Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
MỘT SỐ PHẢN ỨNG SINH HÓA ĐỊNH DANH VI SINH VẬT
1. Thử nghiệm khả năng chuyển hóa citrate
Nguyên tắc: Xác định vi sinh vật có khả năng sử dụng citrat là nguồn
hydratcarbon duy nhất. Sản phẩm chuyển hóa làm kiềm hóa môi trường và
thay đổi màu của chỉ thị màu
– Cấy vi khuẩn vào môi trường Citrat Simmons, ủ 35 – 37
o
C/24 h
– Phản ứng dương tính: màu xanh nước biển
– Phản ứng âm tính: môi trường không đổi màu
• E. coli
• Enterobacter aerogenes
• Dương tính: môi trường đổi màu xanh lá cây sang xanh nước biển
• Âm tính: không đổi màu
2. Thử nghiệm Catalase
Nguyên tắc: Phát hiện men catalase chuyển hóa năng lượng theo
phương thức hô hấp với oxy là chất nhận điện tử cuối cùng ở các vi khuẩn
hiếu khí và kỵ khí tùy ý
- Lấy một ít vi khuẩn vào que cấy và nhúng vào giọt H
2
O
2
.
Phản ứng (+): có bọt khí xuất hiện
Phản ứng âm tính (-): không có bọt khí xuất hiện
- Không nên sử dụng vi khuẩn cấy trên thạch máu vì dễ dương tính giả
3. Thử nghiệm Oxydase
Nguyên tắc: Phát hiện khả năng sinh enzym cytochrome c oxidase của
vi khuẩn
- Pseudomonas aeruginosa , Neisseria gonorrhoeae và

–Phản ứng dương tính: xuất hiện khối đông tụ. Nếu sau 24h không
thấy xuất hiện khối đông tụ: phản ứng âm tính.
Dương tính: hình thành khối đông huyết tương
6. Thử nghiệm sinh Idol
Nguyên tắc: phát hiện các vi sinh vật có enzym tryptophanase chuyển
hóa trypton tạo thành indol
- Cấy vi khuẩn vào nước trypton, ủ 37
o
C/24 h
- Nhỏ vài giọt thuốc thử Kovacs, phản ứng dương tính: có vòng màu
đỏ cánh sen nổi lên trên (do Indol kết hợp với p-dimethylaminobenzal
dehyde trong thuốc thử Kovacs), nếu không có màu hoặc màu vàng: phản
ứng âm tính
- Với các chủng sinh Indol chậm: thử sau 48 h
– Dương tính: màu đỏ cánh sen
– Âm tính: màu vàng
7. Thử nghiệm MR
Nguyên tắc: phát hiện các vi khuẩn lên men glucose tạo sản phẩm acid
bền.
- VK có phản ứng MR dương tính: pH môi trường ngày càng giảm
2
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- VK có phản ứng MR âm tính: pH môi trường tăng dần (các sản
phẩm có tính acid tạo thành lại chuyển hóa tạo thành các sản phẩm trung
tính)
- Cấy vi khuẩn vào canh thang MR-VP. Ủ 37
o
C từ 2-5 ngày
- Nhỏ vài giọt đỏ methyl 0,02%, đọc kết quả ngay. Phản ứng (+) có
màu đỏ, âm tính màu vàng

