iii
LỜI CẢM ƠN
Sau hơn 3 tháng thực tập tại Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y
miền Trung, dưới sự hướng dẫn của thầy TS. Võ Thành Thìn và ThS. Nguyễn
Thị Kim Cúc cùng các anh, chị ở Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y
miền Trung và các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ
Sinh học và Môi trường, trường đại học Nha Trang tôi đã hoàn thành cuốn luận
văn này.
Qua đây, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc đến TS. Võ Thành Thìn - phó
Trưởng Bộ môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung và ThS.
Nguyễn Thị Kim Cúc – giảng viên Bộ môn công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ
Sinh học và Môi Trường đã tận tình chỉ bảo, giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi
để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp của mình.
Tôi cũng xin chân thành cản ơn ban lãnh đạo trường Đại học Nha Trang cùng
toàn thể các thầy giáo, cô giáo trong Viện Công nghệ sinh học và Môi trường đã
tận tình chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức quý báu cho tôi trong những năm
học vừa qua. Cảm ơn cô Ths. Khúc Thị An – Trưởng Bộ môn công nghệ sinh học,
đã giúp đỡ tôi hoàn thành một số giấy tờ của luận văn tốt nghiệp này
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Phạm Trung Hiếu, các anh chị trong Bộ
môn Nghiên cứu Vi trùng, Phân viện Thú y miền Trung đã trực tiếp giúp đỡ và chỉ
dạy cho tôi hoàn thiện về một số kỹ năng và thao tác trong phòng thí nghiệm.
Tôi xin chân thành cảm ơn các bạn Trần Minh Tùng, Đoàn Văn Tiến và Lại
Nhật Linh đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực tập.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, nhóm học tập “WAO”, cùng
toàn thể bạn bè thân thiết đã tạo điều kiện, động viên khích lệ để tôi vượt qua mọi
khó khăn trong quá trình học tập, nghiên cứu.
Nha Trang, tháng 7 năm 2012
Sinh viên thực hiện

1.2.3. Cơ chế sinh bệnh 12
1.2.4. Một số đặc điểm bệnh học và lâm sàn của bệnh Leptospirosis ở lợn
và ngƣời 13
1.2.4.1. Bệnh Leptospirosis ở lợn 13
1.2.4.2. Bệnh Leptospirosis ở ngƣời 14
1.3. MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP CHẨN ĐOÁN BỆNH
LEPTOSPIROSIS 15
1.3.1. Chẩn đoán vi khuẩn học 15
1.3.2. Chẩn đoán huyết thanh học 17
1.3.3. Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử 17
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LEPTOSPIROSIS TRÊN
LỢN TẠI VIỆT NAM 18
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19
2.1. ĐỐI TƢỢNG, THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 19
2.1.1. Thời gian cứu 19
2.1.2. Địa điểm nghiên cứu 19
2.1.3. Đối tƣợng nghiên cứu 19
2.2. NGUYÊN LIỆU NGHIÊN CỨU 19
2.2.1. Vật liệu 19
2.2.2. Môi trƣờng, hóa chất 19
2.2.3. Kháng nguyên chuẩn 20
vi
2.2.4. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm 21
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
2.3.1. Phƣơng pháp lấy mẫu 22
2.3.2. Phƣơng pháp phát hiện Leptospira trong mẫu bệnh phẩm 23
2.3.2.1. Chiết tách DNA 24


viii
DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Hình 1.1. Hình Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dƣới kính hiển vi điện tử
6
Hình 2.1. Sơ đồ các bƣớc thực hiện để phát hiện bệnh Leptospirosis ở lợn 23
Hình 2.2. Nguyên lý phản ứng PCR 28
Hình 2.3. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 31
Hình 3.1. Sản phẩm phản ứng PCR trên thạch agarose 34
Hình 3.2. Sản phẩm phản ứng PCR xác định giới hạn nồng độ DNA 35
Hình 3.3. Sản phẩm phản ứng PCR xác định tính đặc hiệu 37
Hình 3.4. Kết quả PCR mẫu DNA tách chiết từ thận ở lấy mẫu ở các lò mổ tại
Buôn Hồ - Đắk Lắk 39
Hình 3.5. Kết quả PCR mẫu DNA tách chiết từ thận ở lấy mẫu ở các lò mổ tại
Phù Cát – Bình Định 40

