i
LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn em đã nhận
được rất nhiều sự quan tâm, giúp đỡ, động viên của tập thể các thầy cô hướng dẫn,
gia đình và bạn bè. Nhân dịp này em xin chân thành bày tỏ sự biết ơn sâu sắc tới:
Toàn thể thầy cô, cán bộ thuộc Viện Công nghệ sinh học và môi trường,
Trường Đại học Nha Trang đã tận tình truyền đạt kiến thức trong suốt 4 năm học
tập. Với vốn kiến thức được tiếp thu trong quá trình học không chỉ là nền tảng cho
quá trình nghiên cứu khóa luận mà còn là hành trang quí báu để em bước vào đời.
Thầy PGS.TS Ngô Đăng Nghĩa, Viện trưởng Viện Công nghệ sinh học và
môi trường và cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương người đã trực tiếp hướng dẫn và tận
tình chỉ bảo cho em những lời khuyên hữu ích trong suốt thời gian em thực hiện đề
tài.
Ban quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, phòng thực hành Hóa
sinh – Vi sinh, Khoa Chế biến đã tạo điều kiện cho em thực hiện đề tài này.
Em xin cảm ơn những người bạn của em không những động viên mà còn
cùng đồng hành, sát cánh với em trong quá trình thực hiện đề tài.
Con cảm ơn bố mẹ đã luôn âm thầm cổ vũ, ủng hộ cho con và là nguồn động
viên lớn nhất mỗi khi con cảm thấy khó khăn nhất.
Cuối cùng em kính chúc quý Thầy, Cô dồi dào sức khỏe và thành công trong
sự nghiệp cao quý.
Nha trang, ngày 02 tháng 07 năm 2012
Sinh viên thực tập
Ngô Yến Thủy
ii
MỤC LỤC
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 24
2.1.1 Nguyên liệu đầu tôm 24
2.1.2 Enzyme Alcalase 24
2.1.3 Hóa chất 24
2.1.4 Thiết bị 24
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1 Phương pháp thu nhận mẫu 24
2.2.2 Bố trí thí nghiệm tổng quát 25
2.2.3 Xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 26
2.2.4 Xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung
enzyme 27
2.2.5 Thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein
bằng Alcalase 28
2.2.6 Bố trí thí nghiệm tối ưu quy trình khử protein bằng Alcalase 31
2.3 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU PHÂN TÍCH. 33
2.4 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU 33
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Thành phần hóa học của phế liệu đầu tôm thẻ chân trắng 34
3.2 Ảnh hưởng của xử lý nhiệt nguyên liệu ban đầu và bổ sung enzyme 35
3.3 Ảnh hưởng của các yếu tố tới quá trình khử protein 37
3.4 Tối ưu công đoạn tách protein của đầu tôm bằng Alcalase 42
3.5 ĐỀ SUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT 48
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ SUẤT Ý KIẾN 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC 55
iv
DANH MỤC KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Hình 2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 25
Hình 2.2 Bố trí thí nghiệm xác định thành phần hóa học phế liệu đầu tôm thẻ chân
trắng 26
Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt nguyên
liệu ban đầu và bổ sung enzyme 27
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến hiệu quả
khử protein 28
Hình 2.5 Bố trí thí nghiệm tối ưu quá trình khử protein bằng Alcalase 31
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của việc xử lý nguyên liệu ban đầu và bổ sung
Alcalase đến hiệu quả khử protein 35
Hình 3.2 Kết quả phân tích ảnh hưởng của các yếu tố tới khả năng hoạt động của
Alcalase 38
Hình 3.3 Đồ thị Half normal về ảnh hưởng của các nhân tố 38
Hình 3.4 Đồ thị về sự tương tác giữa nhiệt độ và tỷ lệ Enzyme/nguyên liệu 39
Hình 3.5 Đồ thị thể hiện sự tương tác giữa nhiệt độ và thời gian 41
Hình 3.6 Đánh giá mức độ phù hợp của phương trình 43
vii
Hình 3.7 Kết quả ANOVA phân tích các biến số 43
Hình 3 8 Kết quả phân tích ANOVA 44
Hình 3.9 Đường đồng mức về mối tương quan giữa thời gian và nhiệt độ tới hiệu
quả khử protein 46
Hình 3.10 Đường đồng mức về mối tương quan giữa nồng độ enzyme và nhiệt độ
tới hiệu quả khử protein 46
Hình 3.11 Quy trình đề suất khử protein đầu tôm bằng Alcalase 49
1
MỞ ĐẦU
cao còn gây cắt đứt mạch chitin làm giảm độ nhớt của chitosan.
