BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
==========
LÊ THỊ NGỌC DUNG ĐỊNH DANH LOÀI GNATHOSTOMA SP BẰNG
PHƢƠNG PHÁP PCR VÀ NGHIÊN CỨU CÁC GIAI
ĐOẠN PHÁT TRIỂN CỦA ẤU TRÙNG
GNATHOSTOMA SP TRONG KÝ CHỦ TRUNG GIAN ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
NhaTrang, tháng 6 năm 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG
VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƢỜNG
==========
Trùng), Th.S Nguyễn Văn Thoại, Cô Sâm và các anh ở bộ môn nghiên cứu Ký
Sinh Trùng;cùng các cô, chú, anh, chị tại đơn vị thực tập đã tận tình hướng
dẫn, chỉ dạy, truyền đạt kinh nghiệm và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại
Phân viện thú y miền Trung.
Cuối cùng, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến gia đình, bạn bè,
những người luôn quan tâm giúp đỡ, động viên, đồng thời là chỗ dựa tinh thần
rất lớn giúp tôi hoàn thành tốt mọi công việc được giao trong suốt thời gian
học tập và thực hiện đồ án vừa qua.
Nha Trang, tháng 6 năm 2012
Sinh viên
Lê Thị Ngọc Dung
i
MỤC LỤC
Trang
MỤC LỤC i
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT iv
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU v
DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH VÀ BIỂU ĐỒ vi
LỜI MỞ ĐẦU 1
Đặt vấn đề 1
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2
CHƢƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4
1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp 4
1.1.1. Hình thái cấu tạo 4
1.4.3.8.Yếu tố nhiệt độ của chu trình nhiệt 26
1.4.4. Phát hiện sản phẩm PCR 26
1.4.5. Độ tin cậy của phƣơng pháp PCR 28
CHƢƠNG 2: ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 28
2.1. Địa điểm nghiên cứu 28
2.2. Nội dung nghiên cứu 29
2.3. Nguyên vật liệu nghiên cứu 29
2.3.1. Vật liệu nghiên cứu 29
2.3.2. Trang thiết bị 29
iii
2.3.3. Các loại hóa chất 29
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 30
2.4.1. Phƣơng pháp thu thập mẫu và xác định hình thái học 30
2.4.2. Phƣơng pháp giám định loài bằng PCR 30
2.4.3. Phƣơng pháp xét nghiệm cá lóc, lƣơn và ếch 32
2.4.4. Phƣơng pháp gây nhiễm G. spinigerum 33
2.4.5. Phƣơng pháp xử lý số liệu 33
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34
3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch 34
3.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma dựa vào hình thái học 35
3.2.1. Định danh loài Gnathostoma phân lập từ cá lóc, lƣơn và ếch 35
3.2.2. Kết quả xác định loài Gnathostoma phân lập đƣợc ở chó 36
3.3. Kết quả xác định loài bằng kỹ thuật PCR 39
3.4. Kết quả nghiên cứu các giai đoạn phát triển của G. spinigerum 40
3.4.1. Các giai đoạn phát triển trứng G. spinigerum đến ấu trùng kỳ 2 40
3.4.2. Các giai đoạn phát triển của ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclops
leuckarti 42
v
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Trang
Bảng 3.1. Tỷ lệ nhiễm ấu trùng L3 Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn và ếch tại
tỉnh Khánh Hòa 34
Bảng 3.2. Kích thƣớc ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc 35
Bảng 3.3. Số móc trên hành đầu của ấu trùng L3 Gnathostoma sp 35
Bảng 3.4. So sánh số móc trên hành đầu của 4 loài Gnathostoma 36
Bảng 3.5. Kích thƣớc giun Gnathostoma sp phân lập đƣợc ở chó 36
Hình 3.1. Hình thái ấu trùng L3 Gnathostoma sp phân lập đƣợc 35
Hình 3.2. Giun Gnathostoma sp phân lập ở chó 37
Hình 3.3. Trứng Gnathostoma sp 37
Hình 3.4. Kết quả PCR 39
Hình 3.5. Các giai đoạn phát triển trứng G.spinigerum 42
Biểu đồ 3.1. Liên quan giữa kích thƣớc ấu trùng và cƣờng độ nhiễm ở
Mesocyclopsleuckarti 44
Hình 3.6. Hình thái ấu trùng G. spinigerum ở Mesocyclopsleuckarti 44
Biểu đồ 3.2. Dao động kích thƣớc ấu trùng L3 theo thời gian 45
Hình 3.7: Hình ảnh gây nhiễm cá lóc, lƣơn, ếch 46
1
LỜI MỞ ĐẦU
Đặt vấn đề
Gnathostomiasis là bệnh ký sinh trùng lây truyền từ động vật sang ngƣời
do loài giun tròn Gnathostoma sp gây ra. Có 12 loài gây bệnh trên động vật đã
đƣợc ghi nhận, G. spinigerum, G. hispidum, G. turgidum, G.doloresi, G.