• Sinh hơi ◊ hình thành bóng hơi trong ống durham
3
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
* LÊN MEN ĐƯỜNG, SINH H
2
S (TSI)
• Gồm ba đường: Lactose, succrose, glucose
• Cấy hai bước
- Đầu tiên cấy trên mặt nghiêng
- Thứ hai: cấy đâm sâu vào chân thạch. Ủ 37
o
C/24h
• Nếu chỉ lên men Glucose.
- Một lượng nhỏ glucose trong môi trường lên men trong giờ đầu
nuôi cấy.
- Sau đó, vi khuẩn lấy năng lượng trong quá trình oxy hóa peptone
◊ phần thạch nghiêng có màu đỏ (hiện tượng kiềm hóa môi trường)
- Peptone ở phần chân thạch không được sử dụng vì không có O2 ◊
phần chân vẫn giữ nguyên màu vàng
* LÊN MEN ĐƯỜNG TRÊN TSI
• Nếu lên men cả glucose, sucrose và/hoặc lactose
- Từ 18 – 24h, toàn bộ phần chân và mặt nghiêng thạch có màu vàng
- Sau 24 h: kiềm hóa môi trường do vi khuẩn sử dụng pepton, môi
trường chuyển màu đỏ (chỉ ở phần mặt nghiêng vì pepton chuyển hóa trong
điều kiện hiếu khí.
- Nếu lên men sinh hơi sẽ thấy các bọt khí hoặc nứt thạch
- Phân giải sodium thiosulfate thành hydrogen sulfide: phần chân
thạch có màu đen (H
2
S +)

nitrit và ống thử sẽ có màu đỏ. Như vậy, kết luận phản ứng âm tính
- Nếu ống thử không chuyển màu, phản ứng dương tính (vi khuẩn đã
chuyển hóa hết nitrat có trong môi trường)
11. Thử nghiệm phân giải hồng cầu (tan máu)
- Một số vi khuẩn có khả năng phân giải hồng cầu có thể quan sát thấy
trên thạch máu.Vùng tan máu được hình thành xung quanh khuẩn lạc. Có ba
dạng tan máu:
Tan máu (ß): vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc
Tan máu (α): vùng xám xanh xung quanh khuẩn lạc
Tan máu (γ): không có vùng tan máu
12. Thử nghiệm khả năng di động
Nguyên tắc: phát hiện khả năng di của vi khuẩn nhờ có roi ở đầu tế
bào.
– Có thể thử khả năng di động bằng cách cấy đâm sâu trong thạch
mềm, khoảng 2/3 độ dài thạch. Ủ 37
o
C từ 18-24h
– Phản ứng dương tính: Vi khuẩn có thể di động xung quanh
đường cấy, xoắn ốc hoặc làm đục toàn bộ ống thạch
13. Thử nghiệm hóa lỏng gelatin
Nguyên tắc: phát hiện vi khuẩn có men gelatinase phân giải và hóa lỏng
gelatin, quan sát thấy ngay cả khi nhiệt độ thấp hơn 28
o
C
• Có hai phương pháp xác định sự có mặt của men gelatinase
- Cấy vi khuẩn vào thạch dinh dưỡng gelatin, ủ nhiệt độ phòng trong 14
ngày
• Phương pháp gelatin Strip
- Sử dụng dải màu có phủ gelatin. Nếu phản ứng dương tính, có sự thay
đổi màu.

• Pepton dùng cho Vi sinh vật
• Muối tinh khiết (NaCl)
• Glucoza tinh khiết
• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na
2
HPO
4
)
• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH
2
PO
4
)
• Axit lactic dung dịch 20% hoặc 40%
• Axit xitric dung dịch 20%
• Dung dịch NaOH 0,1N
CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG VÀ MẪU THỬ
• Chuẩn bị môi trường
6
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- Môi trường nuôi cấy, nước pha loãng và dung dịch cần thiết được điều chế
theo công thức. Các môi trường được đóng sẵn vào bình nón, ống nghiệm
và được hấp tiệt trùng (110
o
C/30 phút hoặc 121
o
C/15 phút).
• Chuẩn bị mẫu và dung dịch mẫu thử
- Chuẩn bị mẫu
Mẫu thực phẩm được cắt nhỏ hoặc xay nhuyễn bằng máy trong điều

