LỜI CẢM ƠN
Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo Viện Công nghệ sinh
học và Môi trường, trường Đại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và giảng
dạy nhiệt tình, giúp cho tôi có được những kiến thức quý báu trong suốt thời gian
học tập tại trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Anh Thư đã tận
tình dìu dắt, chỉ bảo và truyền đạt những kinh nghiệm quý báu cho tôi trong suốt
thời gian tôi thực hiện đề tài.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè,
những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần rất
lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian học tập và
thực hiện đồ án vừa qua.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người!

Nha Trang, tháng 07 năm 2012
Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thị Ngọc
i

MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN
DANH MỤC BẢNG iv
DANH MỤC HÌNH v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT vii
LỜI NÓI ĐẦU 1
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1. TÌNH HÌNH NUÔI TÔM, DỊCH BỆNH VÀ NGHIÊN CỨU 2
1.1.1. Trên thế giới 2

2.3.2. Tách chiết RNA tổng số 25
2.3.2.1. Nguyên tắc 25
2.3.2.2. Phương pháp tiến hành 25
2.3.3. Nhân gen bằng kỹ thuật RT- PCR 26
2.3.3.1. Thiết lập điều kiện phản ứng 26
2.3.3.2. Thí nghiệm tối ưu nhiệt độ lai 28
2.3.3.3. Tính đặc hiệu của phương pháp 28
2.3.3.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp (độ nhạy của quy trình) 29
2.2.4. Điện di trên gel agarose 29
2.2.4.1. Nguyên tắc 29
2.2.4.2. Phương pháp tiến hành 29
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31
3.1. QUY TRÌNH RT-PCR CHẨN ĐOÁN BỆNH LSNV 31
3.1.1. Các đặc tính của mồi trên lý thuyết 31
3.1.1.1. Các thông số của mồi 31
3.2.1.2. Tính đặc hiệu của mồi 34
3.2.2. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế và các điều kiện của phản ứng
PCR 35
3.2.2.1. Khảo sát sự hoạt động của mồi trên thực tế 35
3.2.2. Xác định nhiệt độ bắt cặp tối ưu 36
iii

3.2.3. Xác định tính đặc hiệu 38
3.2.4. Giới hạn phát hiện của phương pháp 39
3.3. ỨNG DỤNG QUY TRÌNH RT-PCR TRÊN MẪU TÔM SÚ KHU VỰC TỈNH
KHÁNH HÒA 42
3.3.1. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo mùa thu mẫu 44
3.3.2. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo khu vực thu mẫu 45
3.3.3. Tỷ lệ tôm sú nhiễm LSNV theo loại mẫu 47
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 50
v

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Sản lượng tôm nuôi trên thế giới năm 2001 5
Hình 1.2: Năng suất và sản lượng tôm nuôi Việt Nam từ năm 2001 đến năm 2011.
6
Hình 1.3: Kết quả so sánh trình tự nucleotide một phần gen RNA polymerase phụ
thuộc RNA (RdRp) từ chủng LSNV phân lập ở Sóc Trăng (LSNV-VN) và các
chủng ở Thái Lan 8
Hình 1.4: Kết quả phân tích sự tương đồng của chuỗi trình tự acid amin của LSNV
và một số virus có RdRp từ họ Luteovirida và từ Nấm 9
Hình 1.5: Cây phân loại chuỗi 13 acid amin virus RNA polymerase phụ thuộc
RNA (Clustal W) tần số khởi động 1000 10
Hình 1.6: Hình tôm sú thả nuôi sau 100 ngày có biểu hiện chậm lớn (con có kích
thước nhỏ) so với tôm bình thường (con có kích thước bình thường) trong cùng một
ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng 12
Hình 1.7: Thể vùi mô tôm bị nhiễm bệnh và mô tôm bình thường nhuộm bằng kỹ
thuật nhuộm thường quy (H & E) 14
Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ (insitu) dương tính với mẫu dò
20A của mẫu tôm ở độ phóng đại thấp (a) và ở độ phóng đại cao (b) 14
Hình 1.9: Ảnh chụp hiển vi điện tử mẫu tôm nhiễm bệnh cho thấy các hạt virus 15
Hình 1.10: Chu kì của phản ứng PCR 17
Hình 1.11: Sơ đồ minh họa một quy trình RT- PCR 20
Hình 2.1: Sơ đồ cách tiếp cận các nội dung nghiên cứu của đề tài 24
Hình 3.2: Cấu trúc kẹp tóc của mồi 20AF và 20AR 32
Hình 3.3: Một số cấu trúc self- dimer của mồi 33
Hình 3.4: Một số cấu trúc hetero- dimer của mồi 20AF/AR 33
Hình 3.5: Kết quả blast trình tự mồi xuôi và mồi ngược trên Genbank 34

