pháp cổ truyền này được ứng dụng thành công trong nghiên cứu ký
sinh trùng sốt rét (Plasmodium), tiên mao trùng (Trypanosoma) và nhiều loại sán
lá đường ruột
(3,10,11)
. Tuy cùng chung nguyên lý là phát hiện protein cùng chức
năng, nhưng kết quả phân tích điện di enzym đồng phân phát hiện protein cũ của
cá thể để củng cố tính đồng nhất có tính chất giám định. Còn phân tích điện di
enzym dị phân cho phép phát hiện protein mới cùng chức năng, từ đó tìm hiểu tính
khác biệt của cá thể có tính chất phân loại.
Phân tích trật tự amino acid của một sản phẩm protein của ký sinh trùng
cũng được sử dụng từ những năm 1980 để giám định và phân loại. Tuy nhiên
phương pháp này đòi hỏi protein tinh sạch, trang thiết bị đắt tiền rất tốn kém và
mất nhiều công sức. Hơn nữa, các phương pháp sinh học phân tử một khi xác lập
trật tự nucleotide của gen nghiên cứu thì rất dễ dàng cho biết cấu trúc amino acid
của gen tạo sản phẩm đó.
Các phương pháp truyền thống khác trong giám định và phân loại
Dựa vào đặc tính dịch tễ học và vòng đời
Đó là các đặc tính về sự khác biệt thích ứng vật chủ, tính hướng định cơ
quan, đặc tính phát triển vòng đời sinh học, quá trình và độ dài lây nhiễm, tiến
triển và tiên lượng bệnh, hầu hết các đặc tính này là sự thể hiện cơ bản của đặc
tính di truyền, tuy vậy, ít nhất chúng cũng tồn tại theo phương thức ký sinh riêng
của cá thể, mà chúng ta có thể, đối chiếu ghi nhận loại ký sinh trùng này đối với
các loại ký sinh trùng khác

giá tiến hoá và phân loại
(2)
.
Dựa vào các phương pháp huyết thanh học
Sự phát triển vượt bậc của khoa học về miễn dịch học, cho phép chúng ta
ứng dụng những phương pháp cực nhạy và chính xác trong chẩn đoán và giám
định. Sử dụng kháng nguyên sơ chế và tinh chế, cũng như các loại kháng thể đa và
đơn dòng của ký sinh trùng, chúng ta có được các phương pháp tin cậy và nhanh
trong việc giám định chủng và loài, ví dụ các phương pháp hấp phụ đánh dấu
enzym (ELISA), phương pháp miễn dịch học phóng xạ (RIA), phương pháp miễn
dịch huỳnh quang (IF). Điều đáng chú ý là phương pháp huyết thanh học ký sinh
trùng dễ cho kết quả chéo (cross-reaction), hơn nữa, cá thể có thể bị đa nhiễm
KST, nên nhiều khi khó chẩn đoán chính xác vật chủ đang mang loại KST nào.
Đối với nghiên cứu tiến hoá và lập phả hệ của loài, phương pháp huyết thanh học
không được coi là có ý nghĩa thực tiễn, ngược lại, phương pháp này cùng với
phương pháp hình thái học là các phương pháp rất có giá trị trong chẩn đoán và
điều trị.
Dựa vào đặc tính nhuộm màu cá thể và tế bào
Khi ép nhuộm bằng các loại thuốc nhuộm có thể phân biệt dễ dàng hình
dạng KST, thậm chí còn quan sát được sắp xếp và cấu trúc các cơ quan bên trong,
đặc biệt quan sát được sự phân thuỳ và hệ sinh sản của KST tạo cơ sở chẩn đoán
phân loại. Phương pháp nhuộm tế bào trước hết là sự phân lập và so sánh nhiễm
sắc thể (NST) của tế bào, rồi từ đó tìm kiếm các phân đoạn ADN (các locus) trong
NST chứa các gen hay các đoạn ADN có giá trị trong giám định và phân loại. Số
lượng cặp, hình thái, tính bắt màu đặc trưng của NST thông thường cho giá trị
tổng quát để bước đầu định hướng giám định và phân loại các cá thể trong và
ngoài loài
(13)
. Phương pháp nhuộm tế bào mang tính trung gian giữa phương pháp
truyền thống và sinh học tế bào tìm cấu trúc phân tử.

