ĐẶT VẤN ĐỀ
Theo số liệu thống kê của FAO, Việt Nam là nước xuất khẩu tinh bột sắn
đứng thứ hai trên thế giới, chỉ sau Thái Lan. Tinh bột sắn được sử dụng rộng rãi
trong nhiều lĩnh vực công nghiệp khác nhau như thực phẩm, y dược, dệt…
Chính vì vậy, trong những năm gần đây, ở nước ta nhiều nhà máy sản xuất tinh
bột sắn ra đời. Hiện nay, ở Việt Nam có trên 60 nhà máy tinh bột sắn với tổng
công suất khoảng 38 triệu tấn củ tươi/năm. Theo ước tính một nhà máy chế biến
tinh bột sắn có công suất 30 – 100 tấn/ngày sẽ sản xuất được 7,5 – 25 tấn tinh
bột, kèm theo đó là 12 – 48 tấn bã (số liệu lấy từ nhà máy sản xuất tinh bột sắn
Fococev Thừa Thiên Huế). Chất thải rắn chính là vỏ và bã sắn. Bã sắn có độ ẩm
trên 80% nên khi phơi dễ bị nhiễm khuẩn, sinh mùi khó chịu và ảnh hưởng đến
môi trường xung quanh. Tại một số địa phương có nhà máy tinh bột sắn, người
dân sinh sống trong khu vực lân cận, hằng ngày, lúc ăn cũng như lúc ngủ, họ
phải chịu mùi hôi thối nồng nặc của bã sắn ngâm ủ, phơi và vận chuyển vung
vải trên đường. Như vậy, vấn đề ô nhiễm tại các nhà máy tinh bột sắn hiện nay
là vấn đề cần được giải quyết một cách khẩn trương. Bởi lẽ tình trạng này càng
kéo dài thì môi trường ngày càng bị ô nhiễm trầm trọng. Hơn nữa, xử lí bã sắn
vừa làm tăng giá trị cho bã sắn vừa tạo sản phẩm phụ có ích trong các nhà máy
sản xuất tinh bột sắn. Hiện nay, bã sắn chủ yếu được bán làm thức ăn gia súc ở
dạng khô hoặc dạng tươi. Việc sử dụng bã sắn theo dạng này mang lại hiệu quả
về giá trị dinh dưỡng và kinh tế không cao. Việc nghiên cứu giải pháp xử lý bã
sắn bằng chế phẩm vi sinh sẽ vừa có ý nghĩa kinh tế, vừa có ý nghĩa môi trường.
Bacillus là loài vi khuẩn có khả năng sinh enzyme ngoại bào và nội bào
mạnh, các enzym của Bacillus có hoạt tính sinh học cao. Chúng ngày càng được
sử dụng nhiều trong các ngành công nghiệp như thực phẩm, thuộc da, y học, dệt
vải
Do đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu khả năng
thuỷ phân bã sắn bằng các chủng vi khuẩn Bacillus. sp” nhằm tìm ra giải
pháp xử lý bã sắn bằng chế phẩm vi sinh vừa mang lại giá trị kinh tế, vừa có ý
nghĩa môi trường.
Nội dung nghiên cứu gồm có:
Trích ly thô
Trích ly tinh
2-4
0
Be
Sữa loãng
Bã sắn
3
3
Đóng bao
Làm nguội
Sấy
210-220
0
C
Ly tâm
32-35%
Nước sạch
Dịch bào
Phân ly thô
10-12
0
Be
Phân ly tinh
19-21
0
Be
4
4
Sơ đồ 1 Sơ đồ quy trình sản xuất tinh bột sắn tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn
(1998)
Độ ẩm 5,02 9,52 10,70 11,20
Protein 1,57 0,32 1,60 1,61
Lipid 1,06 0,83 0,53 0,54
Chất xơ 50,55 14,88 22,20 21,10
Tro 1,10 0,66 1,50 1,44
Carbonhydrates 40,50 63,85 63,40 63,00
5
5
Hiện nay, bã sắn tại các nhà máy sản xuất tinh bột sắn được bán cho các
doanh nghiệp hoặc người dân chăn nuôi nhỏ với giá rất rẻ khoảng 200 đồng/kg
bã tươi và 800 – 1000 đồng/kg bã khô (giá tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn
Fococev Thừa Thiên Huế). Với giá thành như vậy thì việc sử dụng bã sắn để sản
xuất các sản phẩm khác là hoàn toàn thuận lợi, vừa giải quyết được vấn đề môi
trường, vừa tăng thêm giá trị sử dụng và kinh tế cho bã sắn.