Btv : Bệnh lưỡi xanh (Bluetongue virus)
BYDV : Bệnh vàng lùn lúa mạch (Barlay yellow drawf virus)
C : Cytidine
CABYV : Virus truyền bệnh qua rệp vàng trên cây bí (Cucurbit aphid-borne
yellows luteovirus)
cDNA : Complementary DNA
dATP : Deoxyadenosine triphosphate
dCTP : Deoxycytidine triphosphate
dGTP : Deoxyguanosine triphosphate
DEPC : Nước cất xử lý Diethylpyrocarbonate
DIG : Digoxigenin
DNA : Deoxyribonucleic acid
dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate
dTTP : Deoxythymidine triphosphate
dUTP : Deoxyuridine Triphosphate
EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid
FAO : Food and Agriculture Organization
G : Guanosine
GAV : Virus gây bệnh trên mang (Gill associated virus)
ha : Hecta
viii

HPV : Bệnh gan tụy (Hepatopacreatic parvovirus)
H&E : Kỹ thuật nhuộm thường quy (Hematoxylin and Eosin)
Ibdv : Virus gây bệnh Gumboro ở gà (Infectious bursal disease
virus)
IHHNV : Virus gây bệnh hoại tử cơ quan tạo máu và dưới vỏ
(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus)
ISH : Lai tại chỗ (in situ hybridization)
JEV : Japanese encephalitis virus (Bệnh viêm não Nhật Bản)

YHV : Bệnh đầu vàng (Yellow Head virus)
WSSV : Bệnh đốm trắng (White spot syndrome virus)
Wnv : West nile virus 1

LỜI NÓI ĐẦU
Nuôi tôm thâm canh hiện đang phát triển nhanh chóng và ngày càng mang
lại nhiều lợi nhuận cho nhiều nước trên thế giới. Trong đó tôm sú (P. monodon) là
loài quan trọng được nuôi tại Việt Nam từ hơn 30 năm qua. Trong nhiều năm loài
này được xem là giống chính đưa Việt Nam vào danh sách những nước cung cấp
tôm quan trọng của thế giới. Mặc dù vậy, rủi ro cho nghề nuôi tôm cũng không nhỏ,
dịch bệnh hiện đang là một trở ngại lớn trong sự phát triển ngành nuôi tôm công
nghiệp ở Việt Nam nói riêng và trên thế giới nói chung. Dịch bệnh do virus là một
trong những nguyên nhân gây nguy hiểm cho môi trường biển. Người ta ước tính
rằng khoảng 60% thiệt hại kinh tế ở tôm nuôi trồng thủy sản đã được gây ra bởi các
mầm bệnh virus và 20% bởi các mầm bệnh vi khuẩn. Có nhiều loài virus được tìm
thấy trên tôm nuôi đặc biệt là trên tôm sú (P. monodon) như GAV, YHV, MBV,
HPV Laem singh virus (LSNV) là loại virus mới được phát hiện gây thiệt hại
nghiêm trọng cho ngành nuôi tôm công nghiệp. Tôm sú nhiễm bệnh này thường
không thể hiện rõ biểu hiện bệnh hoặc có sự chậm lớn nên thường kéo dài vụ nuôi
và kích thước tôm nuôi làm giảm năng suất và giá trị tôm sú nuôi. LSNV có mặt ở
tất cả các giai đoạn sản xuất từ tôm sú bố mẹ, tôm giống và tôm nuôi thương phẩm
với tỷ lệ cao ở Việt Nam. Do chưa có thuốc chữa trị đặc hiệu
nên
công tác phòng