cấu trúc đã biết, để dò tìm ADN mới bằng cách hợp nhất theo cơ chế bổ sung với sợi
tương ứng trong hệ gen của cá thể làm đối tượng đang nghiên cứu.
Như vậy, bất kể vùng nào trong hệ gen của các cá thể, các cấu trúc tương
ứng đều có khả năng kết hợp với nhau. Sự kết hợp ADN này không hoàn toàn
tuyệt đối, cho nên phương pháp hợp lai ADN - ADN chỉ có thể sử dụng để biết
tổng thể trong sơ bộ giám định mà không có giá trị thật sự trong khảo sát các đặc
tính cá thể để phân loại. Do vậy, phương pháp này ít được coi là có hiệu quả trong
nghiên cứu về phả hệ. Hơn nữa, đây là phương pháp đắt tiền, khó thực hiện trong
điều kiện phòng thí nghiệm còn thiếu thốn, và lượng ADN nghiên cứu đòi hỏi rất
lớn (tới hàng miligam).
Phương pháp lai ADN phóng xạ
Đó là việc sử dụng một phân đoạn ADN đã biết, được đánh dấu bằng đồng
vị phóng xạ, rồi hợp lai với ADN của hệ gen các cá thể cần nghiên cứu. Nếu có sự
tương ứng đồng nhất về cấu trúc, đoạn ADN gắn đồng vị phóng xạ sẽ kết hợp với
ADN hệ gen và vùng đó sẽ được phát hiện bằng các kỹ thuật tiếp theo của phương
pháp này. Nhiều loại KST được giám định bằng phương pháp này, trong đó có:
Leishmania, Trypanosoma, Schistosoma, Fasciola
(8,10)
, đặc biệt là KST sốt rét,
Plasmodium falciparum. Đối với KST sốt rét, nhiều phương pháp chẩn đoán kể cả
huyết thanh học bằng kháng thể đơn dòng đều rất khó phân biệt các chủng của
chúng, nhưng phương pháp ADN phóng xạ đã cho kết quả chính xác.
Ngày nay, phương pháp này được kết hợp với kỹ thuật PCR (xem phần sau)
và chỉ thị hệ gen nhân, đã cho những kết quả mà các phương pháp khác không thể
đạt được.
Phương pháp phân tích biến thái phân đoạn ADN bằng kỹ thuật
enzym giới hạn (phương pháp RFLP)
Đây là một phương pháp mới, sử dụng enzym giới hạn (restriction
enzyme), cắt rời ADN hệ gen thành nhiều đoạn dài ngắn khác nhau. Khi kiểm tra
trên thạch agarose chúng ta thu nhận được các đoạn (băng) ADN khác nhau, từ đo

Phản ứng PCR
Phản ứng PCR (polymerase chain reaction) được sử dụng rộng rãi từ những
năm đầu 1990, và thực sự là phương tiện có hiệu quả trong nghiên cứu di truyền
phân tử của các loài. Chỉ cần một lượng nhỏ ADN làm khuôn (tinh khiết hoặc hỗn
hợp), PCR có thể nhân lên hàng triệu bản sao ADN vùng cần nghiên cứu. Thông
thường, nếu sử dụng kỹ thuật PCR đơn giản, đoạn ADN thu nhận được có độ dài
cao nhất đến 2.000-3.000 nucleotide. Nếu áp dụng kỹ thuật PCR hiện đại, với
enzym chịu nhiệt cao và bền, có thể thu nhận ADN có độ dài đến trên 10.000,
thậm chí đến 20.000 nucleotide.