Gần đây đã có nhiều nghiên cứu về việc sử dụng enzyme cho việc thu hồi
protein, chitin nhưng chưa có nghiên cứu nào đi sâu vào tối ưu hóa bằng enzyme
Alcalase sử dụng phương pháp mặt đáp ứng. Có nhiều yếu tố như nhiệt độ, nồng độ
enzyme, thời gian như trong nhiều báo cáo trước đây ảnh hưởng tới quá trình thủy
phân protein bằng enzyme. Phương pháp mặt đáp ứng Box Benhken được thiết kế
để đánh giá ảnh hưởng của từng yếu tố trên và tác động qua lại giữa chúng nhằm
mục đích tối ưu hóa, cho ra giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán mà phương pháp
thực nghiệm cổ điển chưa giải quyết được. Vì vậy đề tài: ”Ứng dụng phương pháp
mặt đáp ứng để tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng
enzyme Alcalase” được thực hiện nhằm giải quyết hạn chế đã nêu.
Mục tiêu đề tài:
- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến quá trình khử protein trên đối tượng
đầu tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) bằng enzyme Alcalase.
- Áp dụng phương pháp mặt đáp ứng để thiết lập chế độ khử protein từ phế
liệu đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme Alcalase.
Tính khoa học và thực tiễn của đề tài:
Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ cung cấp thêm cơ sở dữ liệu về việc sử
dụng enzyme trong công nghệ sản xuất chitin, giúp hiểu biết sâu hơn về các yếu tố
ảnh hưởng đến quá trình khử protein bởi Alcalase nói riêng và protease nói chung.
từ các kết quả tối ưu thu được sẽ cho phép mô hình hoá quá trình chiết xuất chitin
và thu hồi các sản phẩm hữu ích ở qui mô pilot và qui mô công nghiệp.
Nội dung đề tài:
- Đánh giá ảnh hưởng của công đoạn xử lý nhiệt sơ bộ nguyên liệu đến hiệu
quả khử protein bằng enzyme Alcalase.
- Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố đến khả năng khử protein của Alcalase.
- Tối ưu quá trình khử protein trên đầu tôm thẻ chân trắng bằng enzyme
Alcalase sử dụng phương pháp mặt đáp ứng.
3
Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO), từ nay đến năm 2015, tiêu
thụ thủy sản tính theo đầu người trên toàn cầu sẽ tăng trưởng khoảng 0,8%/năm,
tổng nhu cầu thủy sản và các sản phẩm thủy sản sẽ tăng khoảng 2,1%/năm. Đó là
một điều kiện thuận lợi để các doanh nghiệp thủy sản Việt Nam tiếp tục đẩy mạnh
xuất khẩu trong năm tới, nhất là với các thủy sản nuôi trồng như tôm, cá tra [32].
1.1.2 Thành phần và tính chất của phế liệu tôm
Trong đầu tôm, thành phần chủ yếu là protein, chitin, khoáng, sắc tố,… Tùy
vào giống loài, đặc điểm sinh lý, sinh thái, mùa vụ mà tỷ lệ các thành phần này thay
đổi theo.
Protein: tỷ lệ protein trong đầu tôm cao hơn trong vỏ tôm rất nhiều và thường
là protein không hòa tan tồn tại ở hai dạng.
- Dạng tự do: tồn tại trong các cơ quan nội tạng và các cơ gắn ở phần vỏ.
Dạng này chủ yếu từ phần thịt tôm bị biến đổi, hư hỏng bị bỏ vào trong phế liệu
hoặc phần thịt còn sót lại trong đầu và nội tạng. Nếu công nhân vặt đầu không đúng
kỹ thuật thì phần protein bị tổn thất vào phế liệu nhiều, mặt khác việc xử lý phế liệu
cũng khó hơn.
- Dạng phức tạp: dạng này liên kết với Chitin, CaCO
3
như một phần thống
nhất của vỏ đầu tôm.
Chitin tồn tại dưới dạng liên kết với protein, khoáng và các chất hữu cơ khác
chủ yếu là CaCO
3
. Chính liên kết này gây khó khăn trong việc tách chiết và tinh chế
Chitin.
Tro: trong thành phần vỏ, đầu tôm có chứa một lượng lớn muối vô cơ, chủ
yếu là CaCO
3
.