Nuôi trồng thủy sản là một trong những lĩnh vực sản xuất có các đóng góp đáng
kể vào nền kinh tế của nhiều quốc gia và cung cấp một lượng lớn nhu cầu thực
phẩm thủy sản cho con người, đồng thời đóng góp tích cực vào việc làm giảm lượng
carbon trong khí quyển, góp phần làm giảm biến đổi khí hậu Trong các đối tượng
thuỷ sản thì tôm là đối tượng nuôi đem lại lợi ích kinh tế nhiều nhất. Theo công bố
của Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực thế giới (FAO – Food and Agriculture
Organization), sản lượng tôm nuôi ngày càng tăng, mức tăng bình quân khoảng
10,5% mỗi năm, cụ thể năm 2003 ước đạt 1,35 triệu tấn tăng 11% so với sản lượng
ước tính năm 2002 và 15% so với sản lượng thực tế năm 2001. Hơn thế nữa, theo
dự báo của trung tâm thủy sản thế giới, nhu cầu tiêu thụ tôm ngày càng tăng ở cả
các nước phát triển và các nước đang phát triển. Với hiệu quả kinh tế và xã hội to
lớn trên, nghề nuôi tôm thực sự trở thành nghề sản xuất thu hút các nhà đầu tư. Theo
ước tính sản lượng tôm nuôi thế giới 2007 – 2012 của Liên minh người nuôi trồng
thủy sản toàn cầu (Global Aquaculture Alliance) tại Hội thảo 2010 đã công bố
thông tin về sản lượng tôm thế giới (Bảng 1.1). Ước tính sản lượng tôm nuôi ngày
càng tăng.
Bên cạnh những lợi nhuận mang lại thì thiệt hại do nghề nuôi tôm gây ra cũng
rất lớn. Dịch bệnh liên tiếp xảy ra ở nhiều khu vực nuôi tôm, đặc biệt là ở các nước
châu Á. Trong đó bệnh virus bùng phát gây ảnh hưởng đặc biệt nghiêm trọng đến
ngành công nghiệp nuôi tôm trên toàn thế giới. Ước tính tổng thiệt hại do virus gây
ra là hàng tỷ USD mỗi năm.
Năm 2002, nông dân nuôi tôm ở Thái Lan gặp hàng loạt vấn đề với hiện tượng
chậm lớn ở tôm sú nuôi MSGS (Monodon slow growth syndrome) (Kanokporn và
cộng sự, 2004). Báo cáo sau đó ở hội nghị lần thứ 5 của tổ chức Asia Regional
Advisory Group về lĩnh vực sức khỏe vật nuôi thủy sản (2006) cho thấy hội chứng
3

chậm lớn đặc biệt tác động nghiêm trọng lên các hộ nuôi tôm sú ở Thái, và đã làm
thiệt hại lớn về sản lượng (ước lượng khoảng 1,6 tỷ USD) vào năm 2002. Hội
chứng chậm lớn trên tôm sú nuôi (Monodon Slow Growth Syndrome, MSGS) xuất