long móng, tiêu chảy ở đàn gia súc. Đặc biệt bệnh Leptospirosis một bệnh cũ nhưng
mà mới (cơ chế gây bệnh và sự phá hủy các tổ chức bên trong cơ thể vật chủ của
Leptospira đến nay vẫn chưa được làm rõ). Với nhiều chủng huyết thanh khác nhau,
thì xoắn khuẩn Leptospira đã gây bệnh ở nhiều đối tượng gia súc, vật nuôi và kể cả
con người. Ở mỗi loài gia súc khác nhau đều có thể mắc một hay nhiều serotype
khác nhau. Leptospira gây bệnh trên động vật mà không biểu hiện triệu chứng lâm
sàng được gọi là động vật mang trùng. Những động vật mang trùng, chúng không
thể hiện triệu chứng lâm sàng nhưng mang một lượng lớn Leptospira trong thận và
thải ra ngoài qua nước tiểu – đây là nguồn lây nhiễm mầm bệnh rất nguy hiểm cho
người và động vật nuôi.
Với tổng đàn lợn đạt 27,8 triệu con, tổng lượng thịt hơi xuất chuồng ước tính
đạt 3,2 triệu tấn (tính đến cuối năm 2011) [1], như vậy đàn lợn là nguồn cung cấp
thịt chủ yếu nhất cho thị trường cả nước. Nhưng trên lợn bệnh Leptospirosis đã tồn
tại trên mấy chục năm cho tới nay vẫn không kiểm soát được các nguồn lây nhiễm.
Hơn nữa, cấu trúc phân tử cũng như cơ sở di truyền phân tử của Leptospira vẫn còn
trong quá trình nghiên cứu, thì bệnh Leptospirosis vẫn đang là một vấn đề nan giải.
Lợn là đông vật mang trùng serovar Ponoma, Tarassovi, nên rất dễ lây truyền. Xoắn
khuẩn xâm nhập vào cơ thể qua da ẩm ướt, vết thương trên da, niêm mạc đường hô
hấp, đường tiêu hóa. Chỉ với một lượng rất nhỏ, Leptospira sau khi xâm nhập vào
cơ thể sẽ gây ra mẫm cảm.
Động vật và người mắc bệnh Leptospirosis thường rất ít thể hiện triệu chứng
và triệu chứng có thể biểu hiện khác nhau ở từng cá thể. Vì thế, việc chẩn đoán
bệnh trong phòng thí nghiệm là rất cần thiết. Một trong những phương pháp sử
dụng phổ biến là phát hiện kháng thể kháng Leptospira đặc hiệu trong huyết thanh
bằng phản ứng vi ngưng kết tan trên phiến kính (MAT – microscopic agglutination
2
test). Ngoài ra có thể phát hiện kháng thể bằng phản ứng ngăn trở gián tiếp hồng