Sắc tố: trong vỏ đầu tôm, sắc tố chủ yếu là astaxanthin. Astaxanthin là một
Trong giới thực vật, chitin có ở thành tế bào nấm thuộc họ Zygemycethers,
một vài loại tảo Chlorophiceae.
Trong các loài thủy sản, đặc biệt trong vỏ tôm, cua, ghẹ, mai mực hàm lượng
chitin – chitosan chiếm khá cao từ 14 – 35% so với trọng lượng khô. Hàm lượng
chitin biến đổi theo từng loại nguyên liệu, trong đó phế liệu nang mực ống có hàm
6
lượng chitin cao nhất 75 – 80%, tiếp theo là tôm sú Penaeus monodon 34,9% và
tôm thẻ Penaeus vannamei 18,3% [15].
1.2.2 Cấu trúc hóa học của chitin
Chitin là một polymer mạch dài của N-acetylglucosamine, dẫn xuất của
glucose, trong đó nhóm (-OH) ở nguyên tử C(2) được thay thế bằng nhóm axetyl
amino (-NHCOCH
3
). Như vậy, chitin là poly N-acetyl-β-D glucosamine liên kết với
nhau nhờ cầu nối β-1,4 glucoside. Hình 1.1 Cấu tạo hóa học của Chitin
Công thức phân tử: (C
32
H
54
N
4
O
21
)
n
, tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu mà chỉ
),… người ta lợi dụng tính chất này để khử màu cho chitin.
Chitin có khả năng hấp thụ tia hồng ngoại có bước sóng λ = 884 – 890 nm
Khi đun nóng trong acid HCl đậm đặc, ở nhiệt độ cao thì chitin sẽ bị cắt
mạch thu được 88,5% D-glucosamine và 21,5% acid acetic. Quá trình thủy phân bắt
đầu xảy ra ở mối nối Glucoside, sau đó là sự loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH
3
).
(C
32
H
54
N
4
O
21
)
n
+ 2(H
2
O) = (C
28
H
50
N
4
O
19
)
n
+ 2(CH
Trong y tế: Dùng làm phụ gia trong kỹ nghệ bào chế dược phẩm: Tá dược
độn, tá dược dính, tá dược dẫn thuốc, màng bao phim, viên nang mềm, nang cứng…
Dùng làm chất màng sinh học để gắn thuốc, tạo ra thuốc polyme. Dùng làm vật liệu:
Da nhân tạo, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép…
1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHITIN
1.3.1 Sản xuất chitin theo phương pháp hóa học [10]
* Quy trình sản xuất của Pháp (1996)
Vỏ tôm
Hấp chín, phơi khô
Xay thô
Ngâm NaOH 3,5% (tỷ lệ 1W:10V, 2h, 65
0
C)
Rửa trung tính
Ngâm HCl 1N, tỷ lệ 1W/10V, 2h, t
0
phòng
Ngâm acetone tỷ lệ 1W:5V, 30 phút, t
0
phòng
Ngâm NaClO 0,315%, tỷ lệ 1W:10V, 6 phút, t
0
phòng
Rửa trung tính
Chitin
Hình 1.2 Sơ đồ quy trình của Pháp, 1996
9
Nhận xét:
Ưu điểm: Quy trình này rút ngắn được thời gian sản xuất rất nhiều. Sản phẩm
Cao hơn 1%
10
Nhận xét: Quy trình ít công đoạn, sản phẩm có chất lượng khá tốt. Song sử dụng
hóa chất nhiều với nồng độ cao trong thời gian quá dài, do đó dễ làm ảnh hưởng tới
độ nhớt sản phẩm.
* Quy trình sản xuất chitosan một công đoạn xử lý kiềm, Trần Thị Luyến (2003)
Hình 1.4 Quy trình xử lý kiềm một giai đoạn của Trần Thị Luyến (2003)
Nhận xét: Phương pháp xử lý kiềm một giai đoạn cho sản phẩm chitosan có
chất lượng không kém so với quy trình thông thường với hai giai đoạn xử lý kiềm.
Tổng thời gian xử lý giảm rất nhiều, như vậy nếu so về mặt kinh tế thì đây là
phương pháp tốt hơn hẳn. Tuy nhiên phương pháp này vẫn còn nhược điểm là dung
dịch NaOH đặc sau khi deacetyl có màu sẫm gây khó khăn cho việc tái sử dụng.