Nhóm nghiên cứu của tác giả Prakasha đã tiến hành thu ngẫu nhiên 56 mẫu tôm
bệnh ở khu vực ven bờ Tây Nam và Đông Nam Ấn Độ để xác định một số tác nhân
gây bệnh WSSV, MBV, HPV bằng phương pháp PCR và LSNV bằng phương pháp
RT-PCR. Kết quả cho thấy 3 trong số 56 mẫu dương tính với virus LSNV và đồng
thời cũng bị nhiễm WSSV, MBV hoặc HPV (Prakasha và cộng sự, 2007). Một
nghiên cứu vừa được công bố gần đây của tác giả Sittidilokratna đã ghi nhận một số
mẫu tôm sú phát triển bình thường cũng nhiễm LSNV, cụ thể là Việt Nam có 2
trong số 6 mẫu tôm sú bình thường được xác định bị nhiễm LSNV, Malaysia có 6/6
mẫu tôm sú bình thường nhiễm LSNV và 39 trong số 40 mẫu tôm sú có nguồn gốc
từ Thái Lan có biểu hiện chậm lớn được xác định nhiễm LSNV. Cũng trong nghiên
cứu này các tác giả đã điều tra 81 mẫu tôm sú thu năm 2007 ở Andhra Prades Ấn
Độ, kết quả cho thấy có đến 58,1% số mẫu bị nhiễm LSNV (Sittidilokratna và cộng
sự, 2009).
1.1.2. Tại Việt Nam
Tại Việt Nam, nghề nuôi tôm cũng đã phát triển khá lâu nhưng thực sự phát
triển mạnh trong những năm gần đây. Diện tích ao tôm ngày càng được mở rộng,
đồng thời sản lượng tôm nuôi cũng tăng mạnh, đặc biệt từ sau năm 2000 Việt Nam
5

trở thành một trong những nước có sản lượng tôm nuôi cao nhất trên thế giới.


khoảng 2,39 tỷ USD, riêng xuất khẩu tôm sú đạt trên 1,43 tỷ USD. Sau lần đầu tiên
vượt qua mốc 2 tỷ USD năm 2010, tôm đã trở thành mặt hàng đơn lẻ thứ 4 của Việt
Nam đạt và vượt giá trị xuất khẩu 2 tỷ USD/năm (sau dầu thô, gạo và cao su), tốc
độ xuất khẩu tôm Việt Nam ngày càng tăng mạnh về giá trị đáng kể so với tốc độ
tăng khối lượng. Xuất khẩu tôm chiếm 18% về khối lượng và 38% về giá trị xuất
khẩu của thủy sản Việt Nam ( />xuat-nhap-khau/toan-canh-xuat-khau-tom-nam-2011/).
Các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long là khu vực nuôi tôm có kim ngạch xuất
khẩu thủy sản chủ yếu của nước ta. Năm 2011 xuất khẩu thủy sản của vùng này ước
đạt 4 tỷ USD, tăng 27% so với năm 2010.
Các tỉnh ven biển Miền Trung điển hình như tỉnh Khánh Hòa cũng là khu vực
có sản lượng tôm thương phẩm lớn. Năm 2011, tổng diện tích nuôi tôm thương
7

phẩm toàn tỉnh Khánh Hòa đạt khoảng 6.484 ha. Trong đó, diện tích nuôi tôm tôm
sú là 532 ha. Tổng sản lượng tôm thương phẩm đạt 13.993 tấn, riêng tôm sú 1.909
tấn. Hàng năm, kim ngạch xuất khẩu các mặt hàng thủy hải sản của Khánh Hòa
chiếm khoảng 300 triệu USD, góp phần đáng kể vào kim ngạch xuất khẩu thủy sản
của cả nước ( />san-luong-tom-thuong-pham-dat-gan-14000-tan.htm).
Mặc dù vậy nghề nuôi tôm vẫn còn nhiều khó khăn do kỹ thuật nuôi của người
dân chưa cao, hằng năm vẫn bị thiệt hại khá lớn bởi dịch bệnh mà chủ yếu là dịch
bệnh do virus gây ra. Hiện tượng tôm nuôi thường bị dịch bệnh lây lan trên diện
rộng đã gây thiệt hại kinh tế nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Năm 2011, diện
tích nuôi tôm bị nhiễm bệnh là 97.691 ha, trong đó trong đó trên 82.000 ha nuôi
tôm sú bị thiệt hại ( />tom-su-se-tiep-tuc-giam.html). Mặc dù tôm sú vẫn giữ vị trí chủ đạo trong cơ cấu
xuất khẩu tôm Việt Nam, tuy nhiên tỷ trọng về khối lượng và giá trị đang giảm
dần gây nhiều thiệt hại cho người nuôi
tôm.