nipponicum, G. americanum, G. procyonis, G. miyazakii, G. malaysiae, G.
vietnamicum, G. didelphis và G.brasiliense (Daengsvang, 1980; Miyazaki,
1991). Trong đó có 4 loài gây bệnh trên ngƣời là G.spinigerum, G.hispidum,
G.doloresi và G.nipponicum. Tỷ lệ nhiễm G. spinigerum cao đƣợc thông báo ở
các nƣớc Châu Á nhƣ: Thái Lan, Nhật Bản, Malaysia, Ấn Độ, Trung Quốc,
Philippines, Indoneaia và Việt Nam. Ngƣời đầu tiên nhiễm Gnathostoma sp ở
Việt Nam đƣợc phát hiện năm 1963, trong những năm gần đây có nhiều trƣờng
hợp nhiễm mới đƣợc phát hiện (Lê Thị Xuân, 2003; Trần Phú Mạnh Siêu,
2010).
Vòng đời của Gnathostoma sp đã đƣợc thông báo trƣớc đây
(Daengsvang, 1972). Giun trƣởng thành sống trong khối U của dạ dày của vật
chủ cuối cùng (lợn, chó, mèo), trứng theo phân ra ngoài môi trƣờng với điều
Trong hai thập kỷ qua, công nghệ ứng dụng kỹ thuật mới đã có những
định hƣớng phát triển vƣợt bậc. Một trong những thành tựu lớn của nhân loại là
sự phát triển phƣơng pháp PCR (Polymerasa Chain Reaction) đƣợc ứng dụng
cho giám định, chẩn đoán, phân loại, di truyền quần thể, phả hệ và tiến hoá sinh
vật, trong đó có ký sinh trùng (Littlewood, 2008) và trở thành một công cụ
không thể thiếu đƣợc trong công tác giám định, phát hiện sinh vật (kể cả ký
sinh trùng) gây bệnh bằng kỹ thuật cao (Ishmael và Stellato, 2008). Do có tính
nhạy và đặc hiệu rất cao, đồng thời chỉ cần một lƣợng rất ít khuôn DNA của
đối tƣợng sinh vật bất kể giai đoạn sinh trƣởng nào, PCR đã có thể cho sản
phẩm với độ chính xác cao về loại sinh vật cần nghiên cứu.
Từ thực tế trên, dƣới sự giúp đỡ của Bộ môn nghiên cứu Ký sinh trùng
Phân viện Thú y Miền Trung, chúng tôi đã tiến hành đề tài: “ Định danh loài
Gnathostoma sp bằng phương pháp PCR và nghiên cứu các giai đoạn phát
triển của ấu trùng Gnathostoma sp trong ký chủ trung gian”
Mục tiêu nghiên cứu của đề tài
Xác định đƣợc tỷ lệ nhiễm ấu trùng Gnathostoma sp ở cá lóc, lƣơn, ếch
tại Khánh Hòa.
Xác định thành phần loài Gnathostomasp phân lập đƣợc.
3
Nghiên cứu các giai đoạn phát triển ấu trùng Gnathostoma sp ở
Cyclopidae và ở cá lóc, lƣơn, ếch.
Do thời gian và kinh phí có hạn nên báo cáo này chắc hẳn sẽ còn
các hạn chế, em kính mong nhận đƣợc các ý kiến góp ý của quý thầy cô và
bạn bè đồng nghiệp để cho các nghiên cứu thêm hoàn thiện. Em xin chân
thành cảm ơn!