Về phân loại khoa học Leptospira được xếp vào:
Giới: Monera
Ngành: Spirochaetes
Họ: Leptospiraceae
Giống: Leptospira [43]
Các loài gồm có L. alexanderi, L. biflexa, L. broomii, L. borgpetersenii,
L. fainei, L. inadai, L. interrogans, L. kirschneri, L. licerasiae, L. meyeri,
L. weilii, L. noguchii, L. santarosai, L. wolbachii, L. kmetyi, L. wolffii,
L. genomospecies 1, L. genomospecies 3, L. genomospecies 4, L. genomospecies 5
Trong đó, loài L. interrogans và L. fiainei được xem là có động lực cao nhất
trên người và động vật [51], [45], [9].
1.1.1.2. Phân loại theo cấu trúc kháng nguyên
Dựa vào cấu trúc đặc hiệu của kháng nguyên LPS (Lipopolysaccharide) trên
bề mặt tế bào và cấu trúc di truyền của Leptospira, có hơn 260 serovar khác nhau đã
được xác định. Các serovar này lại thuộc các serogroup khác nhau, trong đó có
nhiều serovar gây bệnh cho vật nuôi [34].
Bảng 1.1. Một số serogroup thƣờng gặp của các loài Leptospira [34]
STT
Loài
Serogroup
1
L. interrogans
Icterohaemorrhagiae, Canicola, Ponoma, Australis,
Autumnalis, Pyrogenes, Grippotyphosa, Djasiman,
Hebdomadis, Sejroe, Bataviae, Ranarum, Luoisiana,
Mini, Sarmin, Panama, Cynopteri, Tarassovi, Ballum,
Celledoni, Manhao, Shermani, Hurstbrige.
2
L. noguchii
Panama, Autumnalis, Pyrogenes, Tarassovi, Bataviae,

Autumnalis.
9
L. Kirschneri
Grippotyphosa, Autumnalis, Cynopteri, Hebdomadis,
Australis, Ponoma, Djasiman, Canicola,
Icterohaemorrhagiae, Bataviae.
10
L. weilii
Celledoni, Icterohaemorrhagiae, Sarmin, Javanica,
Mini, Tarassovi, Hebdomadis, Pyrogenes, Manhao,
Sejroe.
11
L. inadai
Lyme, Shermani, Icterohaemorrhagiae, Tarassovi,
Tarassovi, Manhao, Canicola, Panama, Javanica.
12
L. parva
Turneria
13
L. alexanderi
Manhao, Hebdomadis, Javanica, Mini

Các serovar gây bệnh thường mang tính đặc trưng loài như Canicola chủ yếu
gây bệnh ở chó, Bratislava ở ngựa và lợn, Hardjo ở bò, Australis và Pomona ở lợn
[11], [15], [22], [26]. Bên cạnh đấy, có rất nhiều serovar khác có thể gây bệnh ở vật
nuôi như ở lợn là Grippotyphosa, Canicola, Tarassovi, Icterohaemorrhagiae; ở bò là
Pomona, Australis, Bratislava, Sejroe, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae,
Canicola; ở chó là Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Copenhageni; ở
ngựa là Pomona, Grippotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Hardjo; ở cừu là Pomona và
Hardjo (bảng 1.2) [47], [23], [34], [9].

1.1.2.1. Đặc điểm cấu tạo
Xoắn khuẩn Leptospira có cấu trúc màng tế bào 2 lớp. Trong đó, lớp màng
cytoplasmic và peptidoglycan liên kết chặt chẽ với nhau và được che phủ bởi lớp
màng bao gồm protein, lipid và LPS (lipoplysaccharide) [27]. Lớp
lipopolysaccharide của Leptospira có thành phần tương đối giống ở vi khuẩn gram
âm tuy nhiên có độc tính thấp hơn [34]. Genome của Leptospira có kích thước
khoảng 5000kb và chia thành 2 phần là 4400kb choromosome và 350kb
chromosome; xoắn khuẩn có 2 hệ gene 16s và 23rRNA [25], [12]. Một số gene của
Leptospira đã được dòng hóa và phân tích chức năng như gene quy định quá trình
tổng hợp acid amin, rRNA, protein ở ribosome, RNA-polymerase, DNA repair, heat
shock protein, shingomyelinase, hemolysins, protein màng ngoài, quá trình sinh
tổng hợp LPS [34], [9]. 6
1.1.2.2. Đặc điểm hình thái của Leptospira
Leptospira có dạng hình xoắn khuẩn, đường kính khoảng 0,1µm, dài 6-20µm
biên độ xoắn khuẩn khoảng 0,1 – 0,15µm, chiều dài lượn sóng khoảng 0,5µm [23].
Hai đầu xoắn hoặc hình móc câu. Leptospira có khả năng di động do cấu tạo ở mỗi
đầu có một nội roi (endoflagelle), được đính vào giữa màng ngoài và màng trong
của vi khuẩn [20]. Các phương pháp nhuộm cổ điển như phương pháp nhuộm
Gram không dùng được cho Leptospira mặc dù chúng có cấu trúc rất gần với vi
khuẩn gram âm. Có thể quan sát Leptospira dưới kính hiển vi quang học nền đen,
hoặc nhuộm thấm bạc cổ điển như phương pháp Warthin – Starry.

