ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng
ĐỀ TÀI : Phân tích acid amin bằng
phương pháp sắc ký
phương pháp sắc ký
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM HUẾ
KHOA CƠ KHÍ CÔNG NGHỆ
GVHD : PHẠM TRẦN THÙY HƯƠNG
NHÓM :2.5A.ĐẶT VẤN ĐỀ
A.ĐẶT VẤN ĐỀ
Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của
Amino acid là đơn vị cấu trúc cơ bản của
protei
protei
n là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất
n là chất hữu cơ mà phân tử chứa ít nhất
một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino
một nhóm carboxyl và ít nhất một nhóm amino
trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid
trừ prolin chỉ có nhóm NH(thực chất là một acid
imin).
imin).Có khoảng hơn 20 loại amino acid khác nhau,


Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy
Có nhiều cách thủy phân : bằng axit, kiềm, enzim tùy
vào loại thực phẩm và thành phần của protien.
vào loại thực phẩm và thành phần của protien.Thứ tự thủy phân :
Thứ tự thủy phân :
+Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112
+Đốt nóng lò ở 105 ÷ 112
o
o
C khoảng 20 -30 phút
C khoảng 20 -30 phút
trước khi thủy phân
trước khi thủy phân
+Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực
+Cân mẫu và làm giàu protein (tùy vào loại thực
phẩm)
phẩm)
+Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có
+Dùng tác nhân để thủy phân (như HCl phải có
phenol để ngăn cản halogel hóa của tyrosin )
phenol để ngăn cản halogel hóa của tyrosin )2.
2.
Tạo dẫn xuất:


Quy trình sấy khô
Quy trình sấy khô

Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại
Chuẩn bị hóa chất,dung dịch dùng sấy khô lại

Cho vào bình định mức
Cho vào bình định mức

Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khô
Tiến hành sấy khô hút chân không cho đến khôChuẩn bị dung dich dẫn xuất
Chuẩn bị dung dich dẫn xuất
Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương
Chuẩn bị hỗn hợp theo tỉ lệ các chất tùy vào phương
pháp dẫn xuất
pháp dẫn xuất
Tạo dẫn xuất
Tạo dẫn xuất
(CHO)
2
2
.
.

Thường được viết tắt OPA, phân tử
Thường được viết tắt OPA, phân tử
này là một dialdehyde bao gồm hai
này là một dialdehyde bao gồm hai
nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên
nhóm formyl (CHO) gắn liền kề trên
một vòng benzene. Là chất rắn màu
một vòng benzene. Là chất rắn màu
vàng nhạt được dùng trong việc tổng
vàng nhạt được dùng trong việc tổng
hợp các hợp chất dị vòng và là một
hợp các hợp chất dị vòng và là một
thuốc thử trong phân tích của các
thuốc thử trong phân tích của các
acid amin.
acid amin.
OPA
OPAa. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA

Ortho-phthalaldehyde
Ortho-phthalaldehyde

dẫn xuất của các axit amin với o- phthalaldehyde
(OPA), tiếp theo là tách HPLC ngược pha, các sắc ký
lỏng được trang bị một máy dò fluorometric để phát
hiện các dẫn xuất acid amin. Cường độ huỳnh quang
của phức OPA- acid amin được theo dõi với bước
sóng kích thích 348 nm và bước sóng phát xạ 450
nm.a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA
Dẫn xuất tiền cột:

o-phthalaldehyde (OPA) phản ứng với các acid
amin với sự có mặt của hợp chất thiol để hình
thành các sản phẩm huỳnh quang. N-acetyl-L-
cysteine và 2 -mercaptoethanol

có thể được sử
dụng như là các thiol.

OPA tự nó không phát huỳnh quang và do đó
không ảnh hưởng đến kết quả phân tích. a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPA
Dẫn xuất tiền cột:

Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước
Độ hòa tan và độ ổn định của nó trong dung dịch nước
cùng với tốc độ phản ứng nhanh nên có thể tạo dẫn


Mặc dù OPA không phản ứng với các amin thứ cấp
( proline) để tạo thành các chất huỳnh quang, nhưng quá
trình oxy hóa bằng hypochlorite natri cho phép các amin
thứ cấp phản ứng với OPA.Dẫn xuất sau cột

Cường độ huỳnh quang của phức OPA- acid amin được
đo với một bước sóng kích thích 348 nm và phát xạ bước
sóng 450 nm vì vậy khi tiến hành phân tích dùng đầu dò
huỳnh quang 348nm.

Giới hạn phát hiện tối thiểu khoảng một vài chục pmol cho
hầu hết các dẫn xuất acid amin, tuyến tính trong phạm vi
của một vài pmol đến vài chục nmol.

So với dẫn xuất tiền cột thì dẫn xuất này có độ nhạy thấp
hơn tuy nhiên ưu điểm là có thể phân tích được acid amin
thứ cấp.
a. Phương pháp tạo dẫn xuất OPAb. Phương pháp tạo dẫn xuất NBD-F
Nguyên tắc chung tạo dẫn xuất NBD-F
là phản ứng của các acid amin với 7-


c. Phương pháp tạo dẫn xuất PITC

Phenyl isothiocyanate
Phenyl isothiocyanate
(PITC)
(PITC)
là một thuốc thử được sử dụng
là một thuốc thử được sử dụng
trong HPLC pha đảo ngược
trong HPLC pha đảo ngược
PITC, ít nhạy cảm hơn (OPA) và
PITC, ít nhạy cảm hơn (OPA) và
không thể hoàn toàn tự động
không thể hoàn toàn tự động
tuy nhiên PITC có thể tạo sản
tuy nhiên PITC có thể tạo sản
phẩm ổn định với tất cả các axit
phẩm ổn định với tất cả các axit
amin, trong đó có acid amin thứ
amin, trong đó có acid amin thứ
cấp (proline).
cấp (proline).

