Đặt vấn đề
Việt Nam là quốc gia nằm trong vùng có khí hậu nhiệt đới gió mùa nên
hệ thực vật rất đa dạng và phong phú. Trong đó, cây ăn quả chiếm tỷ lệ lớn và
đa dạng về chủng loại. Việc kéo dài thời gian bảo quản quả sau thu hoạch để
nâng cao giá trị kinh tế, đem lại lợi nhuận cao cho người nông dân, tạo thị
trường vững mạnh và lâu dài cho đất nước luôn được chú trọng trong thời
gian gần đây.
Để kéo dài thời gian bảo quản quả sau thu hoạch đã có nhiều công trình
nghiên cứu với những phương pháp khác nhau. Nhưng mục đích cuối cùng vẫn
là ngăn chặn sự tiếp xúc giữa ethylene với quả khi bảo quản, đồng thời kìm hãm
sự sinh tổng hợp ethylene trong quả sau thu hoạch.
Có nhiều phương pháp để kìm hãm quá trình sinh tổng hợp ethylene, trong
đó có phương pháp kìm hãm hoạt lực enzym 1-aminocyclopropane -1-
cacboxylate (ACC) oxydase để ngăn cản quá trình chuyển hóa ACC thành
ethylene.
Với mục đích như vậy, tôi thực hiện đề tài: “Tìm hiểu lý thuyết về các yếu
tố ảnh hưởng đến hoạt lực enzym ACC oxydase trong bảo quản rau quả”
mang tính tổng hợp lý thuyết các công trình nghiên cứu.
1. Giới thiệu chung về hợp chất etylene (C
2
H
4
) và Chu trình sinh tổng
hợp etylene.
1.1 Giới thiệu chung về hợp chất etylene (C
2
H
4
).
Ethylene là một khí hydrocacbon không no, có công thức hóa học là
C

trình chín của quả. Quá trình chín của nhiều loại quả, xảy ra hiện tượng hô
hấp đột biến, cường độ hô hấp tăng lên rất nhanh tạo nên một đỉnh hô hấp có
tính bột phát. Sau đó cường độ hô hấp giảm đi rất nhanh, sự sản sinh ra
Ethylene trong quả cũng tăng lên. Quá trình hô hấp bột phát được cảm ứng
bởi:
− Sự thuỷ phân các nguyên liệu dự trữ
− Sự mềm của thịt quả nhờ hoạt động của các Enzim phân giải
pectin.
− Sự biến đổi sắc tố
− Sự biến đổi các chất thơm
2
− Sự biến đổi các phản ứng sinh hoá khác.
3
Hình 2.2 Chu trình sinh tổng hợp Ethylen của Yang
1.3 Chu trình sinh tổng hợp etylen
Yang và cộng sự đã phát hiện ra chu trình sinh tổng hợp etylene thường
được gọi là chu trình Yang [8]. Quá trình sinh tổng hợp etylene bắt đầu từ
methionine (MET), dưới xúc tác của enzyme SAM synthetase thì methionine sẽ
được chuyển hóa thành S-adenosylmethionine (SAM) nhờ hoạt hóa của ATP.
Sau đó, SAM lại được chuyển hóa thành 1- aminocyclopropane -1- carboxylate
acid (ACC) dưới tác dụng của enzyme ACC synthase (ACS). Và 5’-
methylthioadenosine (MTA) cũng được tạo ra trong phản ứng này và trở lại
tổng hợp methionine theo chu trình Yang. Cho nên, ethylene luôn được tổng
hợp liên tục mà không cần bổ sung thành phần methionine từ bên ngoài. Đối
với các quả non thì quá trình tổng hợp lại methionine mạnh hơn so với sự
hình thành ACC và hiện tượng này xảy ra ngược lại khi quả chín dần. Với sự
có mặt của O
2
, ACC bị oxy hóa bởi ACC oxydase tạo thành ethylene, CO
2