Ở Việt Nam bã sắn chủ yếu được sử dụng để sản xuất ra các sản phẩm sau:
- Thức ăn cho động vật nhai lại
- Sản xuất thức ăn chăn nuôi có giá trị cao từ bã sắn
- Sản xuất cồn sinh học
-Tạo chất dính cho sản xuất diêm
- Dùng làm phân bón
- Dùng làm thức ăn gia súc
- Sản xuất etanol sinh học
1.1.3. Tình hình nghiên cứu và sử dụng bã sắn hiện nay
Ở Việt Nam, bã sắn chủ yếu được bán ra ở dạng chưa qua xử lý hoặc phơi
khô khi không thể tiêu thụ ở dạng tươi được. Việc nghiên cứu nâng cao chất
6
6
lượng sử dụng của bã sắn và sử dụng bã sắn vào mục đích công nghiệp còn rất
ít, chỉ có một số công trình tiểu biểu như:
C trong 60
phút.
- Shaktimay Kara và cộng sự (2010)[39] đã công bố điều kiện thích hợp
để sản xuất α-amylase bằng Streptomyces erumpens MTCC 7317 trong môi
trường lên men bán rắn của bã sắn. Kết quả cho thấy rằng, khi nuôi cấy
Streptomyces erumpens MTCC 7317 với tỉ lệ 15% (v/w, 2.5 x 10
6
CFU/ml) vào
môi trường bã sắn ở điều kiện nhiệt độ 50
0
C, độ ẩm 60% trong thời gian 60 giờ
7
7
và có bổ sung nguồn nitơ từ cao thịt thì khả năng thu nhận enzyme α-amylase là
cao nhất.
- Adenise Lorenci Woiciechowski và cộng sự (2002)[18] đã chứng minh
rằng quá trình thủy phân bã sắn bằng việc sử dụng kết hợp acid và enzyme sẽ
cho hiệu quả kinh tế cao hơn là chỉ sử dụng acid hoặc enzyme để thủy phân.
- Rojan P.John và cộng sự (2006)[33] đã sử dụng Lactobacillus ( L.casei
và L.delbrueckii) để thực hiện đồng thời hai quá trình đường hóa và lên men bã
sắn để sản xuất acid lactic.
1.2 Tổng quan về Bacillus sp.
1.2.1 Giới thiệu chung
Vi khuẩn thuộc Bacillus sp. phân bố rộng rãi trong tự nhiên, đa dạng về
sinh thái. Các loài Bacillus sp. đã, đang và ngày càng trở thành những vi sinh vật
quan trọng hàng đầu về mặt ứng dụng. Các ứng dụng của chúng bao trùm hàng
loạt lĩnh vực, từ sản xuất thực phẩm thủ công truyền thống đến công nghệ lên
men bia hiện đại, đến sinh học phân tử, y-dược chữa các bệnh hiểm nghèo, mỹ
phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm, thu hồi bạc kim loại từ các phế liệu. Chính vì
lẽ đó nên đã có ngày càng nhiều các nghiên cứu sâu về Bacillus sp. cũng như mở
nhiệt độ 30
o
C và pH=10
- Shah và cộng sự (1999)[38] đã nghiên cứu thu nhận và khảo sát tính chất
của enzyme thủy phân cellulose, xylananase ngoại bào, bởi Bacillus sp. và ứng
dụng chế phẩm enzyme này trong việc thủy phân bã sắn. Chế phẩm enzyme này
hoạt động tốt ở 60
o
C và pH 8. Nó có khả năng thủy phân bã sắn ở khoảng pH
khá rộng, từ 7 đến 9.
1.2.2 Tổng quan về một số enzyme của Bacillus sp.
1.2.2.1. Amylase
• Giới thiệu chung về amylase
Amylase là enzyme có khả năng xúc tác thủy phân tinh bột thành các sản
phẩm khác nhau bao gồm dextrin và các polyme có kích thước nhỏ hơn được tạo
thành từ các đơn vị glucose. Các enzyme này được sử dụng rộng rãi trong công
nghiệp sản xuất bánh mì, sản xuất các loại kẹo, công nghệ sản xuất rượu bia,
công nghiệp sản xuất mật tinh bột, công nghiệp dệt và công nghiệp giấy. Trên
thế giới, enzyme amylase được sản xuất từ nguồn vi sinh vật chiếm khoảng 25-
30% [20].