quá 30 phút
7
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
• Ủ ấm:
- Khi thạch đã đông, để các đĩa nuôi cấy vào tủ ấm ở nhiệt độ 28±1
o
C hoặc
khi nhiệt độ phòng tương ứng trong 5 -7 ngày. Không lật ngược đĩa
- Sau 3 ngày, đếm kết quả sơ bộ, đếm tổng số các khóm nấm men và nấm
mốc mọc trên các đĩa (chú ý nhẹ tay, không di chuyển mạnh hay lật ngược
đĩa).
- Sau 5-7 ngày đếm toàn bộ số nấm đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
• Đọc kết quả
- Chọn tất cả các đĩa có số khóm nấm men từ 15 - 150, số khóm nấm mốc từ
5-50 của 2 đậm độ pha loãng liên tiếp để tính kết quả.
- Sự phân bố các khóm nấm trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng
càng cao thì số khóm nấm càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến hành
lại các bước nuôi cấy.
TÍNH KẾT QUẢ
a. Nếu chênh lệch giá trị ở 2 đậm độ nhỏ hơn hoặc bằng 2 lần, tính số (N)
bào tử cho 1g(ml) sản phẩm bằng cách tính tổng số có khóm nấm đếm dược
trên các đĩa theo công thức sau:
ΣC
N =
(n
1
+ 0,1.n
2
) d
- C: Số khóm nấm men hoặc nấm mốc đếm được trên các đĩa đã chọn

-Sử dụng kỹ thuật đổ đĩa đếm số khuẩn lạc trên môi trường thạch, sau
khi ủ hiếu khí ở nhiệt độ 37 ±1
o
C trong thời gian từ 24- 48 giờ. Số lượng vi
khuẩn hiếu khi trong 1g hoặc 1ml mẫu sản phẩm thực phẩm kiểm nghiệm
được tính theo số khuẩn lạc đếm đựơc từ các đĩa nuôi cấy theo các đậm độ
pha loãng.
PHẠM VI ÁP DỤNG: Thực phẩm và thức ăn chăn nuôi
THIẾT BỊ DỤNG CỤ
Các thiết bị thông thường của phòng VSV thực phẩm:
• Đĩa petri thuỷ tinh đường kính 90 -100 mm
• Pipet có chia độ loại 1ml, 5ml, 10 ml đã tiệt khuẩn.
• Nồi cách thuỷ điều chỉnh nhiệt độ 45 ±1
o
C.
• Tủ ấm điều chỉnh nhiệt độ 37 ±1
o
C.
• Tủ sấy khô.
• Nồi hấp áp lực .
• Bình thuỷ tinh dung tích 250- 500ml.
• Ống nghiệm loại 16-160 mm và lớn hơn .
• pH met hoặc giấy đo pH.
HÓA CHẤT MÔI TRƯỜNG
• Thạch dùng cho vi sinh vật
• Pepton dùng cho vi sinh vật
• Muối tinh khiết (NaCl)
• Natri hydrophotphat tinh khiết (Na2HPO4)
• Kalidihydrophotphat tinh khiết (KH2PO4)
• Natri hydroxit tinh khiết (NaOH)

khác nhau cho vào giữa từng đĩa petri, mỗi đậm độ nuôi cấy vào 2 đĩa
petri
• Thạch đã đun nóng chảy, để nguội đến 45 ±1
o
C trong điều kiện vô
khuẩn. Rót vào từng đĩa 12-15ml môi trường thạch, trộn đều dung
dịch mẫu với môi trường bằng cách lắc nhẹ sang phải và sang trái mỗi
chiều 3 lần.
• Để các đĩa thạch đông tự nhiên trên mặt phẳng ngang.
• Thời gian bắt đầu pha loãng đến khi rót môi trường vào đĩa không
được quá 30 phút
• Nếu dự đoán trong sản phẩm có chứa vi sinh vật mọc lan trên mặt
thạch thì sau khi môi trường đã đông đổ tiếp 4ml thạch màng lên trên
bề mặt
• Để thạch đông, lật ngược đĩa và ủ ấm ở 37 ± 1
o
C từ 24- 48 giờ.
11
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
ĐỌC KẾT QUẢ
• Sau 48 giờ tính kết quả sơ bộ bằng cách đếm những khuẩn lạc đã mọc
trên các đĩa nuôi cấy, sau 72 giờ tính kết quả chính thức, đếm toàn bộ
số khuẩn lạc đã mọc và ghi nhận kết quả chính thức.
• Sự phân bố các khuẩn lạc trên các đĩa petri phải hợp lý. Độ pha loãng
càng cao thì số khuẩn lạc càng ít. Nếu kết quả không hợp lý phải tiến
hành lại các bước nuôi cấy.
TÍNH KẾT QUẢ
Chọn những đĩa có từ 15-300 khuẩn lạc của hai đậm độ pha loãng liên tiếp
để tính kết quả
N =