PITC phản ứng với axit amin để
PITC phản ứng với axit amin để
tạo thành phenylthiocarbamyl
tạo thành phenylthiocarbamyl
(PTC) hấp thụ cực đại bước
(PTC) hấp thụ cực đại bước

Phát hiện các dẫn xuất bằng cách sử dụng một máy dò tia
cực tím ở 254 nm,
cực tím ở 254 nm,
giới hạn phát hiện
giới hạn phát hiện
tối thiểu
tối thiểu
được
được
khoảng
khoảng1 pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin.
1 pmol cho hầu hết các dẫn xuất acid amin.
T
T
uyến tính thu
uyến tính thu
được trong khoảng 20-500 pmol
được trong khoảng 20-500 pmol
.
.

Các thuốc thử PITC là dễ bay hơi, làm cho nó có thể loại bỏ
Các thuốc thử PITC là dễ bay hơi, làm cho nó có thể loại bỏ
thuốc thử dư thừa, qua đó giảm thiểu khả năng ảnh hưởng
thuốc thử dư thừa, qua đó giảm thiểu khả năng ảnh hưởng
của thuốc thử.
của thuốc thử.

Thay vì để dung môi nhỏ giọt qua một cột ghi sắc ký dưới tác
dụng của trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng
dụng của trọng lực, người ta đặt lên dung môi áp suất khoảng
400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn.
400at để sự dịch chuyển xảy ra nhanh hơn.
•
Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích
Phương pháp này cho phép chúng ta sử dụng các hạt có kích
thước nhỏ trong cột hấp phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa
thước nhỏ trong cột hấp phụ và làm tăng bề mặt tiếp xúc giữa
pha tĩnh và các phân tử chất phân tích đi qua nó. Điều này sẽ
pha tĩnh và các phân tử chất phân tích đi qua nó. Điều này sẽ
tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn hợp.
tăng cường khả năng phân tích các chất có trong hỗn hợp.Nguyên tắc của phương
pháp:II. Định lượng axit amin bằng phương
II. Định lượng axit amin bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)
pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)
1. Chuẩn bị dung dịch axit amin chuẩn:
1. Chuẩn bị dung dịch axit amin chuẩn:

Dùng pipet tự động rút 3,5,7,10 µl dung dịch axit amin
Dùng pipet tự động rút 3,5,7,10 µl dung dịch axit amin
chuẩn cho vào ống nghiệm và làm dẫn xuất như đối với


Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl
Dung dịch HCL 6M có bổ sung phenol 1% (10 μl
phenol cho vào 1 ml hcl
phenol cho vào 1 ml hcl

Bình khí nitơ
Bình khí nitơ
Chất tạo dẫn xuất như Phenylisothiocyanate
Chất tạo dẫn xuất như Phenylisothiocyanate
( PITC) ,
( PITC) ,
Triethylamine (TEA)
Triethylamine (TEA)

Ethanol loại dùng cho HPLC
Ethanol loại dùng cho HPLC
Nước cất lần 2
Nước cất lần 2

Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ cho sắc ký
Dụng cụ và thiết bị hỗ trợ cho sắc ký
II. Định lượng axit amin bằng phương
II. Định lượng axit amin bằng phương
II.
II.
Định lượng axit amin bằng phương
Định lượng axit amin bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)
pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)
5. Xử lý kết quả:
5. Xử lý kết quả:

Xem và so sánh sắc ký đồ của chuẩn và
Xem và so sánh sắc ký đồ của chuẩn và
mẫu
mẫu

Thông số thời gian
Thông số thời gian

Diện tích peak
Diện tích peak

Chiều cao peak trên sắc ký đồ
Chiều cao peak trên sắc ký đồ

Nhận dạng peak và thứ tự các axit amin
Nhận dạng peak và thứ tự các axit amin
trên sắc ký đồ
trên sắc ký đồ


5. Xử lý kết quả:II.
II.
Định lượng axit amin bằng phương
Định lượng axit amin bằng phương
pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)
pháp sắc ký lỏng cao áp(HPLC)
5. Xử lý kết quả:
5. Xử lý kết quả:

Với:
Với:
A – nồng độ axit amin i trong mẫu, mg/g
A – nồng độ axit amin i trong mẫu, mg/g

SM – diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của
SM – diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của
mẫu
mẫu

SC
SC
-
-
diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của
diện tích peak axit amin i trên sắc ký đồ của
chuẩn
chuẩn

chính xác, phương pháp phân tích acid amin bằng
chính xác, phương pháp phân tích acid amin bằng
phương pháp sắc ký đặc biệt là sắc ký lỏng cao
phương pháp sắc ký đặc biệt là sắc ký lỏng cao
áp đã đem lại hiệu quả rất lớn mà các phương
áp đã đem lại hiệu quả rất lớn mà các phương
pháp phân tích thông thường không đáp ứng
pháp phân tích thông thường không đáp ứng
được.
được.