BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI
NGUYỄN MẠNH KIÊN
NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỔI DI TRUYỀN
CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA POLYMERASE
CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 ĐƯƠNG NHIỄM
TẠI VIỆT NAM
Chuyên ngành : HÓA SINH Y HỌC
Mã số : 62 72 01 12
LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. LÊ THANH HÒA
2. PGS.TS. ĐẶNG THỊ NGỌC DUNG
HÀ NỘI – 2014
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận án của mình, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu
sắc tới các Thầy (Cô):
- PGS.TS. Lê Thanh Hòa – Viện Công nghệ sinh học,
- PGS.TS. Đặng Thị Ngọc Dung – Trường Đại học Y Hà Nội,
đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án này.
- Thầy Chủ tịch Hội đồng và các Thầy (Cô) trong Hội đồng chấm luận án,
cùng các nhà khoa học trong cả nước, đã có nhiều ý kiến quí báu, giúp tôi hoàn
thiện luận án của mình.
Trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu và hoàn thành luận án của mình,
tôi nhận được sự giúp đỡ quí báu của Nhà trường, đơn vị công tác, tập thể, các nhà
khoa học, gia đình và bè bạn. Tôi xin trân trọng cảm ơn:
- Ban giám hiệu Trường Đại học Y Hà Nội; Ban lãnh đạo Bệnh viện quân y
7A, Cục Hậu cần, Quân khu 7, đã tạo điều kiện thuận lợi nhất cho tôi trong suốt quá
trình học tập và nghiên cứu tại trường.
- Thầy, cô và các anh, chị trong Bộ môn Hóa sinh, Phòng Quản lý đào tạo Sau
MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt trong luận án iv
Danh mục các bảng v
Danh mục các hình và sơ đồ vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA VIRUS CÚM A 3
1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A 3
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A 4
1.1.3. Cấu tạo và chức năng của các phân đoạn RNA hệ gen virus cúm A 5
1.1.4. Đặc điểm cấu tạo và chức năng của các gen PB2, PB1 và PA 7
1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A 12
1.1.6. Đặc tính biến đổi di truyền các gen và hệ gen virus cúm A 14
1.2. ĐẠI DỊCH CÚM A VÀ ĐẶC ĐIỂM BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1 VÀ
PA CỦA VIRUS CÚM A GÂY ĐẠI DỊCH CÚM Ở NGƯỜI 16
1.2.1. Các đại dịch cúm A ở người trong lịch sử 16
1.2.2. Đặc điểm biến đổi các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A gây đại dịch
cúm ở người 17
1. 3. ĐẶC ĐIỂM DỊCH TỄ VÀ SINH HỌC VIRUS CÚM A/H5N1 22
1.3.1. Đặc điểm dịch tễ virus cúm A/H5N1 22
1.3.2. Đặc điểm sinh học của virus cúm A/H5N1 26
1.4. NGHIÊN CỨU BIẾN ĐỔI CÁC GEN PB2, PB1, PA LIÊN QUAN ĐỘC
LỰC VÀ LÂY TRUYỀN Ở NGƯỜI CỦA VIRUS CÚM A/H5N1 28
1.4.1. Trên thế giới 28
1.4.2. Tại Việt Nam 30
3.2.1.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB2 65
3.2.2. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67
3.2.2.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 67
3.2.2.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PB1 69
3.2.2.3 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 69
3.2.2.4 Kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 73
3.2.3. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73
3.2.3.1 Kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PA 73
3.2.3.2 Kết quả so sánh tỉ lệ tương đồng về nucleotide và amino acid gen PA 77
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1 VÀ
PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 79
3.3.1. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB2 79
3.3.2. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PB1 82
3.3.3. Kết quả phân tích xác định phả hệ nguồn gốc gen PA 85
Chương 4. BÀN LUẬN 88
4.1. VỀ KẾT QUẢ THU NHẬN CÁC GEN PB2, PB1 VÀ PA CỦA SÁU BIẾN
CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU 88
4.1.1. Về kết quả thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88
4.1.2. Về qui trình nghiên cứu thu nhận các gen PB2, PB1 và PA 88
4.2. VỀ KẾT QUẢ SO SÁNH THÀNH PHẦN NUCLEOTIDE VÀ AMINO
ACID CÁC GEN PB2, PB1, PA CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM
A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC CHỦNG CỦA THẾ GIỚI 89
4.2.1. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 89
4.2.2. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93
4.2.2.1 Về kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid gen PB1 93