Hình 1.1. Hình Leptospira Icterohaemorrhagiae chụp dƣới kính hiển vi điện tử
(Courtesy of Rod Weyant, Centers for Control and Prevention) [23]

C xoắn khuẩn chết trong 4 giờ [15]. Nhưng ở nhiệt độ thấp
vi khuẩn có khả năng tồn tại trong một thời gian dài có khi tới hàng năm [24].
Với ánh sáng: dưới ánh sáng chiếu trực tiếp, xoắn khuẩn chết trong vòng 30
phút đến 2 giờ, với tia tử ngoại phải sau 4 giờ xoắn khuẩn mới bị tiêu diệt hoàn
toàn [15].
Với các chất kháng sinh: các xoắn khuẩn mẫn cảm với nhiều loại kháng sinh
như penicillin, amoxicillin, ampicillin
Với hoá chất và thuốc sát trùng: Leptospira bị tiêu diệt nhanh chóng bởi hoá
chất như: dung dịch xút 5%, cồn 20%, dung dịch phenol 0,5%, axit chlohydric 2%,
crezyl 5%, formol 0,25%, axit phenic 5%
1.1.2.5. Một số yếu tố độc lực của Leptospira
Các chủng Leptospira có độc lực cao có khả năng đề kháng với bổ thể và bạch
cầu trung tính của hệ thống đáp ứng miễm dịch không đặc hiệu của vật chủ, chúng
chỉ bị tiêu diệt nhanh bởi kháng thể đặc hiệu có trong máu [21].
8
Có rất nhiều yếu tố độc lực của Leptospira đã được xác định. Theo Merien và
cs., (1997), khả năng gây bệnh của Leptospira xâm nhiễm vào tế bào Vero và làm
giảm khả năng tiêu diệt tế bào lạ của đại thực bào liên quan mật thiết đến độc lực
của chúng [38]. Năm 2000, Merien và cs., đã tìm thấy một loại protein có trọng
lượng phân tử là 36KDa (fibronectin binding protein) liên quan đến yếu tố độc lực
này. Protein này chỉ được tìm thấy trên các chủng Leptospira có độc lực của serovar
Icterohaemorrhagiae và không có mặt ở các chủng không có độc lực và những
chủng hoại sinh (saprophyte strain) [39].
LPS của Leptospira có thành phần hóa học và đặc tính kích thích miễn dịch
giống vi khuẩn gram âm. Tuy nhiên, độc tính của chúng trên thỏ, trên chuột, tương
tác với tế bào lympho B yếu hơn so với LPS của vi khuẩn gram âm [46], [53].
Khả năng dung huyết của Leptospira có ở nhiều serovar khác nhau và có ít