• Phân loại và tính chất [1], [13]
Theo tính chất và cách thức tác dụng lên tinh bột, người ta phân chia
amylase làm 3 loại: α-amylase, β-amylase và γ-amylase.
α -amylase
9
9
α-amylase là một trong những enzyme thương mại quan trong nhất, α-
amylase xúc tác thủy phân liên kết α-1,4 glucoside nội mạch ở bất kỳ vị trí nào
trong phân tử tinh bột.
α-amylase tương đối bền với các tác dụng của nhiệt. Đặc biệt α-amylase
mất hoạt tính khi đun nóng trên 70
o
C.
• Nguồn thu nhận amylase
Enzyme amylase được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau, rất phổ biến
trong thế giới sinh vật. Chúng được tìm thấy trong thực vật, động vật và vi sinh
vật như ở một số loại nấm và vi khuẩn.
10
10
Tuy nhiên amylase được thu nhận từ nguồn vi sinh vật là có giá trị kinh tế
hơn cả.
Amylase được sản xuất từ nguồn vi sinh vật chiếm khoảng 25-30% thị
trường enzyme thế giới (Nguyen và cộng sự., 2002) .
Enzyme amylase thu nhận từ vi sinh vật chủ yếu là từ nấm mốc và vi
khuẩn, có hoạt tính rất mạnh, vượt xa enzyme từ các nguồn khác.
• Ứng dụng của amylase [6], [12], [14]
Công nghiệp sản xuất bia, rượu
Đối với công nghiệp rượu cồn, các enzyme đường hóa có một vai trò đặc
biệt quan trọng. Nguồn enzyme thường là A. awamori, A. oryzae, A. usamii.
Trong sản xuất bia, thường dùng hỗn hợp canh trường Asp. oryzae và
B. amyloliquefaciens để đường hóa thay malt. Hiện nay, ở nhiều nước trên thế
giới, người ta thay thế 25-50% malt bằng các nguyên liệu phi malt, nghĩa là
bằng các hạt chưa nảy mầm như đại mạch loại hai và loại ba, ngô đã lấy hết chất
béo Việc sử dụng chế phẩm amylase vi sinh vật để thay thế malt bằng các
nguồn nguyên liệu tinh bột khác giúp giảm giá thành, rút ngắn quy trình sản
xuất, mà chất lượng bia vẫn đảm bảo.
Công nghiệp sản xuất bánh mỳ và bánh nướng
Amylase được sử dụng hàng trăm năm trong công nghiệp sản xuất bánh
nướng dưới dạng các chế phẩm enzyme từ malt để sản xuất nhiều sản phẩm có
chất lượng cao. Enzyme này có khả năng làm thay đổi hoàn toàn chất lượng của
enzyme hoàn toàn giữ được độ bền, độ dai.
Công nghiệp giấy
Amylase được sử dụng trong ngành công nghiệp giấy để làm giảm độ nhớt
của hồ tinh bột khi phủ lên bề mặt giấy. Cũng tương tự như trong ngành dệt, việc
hồ giấy sẽ làm giảm các tác động cơ học đến chất lượng giấy trong quá trình sản
xuất. Tinh bột cũng là tác nhân hồ hóa thích hợp, góp phần cải thiện chất lượng
giấy thành phẩm, làm giấy bền và dai hơn.
Trong chăn nuôi
Chế phẩm amylase được sử dụng riêng lẻ hay phối hợp với các chế phẩm
enzyme khác như: protease, cellulase, hemicellulase, peptinase để sản xuất các
loại thức ăn dễ tiêu hoá, dễ hấp thụ trong chăn nuôi gia súc, gia cầm, đặc biệt
cho gia súc non. Do đó làm tăng trọng nhanh, tăng khả năng sinh sản và giảm
lượng thức ăn.
1.2.2.2 Protease
12
12
• Giới thiệu chung về protease
Protease là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết
peptide (-CO-NH-) của chuỗi polypeptide.
• Ứng dụng của protease
Protease là enzyme công nghiệp quan trọng, chiếm khoảng 60% trong
tổng enzyme chiết xuất từ vi sinh vật được bán trên thị trường [9], [21], chủ yếu
là các protease kiềm [22]. Nhiều loài sinh vật, đặc biệt là các loài vi sinh vật có
khả năng tiết ra một lượng lớn enzyme protease dùng để thủy phân các loại
protein đang ngày càng được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như y dược,
nông nghiệp, công nghiệp thuộc da, công nghiệp sản xuất xà phòng, sản xuất
giấy, mỹ phẩm, xử lý môi trường ô nhiễm …[22].