4.2.2.2 Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PB1-F2 94
4.2.2.3 Về kết quả xác định trình tự khung đọc mở gen PB1-N40 96
4.2.3. Về biến đổi thành phần nucleotide và amino acid gen PA 97
4.3. VỀ KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH PHẢ HỆ NGUỒN GỐC CÁC GEN PB2, PB1,
CỦA SÁU BIẾN CHỦNG VIRUS CÚM A/H5N1 NGHIÊN CỨU VỚI CÁC
nh©n
nghiªn
cøu (80
Nhãm
c¾t ho¹i
tö
(20
Nhãm
m« h¹t
(20
bÖnh
iv
DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT
Chữ viết tắt/
Ký hiệu
Tên đầy đủ
bp base pair
Da dalton
DNA Deoxyribonucleic acid
dNTP Deoxyribonucleotide Triphosphate
ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate
FAO Food and Agriculture Organization
HA Hemagglutinin
kb kilobase
M Matrix protein
MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis
NA Neuraminidase
NEP Nuclear Export Protein
NP Nucleoprotein
NS Non-structural protein
2.5. Thành phần và qui trình phản ứng chuyển đổi cDNA hệ gen virus cúm
A/H5N1 từ RNA tổng số trong nghiên cứu 42
2.6. Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến
chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 43
2.7. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR kiểm tra cDNA hệ gen 6 biến chủng virus
cúm A/H5N1 nghiên cứu 43
2.8. Thành phần phản ứng của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1
và PA từ cDNA hệ gen của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 44
2.9. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR thu nhận DNA các gen PB2, PB1 và PA
từ cDNA hệ gen 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 44
2.10. Thành phần phản ứng ghép-nối đoạn cDNA sản phẩm PCR vào plasmid
pCR
®
2.1-TOPO
®
47
2.11. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid tái tổ hợp bằng E.coRI 48
2.12. Thành phần phản ứng PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và PA
của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 49
2.13. Chu trình nhiệt của kỹ thuật PCR giải trình tự DNA các gen PB2, PB1 và
PA của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 50
3.1. Các vị trí sai khác nucleotide dẫn đến thay đổi amino acid trong trình tự
gen PB2 của 25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 63
3.2. Các vị trí thay đổi amino acid trong protein PB2 của 25 chủng virus cúm
A/H5N1 được so sánh 64
vi
Bảng Tên bảng Trang
3.3. Tỉ lệ tương đồng (%) thành phần nucleotide và amino acid gen PB2 của
25 chủng virus cúm A/H5N1 so sánh 66
3.4. Các vị trí sai khác nucleotide trong trình tự protein PB1 dẫn đến thay đổi
virus cúm A 15
1.8. Sơ đồ hình thành các virus cúm A gây đại dịch cúm ở người 21
1.9. Cây phả hệ minh họa sự hình thành và lưu hành xâm nhiễm gây bệnh ở
người của các clade HA(H5) virus cúm A/H5N1 ở châu Á từ 2003 – 2011 23
1.10. Sơ đồ minh họa tái tổ hợp hình thành các genotype Z, G và V của virus
cúm A/H5N1 24
1.11. Các genotype virus cúm A/H5N1 hình thành ở Việt Nam 26
2.1. Sơ đồ qui trình tổng quát nghiên cứu các gen PB2, PB1 và PA
polymerase của virus cúm A/H5N1 37
2.2. Sơ đồ bố trí vị trí bám mồi chuyển cDNA, thực hiện kỹ thuật PCR và giải
trình tự các gen PB2, PB1 và PA của virus cúm A/H5N1 41
2.3. Sơ đồ nguyên lí của kỹ thuật PCR 41
2.4. Sơ đồ cấu trúc của vector pCR
®
2.1TOPO (Invitrogen) 47
3.1. Kết quả điện di kiểm tra DNA một phần gen HA(H5) với cặp mồi H5F1 – H5R1
của 6 biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu 53
3.2. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB2 của 6 biến chủng virus cúm
A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 54
3.3. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PB1 của 6 biến chủng virus cúm
A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 55
3.4. Kết quả điện di kiểm tra DNA gen PA của 6 biến chủng virus cúm
A/H5N1 nghiên cứu thu nhận sau PCR 56
3.5. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB2 của 6
biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 57
3.6. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PB1 của 6
biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 58
3.7. Kết quả điện di kiểm tra các mẫu DNA plasmid tái tổ hợp gen PA của 6
biến chủng virus cúm A/H5N1 nghiên cứu sau cắt bằng enzym EcoRI 59
viii
gen PB1-F2 và PB1-N40 mã hóa tổng hợp các protein tương ứng, tham gia biểu
hiện độc lực của virus cúm A ở cơ thể bị nhiễm.