enzyme khác như lypoxygenase và peroxidase cũng có tác dụng chuyển hóa
ACC thành etylen với sự hiện diện của các nhân tố phụ khác. Tuy nhiên, chỉ
enzym ACC oxydase là có tính đặc hiệu và đạt hiệu quả chuyển hóa cao [23].
Khi nghiên cứu sinh tổng hợp ethylene trên thực vật cho thấy ACC
oxydase là một cấu trúc bậc cao và định vị ở màng tế bào cho nên sự phá vỡ
của mô thực vật dẫn tới sự phá hủy màng và ức chế quá trình tổng hợp etylene
[23]. Và cũng cho biết thêm hoạt lực của ACC oxydase trên màng nguyên
sinh chất và màng không bào là như nhau [23]. Tuy nhiên, ACC oxydase trên
màng nguyên sinh chất sẽ chuyển đổi ACC thành etylene nhanh hơn và nhạy
hơn dẫn đến sự thẩm thấu cao hơn so với ACC oxydase trên màng không bào.
Trong một vài loại cây trồng thì hàm lượng của ACC oxydase trên cả hai
màng là như nhau trong khi đó ở các cây trồng khác có một loại cao hơn.
2. Các yếu tố ảnh hưởng đến ACC oxydase trong bảo quản rau quả.
ACC oxydase là enzyme có cấu trúc là protein nên cũng giống như các
enzyme khác, nó chịu tác động mạnh mẽ bởi các yếu tố như: nhiệt độ, pH môi
trường, nồng độ ion, nồng độ CO
2
, thế oxy hóa – khử của môi trường, nồng
độ cơ chất, sự có mặt các chất hoạt hóa hay chất ức chế trong môi trường.
Enzyme sẽ đạt hoạt độ cao nhất dưới những điều kiện tối ưu.
2.1 Ảnh hưởng của pH và CO
2
đến hoạt lực của ACC oxydase
Các enzyme đều được đặc trưng và phụ thuộc vào pH môi trường. Mỗi
enzyme đều có giá trị pH thích hợp nhất định đối với hoạt lực của chúng. Khi
pH tăng hoặc giảm ra ngoài giới hạn thích hợp thì hoạt lực của các enzyme sẽ
5
Hình 2.3 Phản ứng chuyển hóa ACC thành ethylen
bị giảm xuống. Cho nên, trong tất cả mọi nghiên cứu về enzyme, trị số pH cần
được duy trì bằng các dung dịch đệm thích hợp.

2
hoạt lực là 270 nl/g-h và pH 6,7 ở 20%
CO
2
hoạt lực là 350 nl/g-h. Mô hình tương tự đã được thu được khi 0,1 M
đệm Tris-HC1 (pH 7,0-9,0), một bộ đệm có độ kiềm mạnh hơn [7].
6
Hình 3.1 Ảnh hưởng của pH và CO
2
đến
hoạt độ của enzyme ACC oxydase
Nồng độ cơ chất tham gia hoạt hóa ACO khác nhau cũng ảnh hưởng đến hoạt
độ ACO. Đối với CO
2
, hoạt độ ACO càng tăng khi CO
2
ở nồng độ cao và
giảm khi nồng độ CO
2
hạ thấp và cũng tùy thuộc vào đối tượng nghiên cứu.
CO
2
cần cho các hoạt động enzyme ACO trong thân quả Táo. Loại bỏ CO
2
từ
hỗn hợp phản ứng hoàn toàn ức chế các hoạt động của enzyme này, trong khi
0,5% CO
2
trong khí quyển (0,15 mM trong môi trường) thì giảm hoạt động
của ACO xuống một nửa [19].