Tùy theo tính chất của các loại chế phẩm protease khác nhau (pH, nhiệt
độ, …) mà chúng được ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau của đời sống
[12]. Sau đây là một số ứng dụng chủ yếu của protease.
Protease thường dùng trong sản xuất thịt thường là protease thực vật (papain,
bromelain, ficin) và protease vi sinh vật (nấm, xạ khuẩn) [1].
- Sản xuất các sản phẩm đậu:
Giá trị dinh dưỡng của bột đậu nành thường bị hạn chế do các yếu tố phản
dinh dưỡng như chất ức chế trypsin và lectin, các chất này có tác dụng ngăn cản
sự tiêu hóa protein [26]. Do đó, khi bổ sung protease subtilisin của B. subtilis làm
tăng hàm lượng chất hòa tan và giảm mức độ ức chế trysin trong bột đậu nành.
Marsman và cộng sự (1997) nhận thấy rằng enzyme neutrase có thể thủy phân
được β-conglycinin [10]. Caine và cộng sự (1998) đã chứng minh protease của
B. subtilis có khả năng ổn định giá trị của nguyên liệu thô và nguyên liệu chế
biến của đậu nành [17]. Các dịch thủy phân protein của đậu được dùng để sản
xuất nước giải khát và tạo thức ăn kiêng, bổ sung chất dinh dưỡng và làm thức
ăn trẻ em, bổ sung vào nước chấm (xì dầu) làm tăng hương thơm cho sản phẩm.
- Chế biến thủy sản:
Các chế phẩm protease sử dụng trong công nghiệp chế biến và sản xuất bột
cá với nhiều mục đích khác nhau, như loại bỏ da cá, sản xuất dịch thủy phân
protein của cá, tách thịt khỏi xương, da, bột mịn, rút ngắn thời gian sản xuất và
tăng hiệu quả kinh tế. Trong sản xuất nước mắm, protease giúp rút ngắn thời gian
chế biến từ 3-6 lần, tăng thể tích nước mắm nguyên chất thu được đồng thời làm
tăng hương vị cho sản phẩm .
Trong công nghiệp sản xuất hóa mỹ phẩm và chất tẩy rửa
Trong công nghiệp sản xuất xà phòng, mỹ phẩm, thuốc đánh răng, người
14
14
ta cho protease vào có tác dụng làm sạch vết bẩn, tẩy mồ hôi, làm da mịn, làm
sạch răng [4]. Vào những năm 60, một nửa số loại bột giặt ở châu Âu, châu Mỹ
đều có chứa protease. Đặc biệt là nhóm protease kiềm đóng vai trò rất quan
trọng được ứng dụng một cách phổ biến chiếm 50% tổng số enzyme hiện hành.
Chất tẩy rửa đầu tiên có chứa enzyme vi khuẩn được sản xuất vào năm 1956 với
tên Bio-40 với nhiều ưu điểm giá thành rẻ và có thể tái sử dụng. Đến năm 1963,
15
Protease cũng được dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nhằm nuôi
cấy vi sinh vật sản xuất ra kháng sinh, chất kháng độc. Ngoài ra người ta còn
dùng enzyme protease để cô đặc và tinh chế các huyết thanh kháng độc để
chữa bệnh [4].
Trong xử lý ô nhiễm môi trường
Chất thải từ các khu công nghiệp và chất thải sinh hoạt là nguyên nhân
chính góp phần gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng. Trong thành phần của
các chất thải này chứa một lượng lớn protein là nguyên nhân gây ra các hiện
tượng phú dưỡng, ảnh hưởng đến các loài động thực vật sống ở các sông hồ mà
chất thải này đổ vào. Nhiều protease ngoại bào ngày càng được sử dụng rộng
rãi trong quá trình xử lý nước thải ở quy mô công nghiệp nhờ khả năng phân
giải protein thành các chuỗi peptide ngắn và amino acid [3].
Trong nông nghiệp các loại chế phẩm có chứa protease và các enzyme
khác được sử dụng như là phân bón hữu cơ. Ngoài ra chúng còn đóng góp vào
việc giảm thiểu ô nhiễm môi trường [3].