-3
có 60 và 75 khuẩn lạc
12
dnn
C
).1,0(
21
+
∑
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn (10
-2
)để tính kết quả.
180 + 250
N = = 21500
2 x 10-2
Kết quả: 2,0 x102 CFU/1g hoặc 1ml sản phẩm
* Nếu 2 đĩa của sản phẩm lỏng nguyên chất hoặc đậm độ pha loãng ban đầu
(10
-1
) có ít hơn 15 khuẩn lạc, tính kết quả theo trung bình cộng các khuẩn
lạc đếm được ở cả 2 đĩa tính cho 1g hay 1ml sản phẩm. VD
- Ở đậm độ pha loãng 10
-1
của sản phẩm đặc có 12 và 8 khuẩn lạc
- Ở đậm độ pha loãng 10
-2
có 6 và 7 khuẩn lạc
Chọn đậm độ pha loãng thấp hơn 10
-2

Định nghĩa Coliform mới
- Coliforms thuộc họ Enterobacteriaceae, lên men lactose sinh acid và gas
(24-48h/36±2°C)
- Fecal coliform : có khả năng phát triển và lên men lactose ở 44,5±2°C;
bao gồm E.coli, Klebsiella, Enterobacter và Citrobacter (E.coli thủy phân
tryptophan tạo thành Indol)
Coliforms được coi là VSV chỉ điểm vệ sinh
14
Enzyme based methods
• Escherichia coli
• Klebsiella
• Enterobacter
• Citrobacter
• Yersinia
• Serratia
• Hafnia
• Escheri
chia coli
• Klebsiel
la
•Enterobacter
• Citrobacter
• Yersinia
• Serratia
• Hafnia
Acid production from lactose
• Escher
ichia coli
• Klebsiella
• Enterobacter

ruột động vật.
15
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
- Pipet có vạch đã vô trùng loại xả hết 1 và 10 ml
- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1°C
- Bình thuỷ tinh vô trùng, dung tích 250 – 500ml
- Ống nghiệm vô trùng 16 – 18 mm
- pH met, chính xác tới 0,1 đơn vị pH ở 25°C
- Ống Durham
Môi trường
- Dung dịch pepton – muối
- Canh thang Tryptose Lauryl sulfat ( Môi trường tăng sinh chọn lọc)
- Canh thang mật lactose lục sáng (Lactose Bile Brilliant Green Broth –
môi trường thử khẳng định)
Các bước tiến hành
 Chuẩn bị mẫu thử và đậm độ pha loãng ban đầu:
- Sản phẩm dạng đặc: Cân 10g mẫu thử đã đồng nhất cho vào 90 ml dung
dịch pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu (10
-1
). Từ đó pha
loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng
các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.
- Sản phẩm dạng lỏng: Hút 10ml sản phẩm ban đầu cho vào bình đã có sẵn
90ml nước pepton – muối để được đậm độ pha loãng ban đầu. Từ đó pha
loãng các đậm độ tiếp theo tuỳ từng mẫu thử nhưng phải ước lượng rằng
các ống tương ứng với độ pha loãng cuối cùng sẽ cho kết quả âm tính.
 Cấy mẫu và ủ ấm:
- Canh thang tăng sinh nồng độ kép:
Dùng pipet vô trùng hút 10 ml mẫu ban đầu (sản phẩm dạng lỏng) hoặc
10ml đậm độ 10