tốt hơn là HCO
3
−

sử dụng trong quá trình hoạt hóa
enzyme này. Enzyme với nồng độ bão hòa CO
2
cho kết quả hoạt hóa tăng khi
pH trước khi ủ được nâng lên, điều này cho thấy rằng CO
2
phản ứng với một
nhóm enzyme khi ở môi trường kiềm [20].
7
Hình 3.2 Hoạt độ ACO phụ thuộc vào nồng độ CO
2
2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt lực của ACC oxydase
Nhiệt độ là yếu tố thường xuyên ảnh hưởng đối với tốc độ phản ứng,
cường độ xúc tác các phản ứng. Trong sinh lý học, tốc độ phản ứng càng tăng
khi nhiệt độ môi trường phản ứng tăng. Nhưng nếu vượt ra khoảng giới hạn nào
đó, các phản ứng sẽ chậm lại và ngừng hẳn do sự biến tính của phân tử enzyme.
ACC oxidase cũng phụ thuộc vào nhiệt độ và có khoảng nhiệt đô tối thích nhất
định mà tại đó, tốc độ của phản ứng đạt cực đại. Nhiệt độ tối thích của enzyme
này tùy thuộc vào nguồn gốc, phụ thuộc loài rau quả được sử dụng….
Theo Frederick B. Abeles và cộng sự thì các enzyme ở ranh giới màng
như ACC oxydase thì có tính nhạy cảm với nhiệt độ cao. Khi mô cây đậu Ấn
Độ và mô táo được làm nóng tới 35
0
C thì ACC vẫn được được tích lũy. Điều
đó đưa đến kết luận rằng nhiệt độ cao chỉ làm bất hoạt ACC oxydase mà
không làm bất hoạt ACC synthase [23].

chnúg có khác nhau. Người ta thường dùng phương pháp này để xác định
hoạt lực của saccaraza. Cơ chất của enzym này là đường saccaroza có góc
quay riêng là + 66,5
0
(phía phải). Sản phẩm thuỷ phân của nó là glucoza (góc
quay riêng là +52,5
0
) và fructoza (góc quay riêng là -92,4
0
– phía trái). Khi
enzym tác dụng lên saccaroza theo mức độ thuỷ phân mà góc quay tổng cồng
giảm dần và chuyển từ phải sang trái. Đây là phản ứng nghịch đảo đường rất
kinh điển trong nghiên cứu động học phản ứng, đường tạo ra gọi là đường
nghịch đảo (từ phải sang trái mặt phẳng ánh sáng phân cực). Tác nhân xúc tác
thông thường (không phải enzym) là axit vô cơ (HCl, H
2
SO
4
).
3.1.3 Phương pháp áp kế
Được dùng khi phản ứng enzym tạo thành hay hấp thụ khí, chẳng hạn
các loại phản ứng oxy hóa có sự tham gia của phân tử oxy (oxy hóa hiếu khí),
decacboxy hóa, deamin hóa (loại CO
2
, NH
3
). Ngoài ra, có thể dùng phương
pháp này để xác định hoạt lực của enzym trong quá trình phản ứng không trực
tiếp làm biến đổi thể tích nhưng khó thông qua các phản ứng trung gian tiếp
theo (thể hiện gián tiếp hoạt lực của enzym và do đó thể hiện hoạt lực của nó)

thành axit hoặc bazơ. Lúc đó dùng thiết bị tự động thêm kiềm hoặc axit vào
để giữ pH môi trường phản ứng cố định, đồng thời tự động ghi đường biểu
diễn lượng kiềm hoặc axit đã tiêu tốn vào phản ứng trung hòa. Lưu lượng
kiềm hoặc axit này phản ánh tốc độ phản ứng enzym.
3.1.6 Phương pháp sắc kí
Đây là phương pháp hiện đại, hiện nay được sử dụng rất nhiều và trong
nhiều trường hợp được dùng để tinh chế enzym. Tất cả các phương pháp sắc
kí đều có thể áp dụng để xác định hoạt lực của enzym. Từ phương pháp lâu
đời nhất như sắc kí giấy, sắc kí trao đổi ion cho đến các phương pháp hiện đại
như sắc kí lỏng cao áp, sắc kí khí kết hợp với các phương phá phân tích hiện
đại (phân tích axit amin tự động, cộng hưởng từ hạt nhân, cực phổ). Lượng
10
enzym và cơ chất cũng như sản phẩm phản ánh rất ít cũng cho kết quả chính
xác, nhanh chóng.
3.1.7 Phương pháp hóa học
Dùng các phản ứng hóa học khác nhau để định lượng cơ chất bị hao
hụt hoặc sản phẩm phản ứng tạo thành dưới tác dụng của enzym. Các phản
ứng này thuộc loại tạo màu đặc trưng, tạo màu với thuốc thử đặc trưng, Nói
chung là một dấu hiệu để nói lên để nói lên mức độ hay thời điểm kết thúc
phản ứng.
Trong tất cả các phương pháp vừa nêu, tuỳ theo điều kiện, yêu cầu
nghiên cứu thực tế mà quyết định phương thức tiến hành (chẳng hạn tiến hành
trong điều kiên thời gian như nhau hay nồng độ enzym, nồng độ cơ chất
không đổi ) qui hoạch thực nghiệm để xác định các thông số tối ưu.
3.2 Các phương pháp xác định hoạt lực ACC oxydase.
Hoạt độ ACC oxidase được khảo sát hoạt động bằng cách đo khả năng
kiểm soát của mô để chuyển đổi ACC thành ethylene đã được nghiên cứu
thành công trước đây (Mathooko và cộng sự năm 1993). Sau đó, M.A. Moya-
León and P. John năm 1994 đã nghiên cứu phương pháp xác định hoạt độ
ACC oxidase trên thịt và vỏ quả chuối chín [11]. Nguyên tắc của phương