Ngành chế biến thủy sản hàng năm thải ra một lượng lớn các phụ phế
phẩm như nội tạng, đầu, xương, da cần được xử lý hoặc chế biến tiếp. Protease
ngoại bào được tiết ra từ B. polymyxa, B. megaterium, vừa làm tăng sản lượng
các phản ứng thủy phân thịt cá, vừa góp phần làm giảm ô nhiễm môi trường
nuôi trồng thủy sản [11].
Một số chủng thuộc chi Bacillus có khả năng phân hủy hợp chất hữu cơ
đơn giản và phức hợp thải ra từ thức ăn thừa và phế thải nhờ khả năng tổng hợp
enzyme phân hủy hữu cơ protease. Vì vậy chúng được sử dụng để làm chế
phẩm sinh học biochie dùng xử lý nước nuôi thủy sản bảo đảm an toàn sinh học
[11].
Protease kiềm từ các loài Bacillus được tạo thành với lượng lớn, có đặc
tính bền vững, hoạt động tốt với nhiệt độ và pH cao, có khả năng thủy phân
protein vỏ của các loài giáp xác trong nước, nên chúng được ứng dụng trong xử
lý chất thải từ động vật giáp xác [29].
- Thủy phân gỗ và phế liệu gỗ: Dùng cellulase để thuỷ phân các vật liệu
gỗ thành đường đơn giản chế biến làm thức ăn gia súc.
Enzyme cellulase được tổng hợp nhiều ở Myrothecium verrucaia,
Polyporus versicolor,Trichodema viride, Penicillium notatum, Aspergillus
awamori, Aspergillus oryzae, Bacillus subtilis.
17
17
PHẦN 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng
Bã sắn khô được mua tại nhà máy sản xuất tinh bột sắn Fococev Thừa
Thiên Huế.
Các chủng Bacillus subtilis DC5 được phân lập từ dưa cải; chủng Bacillus
subtilis C10 được phân lập từ phế liệu tôm; chủng Bacillus amyloliquefaciens
T9 phân lập từ tôm chua và chủng Bacillus amyloliquefaciens N1 được phân lập
từ nem chua; tất cả các chủng này được định danh bởi công ty Nam Khoa NK-
BIOTEK số 793/58 Trần Văn Soạn, P. Tân Hưng, Q7, TP.HCM và đang được
bảo quản tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật của Viện Tài nguyên Môi trường và
Công nghệ Sinh học số 27 Phan Đình Phùng – Thành phố Huế.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Các phương pháp vi sinh vật
2.2.1.1. Phương pháp cấy tăng sinh
Khuẩn lạc của 4 chủng được nuôi cấy ở trong 2 mL môi trường lỏng có
chứa 1% peptone, 0,3% cao thịt và 0,5 % NaCl trong ống nghiệm, lắc 200
vòng/phút ở 35
0
C trong 24 giờ [10].
2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy để thu nhận enzyme
Phân phối 500 µl dịch cấy tăng sinh vào bình tam giác 100 mL có chứa
20 mL môi trường dinh dưỡng (môi trường tối ưu sinh enzyme amylase) (có
Cấy vào bã sắn đã thanh trùng
Ủ ở 40
0
C, 48h
Ly tâm, thu dịch nổi
Thực hiện phản ứng màu
Thực hiện phản ứng màu
19
19
Tiến hành thí nghiệm bằng cách cấy 10mL dịch canh trường vào bình
tam giác có chứa 2g bã sắn và 10mL nước cất đã qua thanh trùng. Làm tương
tự với mẫu đối chứng nhưng khác là dịch canh trường đã được thanh trùng để
tiêu diệt enzym và vi khuẩn. Sau đó đem ủ ở máy trong 48 giờ, ở 40
0
C. Sau
khi ủ, tiến hành ly tâm ở 4
0
C, 14000vòng/phút trong 10 phút để thu dịch nổi
và tiến hành làm phản ứng màu. Đo hấp thụ màu ở bước sóng 540 nm.
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thuỷ
phân bã sắn [18], [33], [36]
2.2.3.1. Tỷ lệ canh trường
Tiến hành thí nghiệm bằng cách cấy lần lượt 5mL, 10mL, 15mL, 20mL
dịch canh trường vào bình tam giác có chứa 2g bã sắn và 10mL nước cất đã
qua thanh trùng. Riêng đối với bình tam giác có 5mL canh trường phải bổ
sung thêm 10 mL dịch canh trường đã qua xử lý nhiệt và đối với bình tam
giác có 10mL thì thêm 5 mL, bình tam giác 15mL thì phải bổ sung thêm 5mL.