V
ỏ
tôm khô
V
ỏ
tôm tươi
Ngâm HCl Ngâm HCl
Rửa trung tính
Khử protein, lipid
HCl 10%
t
o
phòng
t =5h
1.3.2 Sản xuất chitin theo phương pháp sinh học
Nguyên lý của phương pháp này dựa trên việc sử dụng hệ enzyme có sẵn
trong đầu tôm hoặc bổ sung enzyme nguồn gốc từ thực vật (papain, bromelain…),
động vật (nội tạng cá thu, ngừ, mực ống…), vi sinh vật (protease từ nấm mốc và vi
Khử khoáng
Ph
ế
li
ệ
u tôm
Khử protein
Chitin
Chitosan
HCl 7%, 24h, 30
0
C, tỷ lệ 1/5 (w/v)
NaOH 6%, 24h, 30
0
C, tỷ lệ1/5(w/v)
NaOH 40%, 6,5h, 80
0
C,
tỷ lệ 1/10(w/v)
Deacetyl
Rửa sơ bộ
12
khuẩn) để thủy phân protein đầu tôm thành các phần peptid, aminoacid và thu hồi
chúng. Quá trình deacetyl được thực hiện bởi enzyme deacetylase. Sản phẩm
Dịch thủy phân thu được chứa 63% protein so với vật chất khô (Nx6,25). Hàm
lượng protein còn lại sau thủy phân khoảng 4% có thể do trong quá trình thủy phân
có sự kết hợp khử protein bằng NaOH 4M.
Mizani và cộng sự (2005) đã nghiên cứu thủy phân phế liệu đầu tôm P.
semisulcatus bằng enzyme thương mại Alcalase. Để cải thiện hiệu quả trích ly một
vài chất hóa học như sodium sulphite và Triton x-100 được sử dụng kết hợp với
enzyme. Khi Alcalase sử dụng độc lập (12AU/kg), hiệu suất trích ly protein 45,1%
nhưng khi kết hợp xử lý với Triton x-100 (0,01g/kg) thì hiệu suất thu hồi protein
giảm xuống 39%, trong khi bổ sung sodium sulphite (200mM/l) cùng với enzyme
hay hỗn hợp enzyme và Triton x-100 tăng mức trích ly protein từ 62% và 65,1%
tương ứng. Protein kết tủa tại pH 3,1 thì hàm lượng sulphite trong bột protein giảm
97% và bột protein thu được có chứa đầy đủ amino acid thiết yếu thích hợp làm
thức ăn chăn nuôi.
Holanda và Netto, (2006), nghiên cứu thu hồi 3 thành phần chính của phế
liệu tôm, protein, chitin, astaxanthin bằng việc sử dụng enzyme Alcalase và
Protease
H
2
O
13
Pacreatin. Theo tác giả trong phế liệu tôm Xiphopenaeus kroyeri có chứa 39,42%
protein; 31,98% tro; và 19,92% chitin. Tiến hành thủy phân khử protein bằng
enzyme Alcalase tại các điều kiện: tỷ lệ enzyme/nguyên liệu 3%, nhiệt độ 60
0
C, pH
8,5. Kết quả cho thấy rằng Alcalase có hiệu quả thu hồi protein, astaxanthin, chitin
cao hơn so với trypsin, chimotripsin và carboxypeptidase tăng hiệu quả thu hồi
protein từ 57,5% lên 64,6% và astaxanthin từ 4,7 lên 5,7mg/100g phế liệu khô.
Rao và Stevens (2005) đã sản xuất chitin bằng cách ủ xi lô đầu và vỏ tôm với
Nhận xét: Quy trình cho sản phẩm có độ nhớt cao hơn các sản phẩm khác.
Đặc biệt độ deacetyl, độ tan và hiệu suất quy trình có ưu thế hơn hẳn (41,25%). Để
nâng cao chất lượng chitin có thể sử dụng enzyme papain thay thế cho NaOH để
khử protein trong vỏ tôm. Đặc biệt dịch thủy phân thu được sử dụng cho các mục
đích thu hồi protein và tận dụng, chắc chắn sẽ mang lại hiệu quả cao. Tuy nhiên,
cần nghiên cứu quy trình xử lý tận dụng dịch thủy phân này.
1.3.3 Sản xuất chitin kết hợp phương pháp sinh học với phương pháp hóa
học
- Ưu điểm:
Chất lượng sản phẩm thu được tốt do quá trình xử lý chỉ dùng acid và kiềm
nhẹ trong thời gian ngắn.