Theo báo cáo của Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, giai đoạn 1995-
2003 phong trào nuôi tôm sú ở Khánh Hòa phát triển khá rầm rộ. Một thời gian dài,

đồng 97% với chủng LSNV phân lập ở Ấn Độ và tương đồng 98% với chủng
LSNV phân lập tại Thái Lan. Kết quả này đã khẳng định có sự hiện diện virus
LSNV trên tôm sú nuôi tại Việt Nam (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011).

Hình 1.3: Kết quả so sánh trình tự nucleotide một phần gen RNA polymerase phụ
thuộc RNA (RdRp) từ chủng LSNV phân lập ở Sóc Trăng (LSNV-VN) và các chủng
ở Thái Lan (FJ356709, FJ356710, DQ127905, EF593037) (Nguyễn Viết Dũng và
cộng sự, 2011)

9

1.2. VIRUS GÂY HỘI CHỨNG CHẬM LỚN (LSNV)
1.2.1. Hình thái, Cấu trúc
LSNV là một loại virus gây bệnh trên tôm sú. Virus này có hình lập phương,
đường kính 15-25nm, không có màng bao icosahedron, mật độ trong CsCl là
1,1843g/ml (Panphut và cộng sự, 2011), vật liệu di truyền là RNA chuỗi đơn dương
(Sittidilokratna và cộng sự, 2009).
- Tên khoa học : Laem Singh Virus
- Tên thông thường : LSNV
- Cấp độ : Loài
- Nòi : Viruses


Hình 1.5: Cây phân loại chuỗi 13 acid amin virus RNA polymerase phụ thuộc RNA
(Clustal W) tần số khởi động 1000
Bao gồm các virus giống hình trên và các virus Sfv – Semliki forest
virus, số đệ trình trên GenBank CAA75053; Rrv - Ross river virus, NP740681; JEV
– virus viêm não Nhật Bản, NP059434; Wnv – West nile virus, NP776022; Ibdv –
virus gây bệnh Gumboro ở gà, NP690839; Btv – virus lưỡi xanh, P13840
(Sritunyalucksana và cộng sự, 2006).
Tuy nhiên, phân tích phát sinh loài (Hình 1.5), cho thấy virus trong họ
Luteoviridae hình thành một nhánh riêng biệt, trong khi virus nấm bacilliform và
LSNV giảm giữa nhánh và phân nhánh của đại diện từ các họ Togaviridae, họ
Flaviviridae và nhóm virus dsRNA gồm virus gây bệnh Gumboro ở gà (Ibdv) và
11

virus lưỡi xanh (Btv) với các giá trị khởi động thấp. Vì vậy cần thêm thông tin bộ
gen cần thiết để phân loại thích hợp loại virus này.
1.2.2. Cơ chế xâm nhiễm
Khi xâm nhập vào tôm, virus sẽ cư trú ở nhiều bộ phận như nội bì, mô, mang,
mắt, chân bơi và các bộ phận khác.
Sau khi xâm nhập vào tế bào vật chủ, virus cởi áo trong không bào của tế bào
chất, RNA được dùng trực tiếp làm mRNA để tổng hợp protein không cấu trúc,

hoạch ao tôm nuôi
Các đặc trưng này phân biệt hôi chứng chậm lớn khác với chậm lớn do MBV và
HPV gây nên (Sritunyalucksana và cộng sự, 2006).