Từ năm 2003 đến nay, virus cúm A/H5N1 thể độc lực cao nguyên nhân gây ra
dịch cúm gia cầm và gây bệnh có tỉ lệ tử vong cao ở người (khoảng 60%), lan
truyền rộng rãi tới hơn 60 quốc gia trên thế giới. Trong đó, Việt Nam là quốc gia có
dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát vào năm 2003 và liên tục tái bùng phát nhiều
đợt dịch ở gia cầm hàng năm tại các địa phương, với hơn 62 người tử vong trong
tổng số hơn 124 người được xác định nhiễm loại virus này. Các trường hợp người
nhiễm và tử vong bởi virus cúm A/H5N1, được xác định là do virus xâm nhiễm trực
tiếp sang người thông qua tiếp xúc với gia cầm bệnh, chất thải ô nhiễm hoặc do sử
dụng các sản phẩm chứa virus từ gia cầm bệnh. Việt Nam cùng với Indonesia và Hy
Lạp, là các quốc gia có tỉ lệ người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 cao nhất
2
trên thế giới, được xác định là vùng dịch tễ trọng điểm cần quan tâm giám sát, ngăn
chặn, khống chế sự lây truyền của virus ở gia cầm và từ gia cầm sang người.
Các chủng virus cúm A/H5N1 clade 1, 2 và 7 với sự hình thành nhiều nhánh
clade thuộc 3 genotye Z, V và G, là các nhóm virus lưu hành phổ biến gây dịch cúm
A/H5N1 ở chim hoang dã, gia cầm và xâm nhiễm gây bệnh với tỉ lệ tử vong cao ở
người, tại Việt Nam và nhiều quốc gia trên thế giới từ năm 2003 đến nay. Gần đây,
nhóm virus clade 1.1 và đặc biệt là nhóm virus clade 2.3.2.1 hình thành từ năm
2009, có sự thay đổi lớn về kháng nguyên H5, có độc lực cao ở gia cầm và người
nhiễm so với các nhóm virus lưu hành trước đó, làm cho vấn đề phòng chống dịch
cho gia cầm và ngăn ngừa virus xâm nhiễm ở người trở nên phức tạp hơn.
Sự biến đổi của các gen PB2, PB1 và PA là cơ sở giúp virus thích nghi nhân
lên trong tế bào cảm thụ, yếu tố chìa khóa quyết định quá trình lây truyền dễ dàng
giữa người với người và gia tăng độc lực của virus ở cơ thể người, một trong các
vấn đề được quan tâm nghiên cứu giám sát ở virus cúm A/H5N1 gây bệnh dịch ở
gia cầm và người hiện nay. Bên cạnh đó, dữ liệu di truyền của các gen PB2, PB1 và
PA cùng với các gen trong hệ gen virus cúm A/H5N1 đương nhiễm, là cơ sở khoa
học cho phép dự báo sớm diễn biến dịch tễ học virus ở mức độ phân tử, nghiên cứu
tự nhân lên trong nhân của tế bào nhiễm. Bên cạnh đó, phức hợp enzym polymerase
của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA phụ thuộc RNA type II, không có cơ chế
đọc-sửa bản sao, tạo nên khả năng đột biến cao trong hệ gen, qua quá trình lây
truyền và lưu hành gây bệnh của virus ở các loài vật chủ [1], [2], [6].
1.1.1. Cấu tạo chung của virus cúm A
Virus cúm A tồn tại ở dạng các hạt virus (virion) hình cầu hoặc hình khối đa
diện đôi khi có dạng hình sợi, đường kính 80 – 120 nano mét (nm), khối lượng phân
tử khoảng 250 triệu dalton (Da). Hạt virus cúm A có cấu tạo đơn giản, bao gồm vỏ
ngoài (envelope), capsid và lõi là vật chất di truyền (hệ gen) của virus [1], [7].