Tương tự, ta tiến hành cho mẫu đối chứng nhưng khác là dịch canh trường đã
được thanh trùng để ngừng hoạt tính enzym và vi khuẩn. Sau đó đem ủ ở
máy trong 48 giờ, ở 40
C và tiếp đến là ở nhiệt độ thích hợp
trong các khoảng thời gian: 12 giờ, 18 giờ, 24 giờ, 30 giờ, 36 giờ, 42 giờ và
20
20
48 giờ. Sau khi ủ, tiến hành ly tâm ở 4
0
C, 14000 vòng/phút trong 10 phút để
thu dịch nổi và tiến hành làm phản ứng màu. Đo hấp thụ màu ở bước sóng
540 nm.
2.2.4. Phương pháp thăm dò khả năng lên men của chủng Lactobacillus
fermentum T10 và Lactosbacillus fermentum MC9 trong môi trường dịch
bã sắn [20], [33], [34], [35]
Dịch bã sắn thu được sau khi qua quá trình thủy phân nhờ enzyme của
các chủng Bacillus.sp sẽ được làm môi trường nuôi cấy 2 chủng
Lactobacillus fermentum T10 và Lactobacillus fermentum MC9 để đánh giá
khả năng lên men của hai chủng này trong môi trường bã sắn. Thí nghiệm
được bố trí trong các khoảng thời gian là: 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ và 42 giờ.
2.2.5. Các phương pháp hoá sinh
2.2.5.1. Xác định hoạt độ α- amylase bằng phương pháp Bernfield [21]
Nguyên tắc: dùng dung dịch tinh bột làm cơ chất để xác định hoạt độ thủy
phân của amylase trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu
với thuốc thử tạo màu Dinitrosalisilic (hòa tan 1g acid 3,5-dinitrosalisilic trong
20ml NaOH 2N và 50ml nước cất, cho thêm 30g kalinatri tactrat và dẫn nước
đến 100ml). Độ hấp thụ ánh sáng (OD) được đo trên máy quang phổ, bước sóng
540nm. Dựa vào đường chuẩn (Hình 1.2 phụ lục 1) để tính sản phẩm tạo thành
dưới tác dụng của enzyme.
Tiến hành: Hỗn hợp phản ứng 0,1ml dung dịch tinh bột 1% (hòa tan 1g
tinh bột và 0,035g NaCl trong 60ml dịch đệm phosphat, pH 7.0, đun sôi cho đến
tan, để nguội và dẫn đến 100 ml) và 0,1ml dung dịch enzym. Ủ hỗn hợp này ở
30
C.
μ mol glucose
10 x 0,1
Hoạt độ = (U/ml)
Trong đó:
10: thời gian phản ứng
0,1: thể tích dịch enzyme đem phản ứng
2.2.5.2. Xác định hoạt độ protease theo phương pháp Anson cải tiến
Hoạt độ protease của các chủng Bacillus được xác định theo phương
pháp Anson cải tiến. Cơ chất được sử dụng là casein 2% (w/v) trong đệm
Sorencen. Sự thủy phân của protease được bắt đầu bằng cách bổ sung 150 µL
dung dịch enzyme thích hợp vào trong 300 µL cơ chất, sau đó ủ ở 55
o
C trong 10
phút, dừng phản ứng bằng 750 µL TCA 5% (w/v), ủ dung dịch phản ứng 10 phút
ở 35
O
C, ly tâm ở 4
o
C, 14.000 vòng/phút để thu dịch nổi. Xác định hoạt độ thủy
phân protein trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành bằng phản ứng màu với
thuốc thử Folin. Đo OD của dung dịch màu thu được sau phản ứng bằng máy
22
22
quang phổ SmartSpec
TM
Plus (Bio-Rad, USA) ở bước sóng 750 nm. Dựa vào đồ
thị chuẩn tyrosine để tính sản phẩm tạo thành tương ứng dưới tác dụng của
enzyme [1].
Dịch nuôi cấy
CO
3
Cho vào 200µl Folin 0,2N
Đồng nhất
ở máy Vontex
Để ổn định 28 phút
So màu ở 750nm
24
24
2.2.6. Các phương pháp vật lý
Xác định, điều chỉnh pH ban đầu và theo dõi pH sau quá trình nuôi cấy
bằng máy đo pH điện tử
2.2.7. Phương pháp toán học
Sử dụng phương pháp phân tích phương sai (ANOVA) để xác định sự sai
khác giữa các trung bình.
25
25
Copyright: Tài liệu đại học ©