mà thận bị nhiễm trùng mãn tính và chuột thải mầm bệnh ra môi trường bằng nước
tiểu. Tất cả loài có vú khác, hoang dã cũng như vật nuôi, cũng có thể là vật mang
trùng Leptospira, đó là những vật mang trùng rất khác nhau. Các động vật này cho
cư trú và dữ trự ở trong thận các chủng huyết thanh đặc biệt đáp ứng gây bệnh.
Chúng ít nhạy cảm với Leptospira và có xu hướng không gây bệnh nên chỉ làm phát
triển một thể mạn tính. Trong chu kỳ của bệnh Leptospirosis, sự đào thải Leptospira
từ thận cũng là một yếu tố chủ chốt làm chúng tồn tại trong môi trường và làm ô
nhiễm đất và nước. Nước nhiễm trùng là một nguồn bệnh gián tiếp rất quan trọng
cho người và động vật [23].
Thời gian mang xoắn khuẩn và bài xuất mầm bệnh ra ngoài tùy thuộc vào loài
vật mang trùng, mùa vụ, thói quen sinh hoạt và các Serovar Leptospira khác nhau
như: Trâu, bò 120 ngày, lợn 300 ngày và chó 700 ngày. Mầm bệnh tồn tại lâu trong
đất, nước, phân, rác, chất thải là nguy cơ gây bệnh, phát dịch bất cứ khi nào gặp
điều kiện thuận lợi [8].
Các động vật bị nhiễm Leptospira đều có thể trở thành vật mang trùng ẩn tính,
chúng ít mẫn cảm với Leptospira và lưu giữ mầm bệnh ở ống thận, cho phép
Leptospira phát triển và sau đó đào thải ra môi trường qua nước tiểu [34].
10
Sự đào thải Leptospira từ thận là một trong những yếu tố quan trọng giúp
chúng tồn tại trong môi trường và làm ô nhiễm đất và nguồn nước, đây là nguồn
truyền bệnh gián tiếp cho người và động vật.
Leptospira có thể tồn tại trong nước, sông suối, những vùng đất kiềm [23],
trong ao hồ, sông ngòi và đầm lầy [30].
1.2.2. Con đƣờng lây nhiễm của bệnh Leptospirosis
Từ các nguồn nhiễm khuẩn, xoắn khuẩn có thể xâm nhập vào cơ thể người và
vật nuôi qua da ẩm ướt, vết thương trên da, niêm mạc đường hô hấp, đường tiêu hóa
(hình 1.2). Chỉ cần một lượng rất nhỏ, Leptospira sau khi xâm nhập vào cơ thể sẽ

bị bệnh Leptospira truyền qua.
 Bệnh còn có thể truyền qua do thụ tinh nhân tạo hoặc giao phối trực tiếp.
Chuột là ổ chứa mầm bệnh Leptospira và thải ra môi trường bên ngoài bằng mước
tiểu làm ô nhiễm nguồn thức ăn, nước uống. Gia súc, động vật hoang dã và người
bị nhiễm bệnh do tiếp xúc với môi trường có nhiễm xoắn khuẩn Leptospira. Động
vật và người mắc bệnh lại tiếp tục đào thải mầm bệnh ra môi trường xung quanh
12
làm lây bệnh cho các loài động vật mẫn cảm khác…Vòng truyền lây được tàng trữ
và khép kín, trong đó vật nguy hiểm nhất là chuột - loài mang trùng (Hình 1.2).
1.2.3. Cơ chế sinh bệnh
Leptospira xâm nhập khi đạt được số lượng nhất định trong máu và tổ chức,
các bệnh tích và triệu chứng của bệnh bắt đầu xuất hiện do tác động của độc tố, tính
độc của vỏ tế bào. Leptospira làm phá vỡ các vi mao mạch dẫn đến thiếu máu cục
bộ ở các khí quan, gây ra các hiện tượng bệnh lý ở thận, gan, màng não, lách. Gia
súc mắc bệnh nặng có hiện tượng xuất huyết và vàng da [9]. Nếu gia súc mắc bệnh
ở thể mạn tính, trên các khí quản đặc biệt là thận có thể xuất hiện những chấm màu
trắng sữa [23].
Leptospira xâm nhập vào cơ thể chỉ sau 12 giờ đã phát hiện có xoắn khuẩn
trong gan, xoắn khuẩn tập trung ở đây cho đến lúc có triệu chứng sốt. Trong một số
trường hợp còn thấy Leptospira ở tuyến thượng thận, cơ tim…Khi cơ thể gia súc bị
sốt, Leptospira có nhiều trong máu có thể kéo dài tới một tuần. Cơ thể bắt đầu sản
sinh kháng thể và có thể tìm thấy được sau 5-10 ngày [28]. Hàm lượng kháng thể
trong máu cao nhất xác định được sau 3 tuần từ khi gia súc sốt [51]. Xoắn khuẩn
Leptospira tiết độc tố làm phá hủy hồng cầu, gây thiếu máu trầm trọng dẫn đến
vàng da, nước tiểu có huyết sắc tố. Độc tố phá vỡ thành mao mạch của mô liên kết
dưới da gây nên hiện tượng xuất huyết, thẩm lậu dịch cùng với triệu chứng phù nề,
vàng da… Số lượng xoắn khuẩn Leptospira trong máu, gan, phổi…giảm dần và