+ Vỏ capsid có chức năng bảo vệ vật chất di truyền của virus cúm A, gồm
hàng trăm đơn vị cấu trúc gọi là capsomer.
4
+ Lớp vỏ ngoài (envelope) có bản chất là lipoprotein có nguồn gốc từ màng tế
bào nhiễm, mặt ngoài gắn các protein bề mặt đặc hiệu của virus và mặt trong được
lót bởi một lớp màng đệm là protein M1.
- Các protein bề mặt của virus cúm A có bản chất là glycoprotein gồm HA,
NA và M2, được gắn như những gai mấu nhô ra mặt ngoài vỏ capsid của hạt virus.
Có khoảng 500 gai mấu phân bố trên mặt ngoài vỏ capsid của một hạt virus, mỗi gai
mấu dài khoảng 10 – 14 nm và có đường kính khoảng 4 – 6 nm. Tỉ lệ phân bố
khoảng 4 – 5 phân tử protein HA trên 1 cụm protein NA (Hình 1.1A) [1], [7].
Hình 1.1. Mô hình và ảnh chụp các tiểu phần virus cúm A (xem [8])
Ghi chú: (A): Mô hình cấu tạo virus cúm A; (B): Các hạt virus cúm A chụp dưới kính hiển vi điện tử 4.000.000X.
- Hai protein HA và NA gắn trên bề mặt vỏ capsid, có vai trò quan trọng trong
quá trình xâm nhiễm, giải phóng hạt virus cúm A mới ở tế bào cảm thụ và là hai
kháng nguyên chủ yếu cho đáp ứng miễn dịch của cơ thể vật chủ chống lại virus, cơ
sở sản xuất vaccine phòng và chống dịch cúm A hiện nay [1], [2], [3].
- Hệ gen của virus cúm A là ribonucleic acid sợi đơn âm (negative-single
stranded RNA, viết tắt là (-)ssRNA) còn gọi là sợi đơn đối mã, nằm bên trong vỏ
capsid của hạt virus [1], [2], [7].
1.1.2. Đặc điểm cấu tạo hệ gen của virus cúm A
Bảng 1.1. Tóm tắt đặc tính cấu tạo 8 phân đoạn RNA hệ gen và chức năng các
protein của virus cúm A [10]
Gene
Độ dài
(bp)
Protein
virus
Độ dài
(aa)
Chức năng của các protein virus
PB2 2.280 PB2 759
- Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase. Liên
quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.
PB1 2.274
PB1 757
- Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase. Liên
quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.
PB1-F2 87 - 90
- Chỉ có ở một số chủng virus. Gây apoptosis tế bào
chủ, liên quan độc lực gây bệnh của virus.
PB1-N40 717
- Chưa rõ chức năng, ảnh hưởng đến chu kì nhân
lên của virus ở tế bào nuôi cấy.
PA 2.151 PA 716
- Tiểu đơn vị cấu tạo phức hợp polymerase. Liên
quan độc lực và thích nghi vật chủ của virus.
HA
Từ
1.704
đến
và nảy chồi của virus. Liên quan đến tốc độ nhân
lên của virus ở tế bào cảm thụ.
M2 97
- Kênh ion H
+
nội màng, tham gia hòa màng và quá
trình nảy chồi của virus. Liên quan tốc độ xâm
nhiễm, nhân lên và kháng Rimantadin của virus.
NS
Từ
874
đến
889
NS1 228
- Gắn và bảo vệ các RNP, ngăn cản apoptosis của tế
bào và ức chế sản xuất interleukin (INFα). Liên
quan đến độc lực virus và đáp ứng miễn dịch tự
nhiên chống virus của cơ thể vật chủ.
NS2
(NEP)
121
- Vận chuyển các RNP của virus từ nhân ra bào
tương tế bào nhiễm. Liên quan đến tốc độ nhân lên
của virus ở tế bào cảm thụ.
Ghi chú: PB2: polymerase basic protein 2; PB1: polymerase basic protein 1; PA: polymerase acidic protein;
PB1-F2: polymerase basic protein 1–frame 2; PB1-N40: polymerase basic protein 1–none 40 amino acid;
HA: hemagglutinin; NA: neuraminidase; M: matrix; M1: matrix protein 1; M2: matrix protein 2; NP:
nucleoprotein; NS: non structural protein; NS1: non structural protein 1; NS2: non structural protein 2; NEP:
nuclear export protein.