PCR là phản ứng enzym xúc tác của enzym ADN polymeraza chịu nhiệt, sử
dụng nhiều nhất là Taq polymearase (phân lập từ vi khuẩn chịu nhiệt Thermus
aquaticus), trong môi trường có nồng độ ion Magiê (Mg
++
) thích hợp, với các
thành phần dẫn chất nucleotide đầy đủ làm nguyên liệu, có hai đoạn ngắn
nucleotide làm mồi (gọi là oligo hay primer). Phản ứng sẽ tiến hành tổng hợp các
đoạn ADN tương ứng trên khuôn ADN, trong giới hạn giữa các primer. Sự tổng
hợp ADN tăng theo cấp số 2
n
, sau 25-40 chu kì, sẽ cho số lượng ADN là hàng
triệu bản sao. Thời gian thực hiện PCR là vài giờ, với chương trình tự động hoá,
nên không tốn công sức. Hiện nay, đã có máy phân tích trật tự nucleotide tự động
(automated sequencer), nên sản phẩm PCR sau khi được làm sạch, sẽ được phân
tích ngay rất thuận lợi cho nghiên cứu.
Phương pháp PCR không đòi hỏi ADN với lượng lớn, nên có thể sử dụng trực
tiếp ADN mẫu vật để làm khuôn, mà không cần phải nuôi cấy (đối với KST chẳng
hạn), do vậy loại trừ ảnh hưởng của vật chủ và môi trường đối với đối tượng nghiên
cứu. Đối với phản ứng PCR, tính vô trùng phân tử phải được chú ý, tránh lẫn tạp
nhiều loại ADN khác nhau
(9)

PCR, chỉ cần một lượng nhỏ (nanogam) cũng đủ, vì ADN của vùng cần nghiên cứu có
thể thu được một lượng lớn qua phản ứng PCR.
Bằng phương pháp này, nhiều nhóm KST đơn bào (Protozoa) và một số sán
lá đã được nghiên cứu và cho bản đồ gen từng vùng của hệ gen.
Phương pháp RAPD phân tích biến thái ADN bằng phản ứng PCR xác
suất
Phương pháp RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), thực chất là
phản ứng PCR nhân các vùng ADN bằng các primer không hoàn toàn đặc hiệu.
Cùng lúc, các cặp primer đó, sẽ cho các đoạn ADN khác nhau, được nhân lên có
tính chất xác suất (không hoàn toàn được xác định trước). Mặc dù vậy, hai cá thể
có tương đồng về di truyền và thuần chủng, sẽ cho số lượng, độ dài các đoạn ADN
tương đương, khi sử dụng các cặp primer như nhau và phản ứng PCR thực hiện
trong điều kiện như nhau. Nếu có sự sai khác (số lượng và độ dài) của sản phẩm
PCR, chắc chắn giữa các cá thể đó đã có sự biến đổi nhất định trong hê gen của
chúng. Tương tự, những cá thể lai thuần sẽ cho bản đồ sản phẩm PCR giống nhau,
lai tạp sẽ cho bản đồ PCR khác nhau.
Khác với PCR đặc hiệu, PCR xác suất (RAPD) sử dụng các cặp primer
không hoặc kém đặc hiệu và ngắn (thông thường 10-12 nucleotide). Các primer
này được tổng hợp dựa trên chuỗi nucleotide bảo tồn trong loài, do vậy, phương
pháp RAPD được sử dụng nghiên cứu cho nhiều chủng trong loài, có tính chất đa
dụng hơn các phản ứng PCR đặc hiệu khác.
Cũng do tính kém đặc hiệu của primer, nên phương pháp RAPD có yếu thế
là nếu sử dụng ADN có lẫn tạp sẽ cho sản phẩm PCR lẫn tạp rất phức tạp khi đánh
giá kết quả. Do vậy, phương pháp RAPD phải được sử dụng một cách thận trọng
trong nghiên cứu sinh học phân tử KST, vì KST là thực thể dễ lẫn tạp với nhiều
loại sinh vật khác, dễ lẫn tạp với vật chủ và môi trường.
Tuy vậy, các phương pháp RFLP, RFLP-PCR và RAPD là những phương
pháp ưu việt trong nghiên cứu giám định, phân loại sinh vật nói chung và KST nói
riêng. Các phương pháp này còn được coi là phương pháp tìm dấu di truyền học
phân tử của loài (DNA finger-printing), kể cả xét nghiệm hình sự ở người và phân