nhiều, thỉnh thoảng có những con run giật tăng dần, nhiều con kêu thét lên sau đó
ngã chúi xuống đất, lúc đứng dậy loạng choạng. Thân nhiệt tăng cao 40 - 41,5
o
C.
Sau 4 - 5 ngày, niêm mạc, da có màu vàng, nước tiểu vàng có huyết sắc tố, mắt có
ghèn, thậm chí bị mù. Lợn con có thể thấy vàng da, sốt nhẹ kèm theo tiêu chảy
nhưng không quá 3 ngày nên khó nhận biết. Lợn con theo mẹ bị thiếu máu, da nhợt
nhạt và hơi vàng, chậm lớn, lông dựng và phù rõ ở đầu [56].
Thể mạn tính: bệnh phát âm ỉ, thời gian nung bệnh từ 3 - 20 ngày, lợn ăn ít
hoặc bỏ ăn, uống nhiều nước, táo bón sau chuyển sang tiêu chảy, tiểu khó khăn,
nước tiểu vàng, nước mắt chảy nhiều, thỉnh thoảng có những cơn run giật nhẹ. Mũi
14
lợn khô bóng, mõm sưng, dần dần mặt phù to, mi mắt sụp xuống.
Ở heo đực, bao dương vật sưng to trương thành một cái túi, đầu dương vật có khi
thò ra ngoài không tụt vào được. Ở lợn con, da có thể bong từng mãng, có con hai
chân sau bị liệt nằm một chỗ hoặc đi khập khiễng. Lợn nái thường có những rối
loạn về sinh sản, sảy thai có thể từ 10 - 30% . Lợn con đẻ ra chết ngay hoặc có thể
sống nhưng còi cọc chết dần [56].
1.2.4.2. Bệnh Leptospirosis ở ngƣời
Bệnh do Leptospira gây ra ở người nguy hiểm nhất là do các serovar
Icterohaemorrhagiae và Copenhageni nhưng cũng có serovar khác gây bệnh nặng
như Gryppotyphosa, Pyrogenes, có thể gây tử vong [3].
Theo Lê Trung, (1997) thì các serovar Leptospira gặp phổ biến ở người
là Canicola, Icterohaemorrhagiae, Grippotyphora, Hyos, Bataviae, Sejoe, Autralis,
Saxkoebing và Pomona. Ở Việt Nam hay gặp các serovar như Icterohaemorrhagiae,
Canicola, Pomona, Grippotyphosa, Autralis. Trong đó, serovar phổ biến nhất ở
người là Icterohaemorrhagiae. Tuy nhiên, các serovar có khả năng truyền lây trực