. Tropolone và
hinikitiol kìm hãm hoạt lực ACC oxidase nhưng được phục hồi bằng cách
thêm Fe
2+
trong môi trường thí nghiệm. Bởi vậy, một phần kìm hãm sự sản
xuất ethylene bởi tropolone lại có thể kìm kẹp sự hoạt động của ion Fe
2+
[6].
4.1.2 Xử lý ethylene ngoại sinh đối với quả.
Quả Preclimacteric sản xuất ethylene rất ít vì cả hai enzyme ACC
synthase và ACC oxidase đều hoạt động thấp. Tuy nhiên, khi trái cây
được xử lý bằng ethylene ngoại sinh, trong một thời gian ngắn, sự gia
tăng mô có khả năng oxy hóa ACC thành ethylene đã được nghiên cứu
bởi Liu và cộng sự năm 1985 [18].
4.1.3 Xử lý CA trong 4 tháng bảo quản lạnh đối với Táo
Trong ống nghiệm hoạt lực ACO tăng lên đáng kể trong tất cả các
phương pháp xử lý CA trong 4 tháng bảo quản lạnh đối với Táo Golden
Delicious. Môi trường không khí và phương pháp xử lý không khí + 5%
CO
2
cho thấy sự tăng cao hoạt độ ACO và không có sự khác biệt đáng kể
giữa hai phương pháp xử lý trên. Các phương pháp xử lý với môi trường
gồm O
2
2% và O
2
2% + 5% CO
2
thể hiện sự hiệu quả hơn so với môi
trường chứa không khí và không khí + CO

linalool. Ức chế cao hơn đã được tìm thấy với nhóm aldehyde của tinh
dầu. Citral, 1-octanal (Caprylaldehyd) , 1-nonanal (Pelargonaldehyd) và 1
decanal (Capraldehyd) ức chế hoạt động của ACC synthase 50 đến 78%
15
Hình 5.4 Ảnh hưởng của tinh dầu đến hoạt độ của ACO trên thịt quả Bí
và citronellal bằng 78-93% tại 3,6 đến 36 μl/l. Mặt khác, các loại tinh
dầu không ức chế hoạt động ACC oxidase. Tuy nhiên, aldehyt béo như
1-octanal, 1-nonanal và 1 decanal gây ra quá trình chuyển hóa không cần
enzyme từ ACC thành ethylene. Việc ủ enzym với hàm lượng khác nhau
của 1 -octanal, 1-nonanal và 1 decanal làm tăng hoạt độ của ACC và gia
tăng quá trình sản sinh ethylene [12].
4.1.6 Ảnh hưởng Salicylic và glutamine đến hoa sau thu hoạch
Trong nghiên cứu mới đây vào tháng 4 năm 2011 của S. Zamani, M.
Kazemi and M. Aran về ảnh hưởng của acid salicylic và glutamine đến hoa
Hồng sau thu hoạch cho thấy rằng 2mM acid salicylic làm giảm sự thoát
anthocyanin và hoạt độ của ACO. Khi thêm 3mM glutamine vào 2mM acid
salicylic thi càng làm giảm quá trình thoát anthocyanin và hoạt độ của ACO.
Hoạt độ ACO đạt cao nhất khi trong hoa hồng được xử lý 4mM acid salicylic
[16].
Bảng 5.1 Ảnh hưởng của Salicylic và glutamine đến hoa Hồng sau
thu hoạch
16
Hình 5.5 Sinh tổng hợp ethylene, hoạt độ của
ACC synthase và ACC oxydase [A]; phân tích
Western blot đối với protein ACC oxydase [B].
4.1.7 Ảnh hưởng của việc làm lạnh đến sản sinh ethylene, hoạt động
của ACC synthase và ACC oxidase [17].
Quả Lê Passe Crassane giữ đến 100 ngày tại 18
o
C trong không khí sau