4
CHƢƠNG 1: PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm chung Gnathostoma sp
Gnathostoma thuộc bộ Spiruida, lớp Secernatea, ngành giun tròn
Nematoda, họ Gnathostomatidae, loài Gnathostoma Owen, 1936. Cho tới nay
Gnathostoma có 12 loài gây bệnh ở động vật, trong đó có 4 loài có thể gây
bệnh ở ngƣời đã đƣợc ghi nhận (Daengsvang, 1980).
1.1.1. Hình thái cấu tạo
Giun trƣởng thành dài 11 – 54 mm và rộng 0,9 – 3,1 mm, đỉnh đầu của
giun có 8 hàng móc, thực quản dài 2,4mm, túi cổ nằm bên cạnh ở phần nửa trên
của thực quản, ruột màu đen; tinh hoàn hình ống uốn khúc (James Tseng,
2003). Ấu trùng L3 của giun Gnathostoma spinigerum dài từ 2,5 mm đến 5,1
mm, rộng từ 0,29 mm – 0,51 mm; cấu tạo đặc trƣng của ấu trùng là đỉnh đầu có
4 hàng móc, số móc hàng 1 đến 4 lần lƣợt là 45, 48, 50 và 52 (Bong – Kwang
Jung và cộng sự, 2008). Trứng Gnathostoma có kích thƣớc 38 – 40 µm x 65 –
70 µm và có nắp ở một đầu trứng (James Tseng, 2003). Hình 1.1. Hình thái cấu tạo Gnathostoma sp
: www.med.cmu.ac.th )
Ghi chú: (1): trứng giun Gnathostoma; (2): giun đực trƣởng thành;
(3): giun cái trƣởng thành; (4): ấu trùng giun Gnathostoma; (5): phần đầu ấu
Hình 1.2. Vòng đời phát triển của Gnathostoma sp
(Nguồn dpd.cdc.gov/dpdx/html/Gnathostomiasis.htm)
6
Hình 1.3. Giun Gnathostoma sp tạo thành khối U trong dạ dày chó
1.1.3. Sức đề kháng
Ấu trùng G. spinigerum có sức đề kháng cao đối với các tác nhân vật lý
và hóa học, ấu trùng có thể tồn tại 8 ngày trong dung dịch giấm (4% acide
acetic), 5 ngày trong nƣớc chanh, 8 – 9 ngày trong cồn 28% – 35%. Ấu trùng
nằm sâu 2cm trong cơ cá, phải đun sôi 2 phút mới làm vô hoạt đƣợc (Setasuban
P, 1981).
1.1.4. Triệu chứng lâm sàng
Vật chủ cuối cùng mắc bệnh thƣờng biểu hiện: nôn mửa, kém ăn, rối
loạn tiêu hóa, gầy yếu, suy nhƣợc cơ thể kéo dài; giảm tăng trọng 20% so với
những con bình thƣờng. Một số trƣờng hợp bệnh nặng có thể chảy máu dạ dày.
là 54,9% (Phạm Văn Khuê, Phan Lục, 1996).
Lê Thị Xuân, Rojekittikhun W (2000) cho biết lƣơn ở thành phố Hồ Chí
Minh nhiễm là 0,11%, cƣờng độ nhiễm 2,9 ấu trùng/lƣơn, tỷ lệ nhiễm cao nhất
ở tháng 10 và thấp nhất ở tháng 3 và tháng 4.
Nguyễn Văn Đề (2004) đã điều tra thực trạng nhiễm ấu trùng sán lá gan
nhỏ và ấu trùng Gnathostoma trên 10 loài cá nƣớc ngọt tại 5 chợ ở Hà Nội (cá
mè, cá rô phi, cá trắm, cá trôi, cá chày, cá chép, cá diếc, cá chuối, cá trê và
lƣơn). Kết quả phát hiện 7 loài nhiễm ấu trùng sán lá gan nhỏ và chỉ có lƣơn
nhiễm ấu trùng Gnathostoma spinigerum.
Năm 2007, Lê Hữu Khƣơng và Võ Hồng Cẩm Phƣơng đã tiến hành mổ
khảm trên 2448 chó tại 18 tỉnh thành phía Nam đã thu trên 370 mẫu giun ký
8
sinh ở dạ dày chó. Kết quả định danh cho thấy chỉ có một loài G. spinigerum,
10 trong số 18 tỉnh có sự hiện diện của loài giun này, đã phát hiện 101 chó
nhiễm G.spinigerum, tỷ lệ nhiễm trung bình là 4,12%.