V
ỏ
tôm khô
V
ỏ
tôm tươi
Ngâm HCl Ngâm HCl
Rửa trung tính
Khử protein
HCl 10%
t
o
phòng
t =5h
w/v = 1/10
HCl 10%
t
nghiên cứu của TS. Trang Sĩ Trung, trường Đại học Nha Trang.
16 Hình 1.7 Quy trình sản xuất Chitin của TS. Trang Sĩ Trung,
Trường Đại học Nha Trang
Nhận xét: Từ quy trình sản xuất cho thấy, thời gian để cho ra sản phẩm ngắn
(khoảng 30 giờ), nồng độ hóa chất sử dụng thấp (NaOH 2%, HCl 4%), nhiệt độ thấp
(50
o
C trong quá trình thủy phân bằng enzyme và ở nhiệt độ thường với việc sử dụng
hóa chất). Bên cạnh đó lại có thể tận thu protein và astaxanthin góp phần làm tăng
hiệu quả kinh tế và giảm tác nhân gây ô nhiễm môi trường cùng với giảm một lượng
đáng kể nồng độ của những hóa chất độc hại gây tác động xấu cho Chitin và môi
Phế liệu vỏ đầu tôm thẻ
Xay nhỏ
Thu dịch protein astaxanthin
Khử protein bằng enzyme
Flavourzyme
Khử protein còn lại bằng NaOH
loãng
Rửa trung tính
Khử khoáng bằng HCl
Rửa trung tính
Chitin
- pH = 6,5
- Thời gian 6 giờ
Mô hình này chỉ ở mức tương đối, nhưng nó được áp dụng rộng rãi bởi vì
như một mô hình dễ dàng để ước lượng và áp dụng trong thực tế. Thiết kế thí
nghiệm ít.
1.4.2 Nguyên lý
Phương pháp bề mặt đáp ứng là một tập hợp các kỹ thuật thống kê và toán
học hữu ích cho phát triển, cải thiện và tối ưu hóa quá trình.
RSM sử dụng một chuỗi các thí nghiệm được thiết kế để có được một phản
ứng tối ưu. Box và Wilson đề nghị sử dụng một mô hình đa thức bậc hai để làm
điều này.
Để thiết kế chương trình cần có yếu tố đầu vào (x) và hàm mục tiêu (y)
18
ji
ji
jjj
k
j
jj
k
j
xxbxbxbby
2
11
0
Trong đó x
i
1.4.3 Ứng dụng
Phương pháp mặt đáp ứng đã được sử dụng trong nhiều năm trong ngành vật
lý học. Cho đến nay phương pháp được ứng dụng nhiều trong công nghệ sinh học
và các khoa học khác. Phương pháp mặt đáp ứng là một công cụ hữu ích để nghiên
cứu các quá trình phức tạp. Nó đã được áp dụng thành công để tối ưu hóa điều kiện
xử lý như nghiên cứu sự ảnh hưởng của nhiệt độ, pH, nồng độ enzyme/cơ chất
đến mức độ thủy phân, thu nhận protein. RSM xác định ảnh hưởng của các biến
khác nhau, đơn lẻ hoặc đồng tác động.
Tác giả Wanna Choorit (2008) và cộng sự sử dụng phương pháp mặt đáp ứng
để xác định hiệu suất khử khoáng trong quy trình lên men vỏ tôm. Theo N. Bhaskar
(2006) tối ưu hóa điều kiện lên men phế liệu tôm bằng Pediococus acidolactici
CFR2182 sử dụng phương pháp mặt đáp ứng và ảnh hưởng các điều kiện sau khi tối
ưu lên quá trình khử protein và khử khoáng và việc thu nhận carotenoid recovery.
1.5 TỔNG QUAN VỀ ENZYME
1.5.1 Khái quát về enzyme
Enzyme là những chất xúc tác sinh học mang bản chất là protein mà chỉ cần
lượng nhỏ cũng xúc tác để chuyển hóa một lượng cơ chất lớn thành sản phầm.
Enzyme đa phần đều là những protein có hoạt tính sinh học, do vậy nó có đủ
tính chất của một protein thông thường. Enzyme có khối lượng phân tử lớn hơn
12000 Dalton. Giống như các protein khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, trong
dung dịch muối loãng nhưng không tan trong dung môi phân cực… Enzyme dễ
Copyright: Tài liệu đại học ©