7
tương tác với thụ thể importin-α (importin-α nuclear import receptors) trên màng
8
nhân, trong quá trình vận chuyển các phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A vào nhân
tế bào nhiễm. Có 7 dạng cấu trúc (isoforms) khác nhau của thụ thể importin-α, kí
hiệu từ importin-α1 đến importin-α7, phân bố trên màng nhân tế bào cảm thụ với
virus cúm A ở các loài vật chủ. Ở tế bào cảm thụ gia cầm có thụ thể importin-α1, ở
người là các importin-α1, 3, 5 và 7, trong khi ở tế bào cảm thụ của chuột lại có sự
thiếu hụt importin-α7 [16], [18]. Khả năng tương tác giữa các vùng NLS của protein
PB2 với các dạng thụ thể importin-α, liên quan đến đặc tính thích nghi xâm nhiễm,
lây truyền của virus cúm A ở loài vật chủ mới [16], [17], [18].
- Bên cạnh đó, các vị trí amino acid đầu C-tận của protein PB2 còn tham gia
tương tác với protein NP trong phức hợp RNP của virus cúm A, làm thay đổi khả
năng tương tác giữa các vùng NLS của PB2 với thụ thể importin-α1 trên màng nhân
tế bào cảm thụ ở động vật có vú [16], [19], [20].
- Ngoài ra, vùng đầu C-tận của protein PB2 còn tương tác với vùng chuỗi nối
giữa 2 tiểu phần HA
1
và HA
2
của protein HA, liên quan đến biểu hiện độc lực gây
bệnh của virus cúm A ở các loài vật chủ [21], [22], [23].
Như vậy, các đột biến về nucleotide xảy ra trong trình tự gen PB2, có thể làm
thay đổi amino acid được mã hóa trong protein PB2, dẫn đến thay đổi hoạt tính của
phức hợp enzym polymerase liên quan đến độc lực, thích nghi lây truyền của virus
cúm A giữa các loài vật chủ.
* Gen polymerase basic protein 1 (PB1):
+ Phân đoạn PB1 có độ dài tổng số là 2.341 nucleotide chứa khung đọc mở
2.274 nucleotide, mã hóa tổng hợp protein PB1 polymerase (viết tắt là protein PB1)
gồm 757 amino acid, một đơn vị cấu tạo trong thành phần phức hợp enzym
polymerase của virus cúm A. Bên cạnh đó, khung đọc mở gen PB1 còn chứa 02
tính enzym phức hợp polymerase, liên quan đến khả năng nhân lên, biểu hiện độc
lực và thích nghi của virus cúm A ở các loài vật chủ.
+ Protein PB1-F2 có khối lượng phân tử nhỏ, biểu hiện hoạt tính khi chứa đầy
đủ từ 87 – 90 amino acid, được mã hóa bởi khung đọc mở PB1-F2 có độ dài 273
nucleotide, giới hạn từ vị trí nucleotide 95 đến 367 trên khung đọc mở gen PB1.
Protein PB1-F2 trực tiếp tham gia và là yếu tố chủ yếu biểu hiện độc lực gây bệnh
của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [9], [13], [29], [30], [31], [32].
- Protein PB1-F2 gây chết tế bào theo chương trình (apoptosis), do làm thay
đổi hình thái và mất điện thế màng ty thể, gây ngưng trệ chuyển hóa nội bào, kích
thích sự nhạy cảm với TNFα (α-tumor neucrosis factor) và khởi động quá trình
apoptosis của tế bào nhiễm. Qua đó, protein PB1-F2 tham gia điều biến đáp ứng
miễn dịch của cơ thể vật chủ với virus, gây tổn thương tế bào và mô, chủ yếu là các
tế bào biểu mô đường hô hấp và đại thực bào phế nang (alveolar macrophage) “bắt
giữ” virus, rút ngắn thời gian đào thải virus, gia tăng độc lực và mức độ trầm trọng
của bệnh học cúm A [9], [33], [34], [35].