Theo Lê Thị Xuân và cộng sự (2004) thì động vật nhiễm Gnathostoma
đã đƣợc báo cáo ở Việt Nam từ năm 1914. Ngƣời nhiễm Gnathostoma đầu tiên
đƣợc ghi nhận vào năm 1965, nhƣng cho đến năm 1999 cũng chỉ ghi nhận thêm
4 trƣờng hợp. Tuy nhiên, từ năm 1999 đến năm 2004 khoa Ký sinh trùng, Đại
học Dƣợc và Y khoa, thành phố Hồ Chí Minh dùng kỹ thuật miễn dịch học đã
phát hiện trên 600 ngƣời có huyết thanh dƣơng tính với Gnathostoma.
Trần Phú Mạnh Siêu và cộng sự (2009) cho biết, lƣơn ở Củ Chi và Long
An nhiễm G.spinigerum từ 0,8% – 19,6%, tỷ lệ nhiễm cao nhất là vào các
tháng 9, 10 và thấp nhất vào tháng 2, 3.
1.2.2. Một số nghiên cứu về dịch tễ học bệnh Gnathostoma trên Thế giới
Giun trƣởng thành G. spinigerum ký sinh ở chó, mèo; ấu trùng có khả
năng gây bệnh Gnathostoma ở ngƣời và ở nhiều loại động vật khác; tỷ lệ nhiễm
đƣợc thông báo chủ yếu ở Châu Á và Nam Mỹ (Daengsvang, 1981).
Thái Lan, sau đó ở các nƣớc Ấn Độ, Nhật Bản, Australia, … Hầu hết ngƣời
nhiễm bệnh đều đƣợc xác định là loài G. spinigerum, một số ít là loài G.
hispidum (Beaver và cs 1984).
Theo Niti – Uthai S, (1974) cho biết, nếu cá ăn phải cyclops có chứa
mầm bệnh Gnathostoma sp, sau 1 – 2 ngày tìm thấy ấu trùng kỳ 3 trong dạ dày
và ruột, sau đó tìm thấy ở cơ, gan và ấu trùng tạo kén trong thời gian 6 – 61
ngày sau khi nhiễm. Cá nƣớc ngọt, nƣớc lợ Mugil sp, Chanos đều tìm thấy ấu
trùng G. spinigerum trong tự nhiên và gây nhiễm nhân tạo, tỷ lệ nhiễm lần lƣợt
56.0% và 80.0% ở gây nhiễm nhân tạo và 53.3%, 30.0% nhiễm tự nhiên.
Sau khi vật chủ cuối cùng (chó, mèo, lợn) nhiễm bệnh, ấu trùng di hành
đến dạ dày, ruột, gan, sau đó đến cơ. Ấu trùng phát triển thành Gnathostoma
spp trƣởng thành ở thành dạ dày, tại đây giun tác động đến vật chủ và tạo nên
các khối u ở thành dạ dày (thƣờng là 1 khối u, ít khi là 2 hoặc hơn). Thời gian
phát triển thành giun trƣởng thành tùy từng vật chủ và đƣờng gây nhiễm : nếu
mèo nhiễm ấu trùng L3 G. spinigerum bằng đƣờng da, thời gian phát triển
khoảng 2 – 7 tháng (59 – 227 ngày), cƣờng độ nhiễm 52 Gnathostoma sp/mèo
và tỷ lệ nhiễm 29% – 94%, nếu mèo nhiễm qua đƣờng tiêu hóa, thời gian phát
triển khoảng 2,7 – 12 tháng (84 – 247 ngày), trứng Gnathostoma sp tìm thấy ở
tháng 1,2 – 7,4 (37 – 223 ngày). Ở chó nếu nhiễm qua đƣờng tiêu hóa thời gian
phát triển khoảng 3 – 8 tháng (84 – 247 ngày), tỷ lệ nhiễm 63% (Daengsvang,
1980), khi gây nhiễm qua da thời gian phát triển khoảng 160 – 273 ngày (5,3 –
9,1 tháng), trứng tìm thấy ở ngày 103 – 232 (3,4 – 7,7 tháng) (Rojekittikhun W
10
et al., 1996).