Tuỳ theo thời gian và thể bệnh có thể lấy các bệnh phẩm khác nhau:
- Sốt trong tuần lễ đầu thì lấy máu
- Sốt trên 10 ngày thì lấy nước tiểu
- Nếu súc vật chết thì lấy gan, thận, óc.
Bệnh phẩm là máu: Phải lấy súc vật đang sốt vì lúc này trong máu nhiều xoắn
khuẩn Leptospira. Máu được chống đông băng citrat natri 5%, để lắng, hút lớp dịch
trong ở trên nhỏ lên phiến kính và soi tìm vi khuẩn bằng kính hiển vi tụ quang nền
đen.
Bệnh phẩm là nước tiểu: Lấy khi gia súc hết sốt (thường vào ngày thứ 3 -5 sau
khi sốt) vì lúc này xoắn khuẩn Leptospira khu trú ở thận nhiều nhất. Nước tiểu đem
ly tâm, lấy cặn phết lên phiến kính và soi tìm xoắn khuẩn dưới kính hiển vi tụ quang
nền đen. Nước tiểu phải xem ngay, không quá 12 giờ vì rất dễ nhiễm tạp khuẩn.
16
Bệnh phẩm là phủ tạng: Phải lấy càng sớm càng tốt sau khi gia súc chết để
hạn chế tạp khuẩn. Bệnh phẩm đem nghiền với nước sinh lý theo tỷ lệ 1/50, ly tâm
lấy nước trong xem tươi trên kính hiển vi tụ quang nền đen hoặc có thể nhuộm tiêu
bản băng các phương pháp: Romanopski – Giemsa hoặc Frontana – Tribonda [51].
b. Nuôi cấy phân lập
Bệnh phẩm lấy để tiến hành nuôi cấy phân lập tìm xoắn khuẩn Leptospira bao
gồm: Máu, thận, gan, lách, nước tiểu Tuy nhiên, yêu cầu lấy bệnh phẩm để nuôi
cấy phải tuyệt đối đảm bảo vô trùng, không nhiễm tạp, không bị hư hỏng do nhiệt
độ, hoá chất bệnh phẩm lấy phải dùng ngay. Môi trường sử dụng để nuôi cấy hiện
nay là EMJH.
Bệnh phẩm là phủ tạng: Cắt nhỏ cho vào cối nghiền, nghiền nhỏ cho vào một
ống môi trường EMJH, lắc đều, ly tâm, lấy nước chuyển sang ống thứ 2 tiếp tục
làm như vậy theo cách pha loãng bậc 10. Đặt các ống môi trường đã cấy vào tủ ấm
28

- Vàng da, vàng niêm mạc mắt
Lấy máu tim hoặc nước phúc mạc kiểm tra sẽ thấy xoắn khuẩn
Sau 6 - 12 ngày nhiệt độ hạ, con vật sẽ chết [54]
1.3.2. Chẩn đoán huyết thanh học
Là phương pháp cơ bản và quan trọng nhất trong chẩn đoán Leptospirosis
vì nó không chỉ xác định được vi khuẩn gây bệnh mà còn cho biết serovar
Leptospira nào gây bệnh [44]. Phương pháp này đòi hỏi phải có các serovar
Leptospira đã biết, số lượng serovar tuỳ thuộc từng nơi, từng nước sử dụng và huyết
thanh chẩn đoán lấy ở gia súc nghi bệnh.
Gia súc sau khi nhiễm bệnh khoảng một tuần trong máu có kháng thể, sau 3
tuần hàm lượng kháng thể trong máu cao nhất rồi giảm dần [28]. Các phương pháp
chẩn đoán huyết thanh học để phân biệt các serovar Leptospira là:
- Phản ứng với kháng nguyên chết (hấp thu hồng cầu thụ động)
- Phản ứng vi ngưng kết tan – MAT với kháng nguyên sống.
- Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IF - Immuno Fluorescence)
- Phản ứng ELISA.
1.3.3. Sử dụng phƣơng pháp sinh học phân tử
Hiện nay, kỹ thuật PCR và RT – PCR cũng được sử dụng rộng rãi để chẩn
đoán bệnh do Leptospira gây ra [50], [35], [9]. Một số kỹ thuật sinh học phân tử
18
hiện đại khác cũng đã được ứng dụng để chẩn đoán Leptospira như RFLP [31],
VNRT [36], giải trình tự gen 16S rRNA [40], MLST [10].
1.4. MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ BỆNH LEPTOSPIROSIS TRÊN LỢN
TẠI VIỆT NAM
Ở Việt Nam, bệnh Leptospirosis trên gia súc được nghiên cứu từ rất sớm
(1968-1978). Theo Vũ Đình Hưng và Nguyễn Thị Diện (1968-1978) trâu bò và chó
đều mắc bệnh này với tỉ lệ rất cao, với 35,1% ở trâu, ở lợn là 22,9% và ở chó là