Hình 1.6: Hình tôm sú thả nuôi sau 100 ngày có biểu hiện chậm lớn (con có kích
thước nhỏ) so với tôm bình thường (con có kích thước bình thường) trong cùng một
ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng (Nguyễn Viết Dũng và cộng sự, 2011)
1.2.5. Sự nhạy cảm của các loài tôm với LSNV
Bệnh LSNV có khả năng lây lan nhanh, rộng và gây hiện tượng chậm lớn
trong suốt quá trình nuôi. Để kiểm tra khả năng lây nhiễm của virus LSNV, tác giả
Sathish Kumar đã phân tích 6 loài tôm (gồm P.monodon, Fenneropenaeus
merguiensis, Metapenaeus dobsoni, Litopenaeus vannamei, F. indicus,
Marsupenaeus japonicus) ở nhiều giai đoạn sống, có nguồn gốc từ tự nhiên và từ
các trang trại, cũng như ấu trùng của Cua Scylla serrata (Sathish Kumar và cộng sự,
2011). Kết quả kiểm tra bằng RT-PCR cho thấy ngoài sự lây lan giữa tôm sú (P.
13

monodon) với nhau thì một số loài giáp xác quanh khu vực ao nuôi tôm sú cũng đã
được xác định là bị lây nhiễm với virus LSNV trong thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo
trên gồm Fenneropenaeus merguiensis, Metapenaeus dobsoni và cả tôm thẻ
Litopenaeeus vannamei. Do virus LSNV có khả năng lây nhiễm ở các loài giáp xác
quanh khu vực nuôi nên có thể rất ảnh hưởng đến sự lan truyền của virus LSNV
trong hệ thống canh tác.
LSNV cũng được phát hiện trong cả tôm sú có kích thước nhỏ và bình thường
được thu thập từ cùng một ao. Tỷ lệ bị nhiễm LSNV tăng dần ở các tháng nuôi sau
so với tôm sú giống, tôm càng lớn thì tỉ lệ nhiễm virus LSNV càng cao.
1.2.6. Mô mục tiêu
LSNV xâm nhiễm và sao chép trong các mô có nguồn gốc ngoại bì và trung
phôi bì. Tuy nhiên, mô mục tiêu chủ yếu bao gồm: mang, chân bơi, cơ quan tạo
máu Lymphoid, mô thần kinh và các mô khác. Ngoài ra LSNV còn được tìm thấy ở

Lai tại chỗ (in situ hybridization - ISH) là một kiểu lai phân tử trong đó trình
tự nucleic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tại
chỗ cho phép nghiên cứu nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết.
Phương pháp lai tại chỗ được phát triển để chẩn đoán bệnh LSNV [3, 11] bằng
cách sử dụng mẫu dò 20A đánh dấu digoxigenin (DIG) chuyên biệt cho LSNV để dò
tìm sự hiện diện của virus trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm bệnh. Sự bắt cặp của mẫu dò
với RNA virus trên mẫu tôm cho phép kết luận mẫu tôm bị nhiễm bệnh (hình 1.8). Hình 1.8: Ảnh chụp hiển vi phản ứng lai tại chỗ (insitu) dương tính với mẫu
dò 20A của mẫu tôm ở độ phóng đại thấp và ở độ phóng đại cao(Sritunyalucksana
và cộng sự)
15

1.3.3. Phương pháp kính hiển vi điện tử truyền qua
Kính hiển vi điện tử truyền qua (transmission electron microscopy, TEM) là
một thiết bị nghiên cứu vi cấu trúc vật rắn, sử dụng chùm điện tử có năng lượng cao
chiếu xuyên qua mẫu vật rắn mỏng và sử dụng các thấu kính từ để tạo ảnh với độ
phóng đại lớn (có thể tới hàng triệu lần), ảnh có thể tạo ra trên màn huỳnh quang,
hay trên film quang học, hay ghi nhận bằng các máy chụp kỹ thuật số.
TEM được sử dụng để chẩn đoán sự có mặt của LSNV (Anantasomboon và
cộng sự, 2006; Sritunyalucksana và cộng sự, 2006; Panphut và cộng sự, 2011).