Maleewong (1992) điều tra ở Thái Lan cho thấy tỷ lệ nhiễm
Gnathostoma spinigerum ở chó là 4,1%, tỷ lệ nhiễm cao ở mùa mƣa và đầu
mùa đông (tháng 8 đến tháng 10) và thấp ở mùa hè (tháng 3, tháng 4).
Woon Mok Sohn (1993) đã phân lập đƣợc 6 ấu trùng L3 G. nipponicum
Florencia Bertoni – Ruiz (2005) cho biết: Gnathostoma lamothei đƣợc
tìm thấy ở dạ dày động vật ăn thịt. Sự khác nhau về cấu tạo ở phần đầu và bề
mặt cơ thể giữa các loài Gnathostoma, giải trình tự gen ITS2 loài G. lamothei
cho thấy sai khác (<50%) so với các loài khác đã đƣợc phát hiện tại Mexico
(Gnathostoma binucleatum, Gnathostoma turgidum) và tƣơng đồng cao với
Gnathostoma sp (99,2%).
Jimenez et al., (2009), điều tra 74 mẫu cá ở chợ và ngoài đồng tại
Guayas Province, Ecuador, tỷ lệ nhiễm Gnathostoma sp là 69%, cƣờng độ
nhiễm trung bình của 2 vùng là 1,7 ấu trùng/cá.
1.3. Đặc điểm sinh học của các ký chủ nghiên cứu
1.3.1. Đặc điểm sinh học của Mesocyclops leuckarti (Claus, 1857)
Loài Mesocyclops leuckarti, Rylov, 1948, thuộc họ Cyclopidae, giống
Mesocyclops.
Chuẩn đoán: đốt cuối cùng ngọn râu 1 có tấm trong suốt hình lƣợc, 2
nhánh chạc đuôi dài, túi nhận tinh ở con cái hình chữ T, 2 đầu ngọn thẳng
ngang.
Hình 1.4. Hình thái Mesocyclops leuckarti
Con cái: Phần đầu ngực dài hơn phần bụng, hình bầu dục, 2 nhánh chạc
đuôi gần song song, chiều dài gần gấp 3 – 3,5 lần chiều rộng, cạnh ngoài nhẵn.
12
Tơ trong ngọn chạc đuôi không vƣợt quá nửa rơ giữa trong. Tơ bên đính ở gần
giữa cạnh ngoài (2/5 tơ ngọn). Túi nhận tinh hình chữ T, thân hình túi lớn,
nhánh ngang có viết lõm rộng ở chính giữa, 2 đầu bên nhọn, thẳng ngang. Râu
và đào hang sâu để sống qua đông. Cƣờng độ ăn mạnh vào tháng 5 – 7, lƣơn
béo vào mùa thu và mùa xuân trƣớc khi lƣơn đẻ.
1.3.3. Đặc điểm sinh học của cá lóc
Cá lóc thƣờng gặp và phân bố rộng có 2 loài là : Ophiocephalus
maculatus và Ophiocephalus arbus, nhƣng đối tƣợng nuôi quan trọng nhất là
loài O.maculatus.
Môi trƣờng sống: Cá lóc thích sống ở những nơi đồng sâu, những nơi có
mực nƣớc sâu cả mét. Ngoài ra cá lóc còn thích nơi yên tĩnh có nhiều rong cỏ
để làm nơi trú ẩn và rình mồi, đồng thời đến mùa sinh sản cũng dùng nơi này
để đẻ.
Cá quả thuộc loại cá dữ. Thức ăn là chân chèo và râu ngành; thân dài 3 –
8 cm ăn côn trùng, cá con và tôm con; thân dài trên 8 cm ăn cá con. Khi trọng
lƣợng nặng 0,5 kg có thể ăn 100 g cá. Trong điều kiện nuôi nó cũng ăn thức ăn
chế biến. Mùa đông không bắt mồi.