mối tương quan với sự
tích tụ của protein 38
kDa tương ứng. Các
kháng nguyên ACC oxidase hầu như không phát hiện được trong quả không
chịu lạnh.
17
4.1.8 Hoạt độ ACO trong bảo quản quả Kiwi [20].
Quả Kiwi khi được xử lý 100 µg/ml ethylene ở 20
o
C trong 24h sau đó
theo dõi bảo quản trong 10 ngày tiếp theo. Kết quả cho thấy, trong hai ngày
đầu hoạt độ ACO tăng rất cao hơn so với quả không được xử lý, đến ngày thứ
4 thì bắt đầu giảm mạnh và xuống thấp hơn.

4.1.9 Ảnh hưởng của Fe2+ và NaHCO3 đến hoạt độ ACO
Theo nghiên cứu của Jian trên táo, hoạt lực của enzyme ACC
oxydase đạt cực đại khi trong môi trường có mặt của Fe
2+
10 µM và Natri
ascorbate 1 mM [26].
Kết quả nghiên cứu của Moya-León MA và John (1994) trên quả chuối
cho thấy khi enzyme ACC oxydase nhận được Fe
2+
20 µM, NaHCO
3
10 mM
và Natri ascorbate 20 mM thì hoạt lực đạt 50%, khi trong môi trường có mặt
của Fe
2+
0,2 mM, NaHCO

(Musa AAA Cavendish) cho thấy rằng Với nồng độ 0,8 g/l, Retain – AVG
phun cận thu hoạch tại thời điểm chuối sau khi cắt hoa 78 ngày cho giá trị hoạt
lực ACC oxydase đạt cực đại chậm nhất vào ngày bảo quản thứ 40, so với
trường hợp không sử dụng Retain – AVG 28 ngày, ở cùng điều kiện (t
0
= 13
0
C,
bao bì LDPE 25 µm). Và đã xác định được loại bao bì LDPE 25 µm có khả
năng ức chế hoạt lực enzyme ACC oxydase tốt nhất trong quá trình bảo quản
tươi chuối tiêu ở cùng điều kiện (t
0
= 13
0
C, Retain – AVG nồng độ 0,9 g/l).
Nguyễn Văn Toản (2011) khi nghiên cứu “Điều tiết quá trình sinh tổng
19
hợp etylen nhằm kéo dài thời gian chín sau thu hoạch của quả chuối tiêu” thì
hiệu quả sinh tổng hợp etylen nhằm kéo dài thời gian bảo quản tươi chuối tiêu
sau thu hoạch đạt giá trị (nồng độ AVG 0,8 g/l, thời điểm phun 78 ngày, 28
ngày bảo quản) là hoạt lực ACC oxydase: 0,44 (nmol C2H4.g-1.h-1)/2,18
(nmol C2H4.g-1.h-1) khi có/ không sử dụng AVG. Điều này cho thấy, cường
độ sản sinh etylen bị kìm hãm sau khi tiến hành điều tiết bằng AVG ở giai
đoạn cận thu hoạch và rất quan trọng trong việc đảm bảo chín sinh học tự
nhiên của chuối tiêu sau khi thực hiện giải pháp công nghệ điều tiết nội
enzym ACC oxydase.
20
KẾT LUẬN
Trong quá trình tìm hiểu về enzyme ACC oxydase tôi nhận thấy rằng
enzyme này có tác động rất lớn đến quá trình sản sinh ethylene trong rau quả.