VD: 3 3 0 0 0
2 2 0 1 0
- Xác định chỉ số MPN
- Tính số có xác suất lớn nhất
Nhân chỉ số MPN với số đảo của độ pha loãng thấp nhất được chọn.
Với nồng độ kép:chia chỉ số MPN cho 10.
17
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
HÌNH THÁI
• Vi khuẩn hình cầu, đường kính 0.8-1.0 μ
• Đứng riêng rẽ, thành đôi, hoặc tụ thành đám như chùm nho.
• Tụ cầu thường không có vỏ, không có lông, không di động
• Không sinh nha bào
• Bắt màu Gram dương
ĐẶC TÍNH NUÔI CẤY
• Hiếu khí, kỵ khí tuỳ tiện, mọc dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy
thông thường
• Phát triển được trong điều kiện nhiệt độ và pH chênh lệch nhiều (từ 10
– 45
o
C).
• Trong môi trường canh thang, sau 5 – 6 giờ vi khuẩn đã làm đục môi
trường, sau 24 giờ, môi trường đục rõ, vi khuẩn phát triển nhiều
nhưng nếu để lâu, canh thang trở nên trong, bề mặt có váng mỏng, dễ
lắng xuống.
• Trên môi trường thạch thường, sau 24 giờ vi khuẩn đã phát triển
mạnh, khuẩn lạc dạng S, trơn, lồi, sáng bóng, bờ đều, có sắc tố vàng
nhạt hoặc vàng thẫm. Sắc tố có thể thay đổi khác nhau, nhiều chủng
màu da cam, những chủng kháng kháng sinh sắc tố thường màu vàng,

phân của acid hyaluronic
• Penicillinase: tụ cầu gây bệnh có thể tiết ra men này làm mất tác dụng
của Penicillin
ĐỘC TỐ
Độc tố tan máu (hemolysin) có ba loại chính:
- Độc tố tan máu α, gây tan hồng cầu thỏ ở nhiệt độ 37
o
C. độc tố này
gây hoại tử da và gây chết, là ngoại độc tố, có tính kháng nguyên cao
và có thể trở thành giải độc tố.
- Độc tố tan máu β có tác dụng làm tan hồng cầu cừu ở 40C, ít độc hơn
độc tố α.
- Độc tố tan máu δ có tác dụng lên hồng cầu người đã rửa và gây hoại
tử da.
- Độc tố diệt bạch cầu(Leucocidin): làm bạch cầu mất tính di động và bị
phá huỷ nhân.
- Các độc tố ruột: các độc tố này gây nhiễm độc thức ăn và viêm ruột
cấp. Các độc tố ruột chỉ do một số chủng tụ cầu tiết ra, gồm bốn loại,
trong đó mới có hai loại được biết rõ là: độc tố ruột A do chủng gây
nhiễm độc thức ăn, độc tố ruột B do chủng gây viêm ruột sinh ra
KHẢ NĂNG GÂY BỆNH
• Các bệnh ngoài da: gây viêm nhiễm các vết xước tạo thành mụn, nhọt
đầu đinh, đinh râu…
• Nhiễm khuẩn huyết do tụ cầu: thường xảy ra ở những người đề kháng
yếu hoặc trẻ em. Bệnh thường nặng, có thể gây chết người hoặc trở
19
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
thành mạn tính gây nên viêm xương, viêm khớp, viêm phổi, viêm cơ…
• Nhiễm độc thức ăn và viêm ruột cấp tính: bệnh thường xảy ra nhanh,
trầm trọng với các dấu hiệu nôn mửa dữ dội