Tính thích nghi với môi trƣờng xung quanh rất mạnh, nhờ có cơ quan hô
hấp phụ nên nó có thể hít thở đƣợc O
2
trong không khí. ở vùng nƣớc hàm
lƣợng O
2
thấp cũng vẫn sống đƣợc, có khi không cần nƣớc chỉ cần da và mang
cá có độ ẩm nhất định vẫn có thể sống đƣợc thời gian khá lâu.
Nhiệt độ sống thích hợp từ 20
0
C – 30
0
C, có khả năng chịu nóng hơn là
chịu lạnh.
1.3.4. Đặc điểm sinh học của ếch
dùng trong phản ứng xác định. Tuy nhiên nếu DNA làm khuôn đƣợc tinh khiết
thì phản ứng PCR sẽ rất nhạy và đặc hiệu. Hàm lƣợng DNA khuôn cần cho
phản ứng PCR rất nhỏ.
1.4.1. Nguyên lý của phản ứng PCR
Nguyên lý nhân gen trong tế bào:
DNA là vật chất di truyền của cơ thể sống quy định đặc tính của cơ thể
(ngoại trừ một số loại virus có vật chất di truyền là RNA). Đối với những sinh
vật có cấu trúc tế bào nhân chuẩn, các phân tử DNA tồn tại dƣới dạng kết hợp
với protein thành các nhiễm sắc thể trong nhân tế bào. Ngoài ra, tại các cơ quan
khác nhƣ ty thể và lạp thể (ở thực vật) cũng chứa DNA ở dạng plasmid.
15
Các phân tử DNA ở những tế bào hoạt động bình thƣờng chỉ đƣợc nhân
lên trong quá trình phân bào nguyên nhiễm. Để thực hiện đƣợc quá trình này,
đòi hỏi phải có mặt enzyme DNA polymerasa, sự tham gia của các đoạn mồi có
trình tự bổ sung gắn vào vào sợi DNA khuôn và các dNTP làm nguồn cung cấp
nucleotit. Trong quá trình phân bào nguyên nhiễm, các sợi DNA kép đƣợc mở
xoắn tách thành các sợi DNA sợi đơn. Dƣới tác dụng của enzyme DNA
polymerase, quá trình tổng hợp DNA đƣợc xảy ra theo cách gắn lần lƣợt các
nucleotit vào đoạn mồi để kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung với DNA
khuôn.
Nguyên lý của kỹ thuật PCR
Nguyên lý của PCR là dùng mồi nucleotide lai bổ sung vào một đầu của
đoạn DNA cần tìm rồi men DNA polymerase sẽ khuếch đại và nhân bội lên
theo một dây chuyền phản ứng, và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình
thành mạch mới từ đó dễ dàng cho việc quan sát và xét nghiệm.
Kỹ thuật tổng hợp DNA ngoài cơ thể cũng tuân thủ những nguyên tắc cơ
bản của sao chép DNA trong cơ thể nhƣng có sự khác biệt:
+ Dùng nhiệt độ cao tháo xoắn thay cho enzyme helicase.
hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian ở giai đoạn này khoảng: 1 – 2
phút.
Giai đoạn bắt cặp (annealing):
Gắn cặp mồi đặc trƣng theo nguyên tắc bổ sung. Sau khi 2 sợi DNA tách
ra, nhiệt độ đƣợc hạ xuống để mồi có thể gắn vào sợi DNA đơn. Nhiệt độ giai
đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thƣờng thấp hơn nhiệt độ biến tính
khoảng 45 – 60°C. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn
mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian
bắt cặp từ 1 – 2 phút.
Giai đoạn kéo dài (extension):
Tổng hợp chuỗi DNA mới giống chuỗi DNA gốc. DNA polymerasa gắn
tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào và hoạt động dọc theo sợi DNA. Nhiệt
độ kéo dài phụ thuộc DNA-polymerasa. Thời gian của bƣớc này phụ thuộc vào
cả DNA-polymerasa và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Nhƣ một quy tắc
1000bp/1 phút. Các đoạn DNA mới đƣợc hình thành lại đƣợc sử làm khuôn để
tổng hợp cho các chu kỳ tiếp theo. Nhƣ vậy số lƣợng bản sao sẽ tăng gấp 2 sau
mỗi chu kỳ và sau n chu kỳ, tính theo lý thuyết số lƣợng bản sao là 2n.
Copyright: Tài liệu đại học ©