3/24/2011
1
CHƢƠNG V.
CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY
TẾ BÀO TRẦN

Khái niệm tế bào trần
Tế bào trần (Protoplast) = tế bào
đơn – vách
Ứng dụng tế bào trần
• Có khả năng tiếp nhận vật liệu “ngoại
lai”: nhân, ti thể, lục lạp, plasmids, vi
khuẩn và virus
• Có khả năng tái sinh vách tế bào
 Đối tượng lai tạo giống: lai cùng loài,
lai khác loài, lai khác giới sinh vật.
Ứng dụng tế bào trần
• Nghiên cứu sự
tổng hợp và phân
hủy vách tế bào
• Nghiên cứu hệ
thống tế bào đơn

Nuôi cấy tế bào trần
1) Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy;
2) Xử lý enzyme tạo tế bào trần;
3) Tách tế bào trần;
4) Xác định mật độ tế bào trần;


4) Xác định mật độ • Nhuộm bằng phẩm nhuộm fluorescein
diacetate để đánh giá khả năng sống
sót của protoplast
3/24/2011
3

4) Xác định mật độ • Đếm trên buồng đếm hồng cầu để xác
định mật độ
5) Dung hợp tế bào trần 6) Nuôi cấy và tái sinh
tế bào trần
• Môi trường nuôi cấy thường chứa 13%
manitol, auxin, cytokinin,…
• Tái tạo vách tế bào
• Phân chia tạo cụm tế bào
Dung hợp tế bào trần và
sự lai vô tính
Các tế bào trần có thể dung hợp

2) Phƣơng pháp xử lý bằng
nitrate sodium
• Tế bào trần cô lập được đặt trong hỗn hợp
NaNO
3
5,5% trong dung dịch sucrose 10%. Giữ
ổn định trong nước ở 35ºC và sau đó đem đi ly
tâm 200 vòng trong 5 phút.
• Loại bỏ phần nổi và cho các cụm tế bào vào nước
trong 30 phút. Trong suốt quá trình này, hầu
hết các tế bào trần sẽ tiến hành dung hợp. Các
cụm tế bào được gạn ra sẽ được đưa vào trong
môi trường nuôi cấy có bổ sung 0,1% NaNO
3
.
3) Phƣơng pháp xử lý bằng
ion Ca
2+
(pH cao)
• Tế bào trần được ly tâm trong 3 phút ở
tốc độ 50 vòng/phút trong môi trường
cảm ứng sự dung hợp gồm có 0,5M
manitol, 0,05M CaCl
2
.2H
2
O ở pH 10,5.
• Các ống ly tâm có chứa tế bào trần được
ngâm trong nước ở 37ºC trong 40-50
phút. Sau khi xử lý xong có khoảng 20-