6.6
o
C, tụ cầu sẽ phát triển và sinh độc tố.
20
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG S.AUREUS
1.Nguyên lý phương pháp
Dựa trên khả năng sinh Lecithinase phân giải Lecithin của
Staphylococcus aureus trên môi trường chọn lọc có bổ sung lòng đỏ
trứng và Kali tellurit, nuôi cấy ở 35- 37
o
C/24 – 48h. Số lượng
Staphylococcus aureus trong một ml hoặc một g mẫu kiểm nghiệm được
tính bằng số khuẩn lạc điển hình trên môi trường chọn lọc và có phản
ứng đông huyết tương dương tính.
2. Phạm vi áp dụng: Định lượng Staphylococcus aureus trong thực phẩm
và thức ăn chăn nuôi.
NỘI DUNG
1.Thiết bị, dụng cụ
- Tủ sấy 180 – 200
o
C
- Nồi hấp áp lực
- Tủ ấm 25 ±1
o
C
- Đĩa petri đường kính 90 – 100mm
- Pipet có vạch đã vô trùng loại 1,5,10 ml
- Nồi cách thuỷ, nhiệt độ 45 ±1
o

mẫu thử ban đầu. Lặp lạii với các đậm độ pha loãng khác.
• Sản phẩm dạng khác: cấy vào 2 đĩa thạch Bair parker, mỗi đĩaa 0,1ml
đậm độ pha loãng ban đầu (đậm độ 10
–1
) Lặp lại với các đậm độ pha
loãng khác.
• Dùng que cấy gạt thuỷ tinh dàn đều mẫu trên mặt thạch, lưu ý làm
càng nhanh càng tốt để mẫu không bị khô.
• Để 15 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó lật ngược đĩa thạch và để vào tủ
ấm 35-37 ± 1
o
C/ 24-48h
3.3 Đếm khuẩn lạc
• Chỉ tính những đĩa có từ 15-150 khuẩn lạc.
• Đếm tất cả những khuẩn lạc điển hình (màu đen, bóng, lồi, đường
kính từ 1-1,5 mm, bao quanh bởi một vùng đục sát khuẩn lạc và vùng
trong phía bên ngoài) và không điển hình (không có vùng trong).
3.4 Thử khẳng định
• Từ mỗi đĩa chọn 5 khuẩn lạc điển hình để làm phản ứng sinh hóa, mỗi
khuẩn lạc cho vào một ống canh thang tăng sinh BHI, nuôi ở 35-
37
o
C/20 -24h
• Cho 0,1ml môi trường đã nuôi cấy vào 0,3ml huyết tương thỏ, để ở
35-37
o
C / 4-6h. Phản ứng được coi là dương tính khi phần đông huyêt
tương chiếm 1/2 thể tích dung dịch.
22
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4

nc
số lượng khuẩn lạc không điển hình cho thấy có phản ứng dương
tính với coagulase
• C
c
là tổng số khuẩn lạc điển hình nhìn thấy trên đĩa
• C
nc
là tổng số khuẩn lạc không điển hình nhìn thấy trên đĩa
Số lượng S.aureus có phản ứng dương tính với coagulase đã
nhận dạng trên có mặt trong mẫu thử
24
Môn: Kỹ thuật phân tích Vi sinh – nấm thực phẩm II ATTP 4
Σa
N =
V (n
1
+ 0,1 n
2
) d
• Σa là tổng số khuẩn lạcc Staphylococci có phản ứng dương tính với
coagulase được nhận dạng có mặt trong mẫu thử
• V là thể tích của chất cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml
• n1 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ nhất
• n2 là số đĩa đã được chọn ở độ pha loãng thứ hai
• d là độ pha loãng tương ứng với dung dịch pha loãng thứ nhất đã chọn
(huyền phù ban đầu là một độ pha loãng)
4 Biểu thị kết quả
• Độ pha loãng 10
-2