Cavendish), Đại học Nông Lâm Huế, 2009
[3] Nguyễn Văn Toản, Điều tiết quá trình sinh tổng hợp etylen nhằm kéo
dài thời gian chín sau thu hoạch của quả chuối tiêu. Đại học Nông Lâm
Huế, 2011
[4] Trần Xuân Ngạch; “Công nghệ enzym”; Trường Đại Học Bách Khoa
Đà Nẵng; 2005
[5] Adams D.O, Yang S.F. (1979), “Ethylene biosynthesis; Identification of
1- aminocyclopropane-1-carboxylic acid as an intermediate in the conversion of
methionine to ethylene”, Proc Natl Acad Sci, 76, pp. 170-174.
[6] Fusao Mizutani,* A. B. M. Golam Rabbany and Hiroaki Akiyosh
(1997), Inhibition of ethylene production and 1- aminocyclopropane- 1-
carboxylate oxidase activity by tropolones.
[7] Fusao Mizutani,* Jian Guo Dong And Shang Fa Yang (1995), Effect
of pH on CO
2
-activated 1-aminocyclopropane-1- carboxylate oxidase
activity from apple fruit.
[8] Yang S.F. and N.E. Hoffman. Ethylene biosynthesis and its regulation
in higher plants. Annu. Rev. of Plant Physiol. Vol 35, 1984.
[9] M.D.C. Antunes a,*, E.M. Sfakiotakis (2000), Effect of high
temperature stress on ethylene biosynthesis, respiration and ripening of
‘Hayward’ kiwifruit.
[10] Yang S.F., Hoffman N.E (1984), “Ethylene biosynthesis and its
regulation in higher-plants”, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.,
Vol 35, pp. 155 189.
[11] M.A. Moya-León and P. John, 1994, Activity of 1- minocyclopropane
1-Carboxylate (ACC) Oxidase (Ethylene-Forming Enzyme) in the Pulp and
Peel of Ripening Bananas
22
[12] Golam Rabbany và cộng sự, 2010, Effect of Essential Oils on In Vitro

23
[23] Frederick B. Abeles, Page W. Morgan, Nikal E. Saltveit; “Ethylene in
plant biology”; Academic Press. inc; 1992
[24] Mita S, S. Kawamura, K. Yamawaki, K. Nakamura, H. Hyodo.
Differential expression of genes involved in iosynthesis and perception of
ethylen during ripening of passion fruit (passiflora edulis sims). Plant cell
Physiol 39, 1998.
[25] Moya-León MA., P. John. Activity of 1- aminocy clopropane-1-
carboylate (ACC) oxidase (ethylene- forming enzyme) in the pulp and peel of
ripening bananas. Journal of Horticultural Science 69, 1994.
[26] Jian G.D., J. C. F. Maculet, and S. F. Yang. Purification and
characterization of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase from apple
fruit. Plant Biology 89, 1992.
[27] Pathak N., H. A. Mehar, P. Dhawan, K. S. Manoj and N. Pravendra.
Expression and activities of ethylene biosynthesis enzymes during ripening
of banana fruits and effect of 1-MCP treatment. Plant Gene Expression
Laboratory, National Botanical Research Institute, Rana Pratap Marg,
Lucknow, 226001, India. Department of biochemistry, MSB, UMDNJ, 185,
South Orange Av., Newark, NJ, 07103, USA. Department of Forest
Genetics and Plant Physiology, Umea Plant Science Centre, Umea, Sweden.
Author for correspondence, 2003.
24
MỤC LỤC
hợp etylene 1
4.1.7Ảnh hưởng của việc làm lạnh đến sản sinh ethylene, hoạt động 17
của ACC synthase và ACC oxidase [17] 17
4.1.8Hoạt độ ACO trong bảo quản quả Kiwi [20] 18
4.1.9 Ảnh hưởng của Fe2+ và NaHCO3 đến hoạt độ ACO 18
4.1.10 Ảnh hưởng của 1– MCP đến hoạt lực ACO 19
KẾT LUẬN 21