- Trong quá trình lưu hành, nhiều chủng virus cúm A có đột biến nucleotide
trong trình tự khung đọc mở PB1, làm xuất hiện một hoặc nhiều bộ ba kết thúc
(stop codon), thường gặp ở các vị trí sau bộ ba mã hóa amino acid thứ 11 trong trình
tự khung đọc PB1-F2. Kết quả đột biến trên dẫn đến protein PB1-F2 được mã hóa
không đầy đủ (truncated), làm mất hoạt tính protein này và độc lực của virus trở nên
“ôn hòa” hơn [5], [9], [32], [36], [37]. Có khoảng 95% virus cúm A ở chim và gia
cầm, 90% ở người, 76% ở lợn và 100% ở các loài động vật có vú khác, chứa protein
PB1-F2 chứa đầy đủ 87 – 90 amino acid [9], [37], [38], [39].
- Bên cạnh đó, đột biến nucleotide làm thay đổi amino acid asparagine (N)
thành serine (S) tại vị trí 66 (N66S), dẫn đến tăng hoạt tính protein PB1-F2 và gia
tăng độc lực của virus cúm A ở cơ thể nhiễm [29], [30], [31], [32].
+ Protein PB1-N40 được Wise và cộng sự (cs.), (2009, 2011) [11], [24] phát
hiện gần đây ở chủng virus A/PuetoRico/8/34(H1N1), thiếu hụt 39 amino acid đầu
11
tiên ở vùng N-tận so với protein PB1, chiếm khoảng 5% so với lượng protein PB1
Hình 1.4. Mô hình phân bố các vùng chức năng của protein PA [42].
Sự biến đổi thành phần amino acid của protein PA, có thể làm thay đổi hoạt
tính endonuclease và khả năng liên kết của protein PA với PB1 trong phức hợp
enzym polymerase, ảnh hưởng đến tốc độ sao chép tổng hợp các RNA hệ gen trong
tế bào nhiễm và độc lực gây bệnh của virus cúm A ở gia cầm và người.
1.1.5. Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A
+ Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A cấu tạo từ 3 dưới đơn vị
protein PB2, PB1 và PA, thông qua liên kết giữa vùng N-tận của protein PB1 với
vùng C-tận của các protein PB2 và PA, sau khi được dịch mã tổng hợp trong tế bào
cảm thụ. Trong đó, dưới đơn vị protein PB1 có vai trò như khung xương liên kết với
2 protein dưới đơn vị PB2 và PA, cấu tạo và tham gia điều hòa hoạt tính của phức
hợp enzym polymerase. Phức hợp này được gắn với vùng đầu tận 3’- và 5’- của cấu
trúc xoắn α của mỗi phân đoạn RNP trong hệ gen virus cúm A, tạo thành cấu trúc
có khả năng tự sao chép trong tế bào cảm thụ (Hình 1.5) [1], [2], [43].
Hình 1.5. Mô hình cấu trúc 3D và vị trí phức hợp polymerase trong cấu trúc mỗi
phân đoạn RNP hệ gen của virus cúm A [43]
Ghi chú: A: Mô hình cấu trúc 3D của phức hợp polymerase; B: Vị trí gắn phức hợp polymerase trong cấu
trúc 1 phân đoạn RNP hệ gen virus cúm A; Các vùng cấu trúc của protein PB2, PB1 và PA được tô màu;
Màu đỏ: vùng N-tận của protein PB2; Màu xanh đậm: vùng C-tận của protein PB1; Màu xanh lá: vùng C-tận
của protein PA.
13
+ Phức hợp enzym polymerase của virus cúm A thuộc nhóm enzym RNA
polymerase phụ thuộc RNA (RNA polymerase dependant RNA, RdpR) type II,
cùng với protein NP có vai trò quyết định quá trình sao chép RNA hệ gen, RNA
thông tin tổng hợp các protein chức năng và thành phần cấu tạo hạt virus mới ở tế
bào nhiễm [1], [2], [3], [4].
- Bên cạnh đặc tính chung của các enzym là biểu hiện hoạt tính phụ thuộc vào
nhiệt độ, liên quan đến khả năng thích nghi của virus ở cơ thể loài vật chủ. Đặc tính
cơ bản của nhóm enzym RNA polymerase phụ thuộc RNA là không có cơ chế
“đọc-sửa” bản sao (proof-reading), giúp virus cúm A có khả năng đột biến cao trong
ở mỗi phân đoạn RNA hệ gen của virus cúm A, do enzym polymerase của virus
không có khả năng “đọc-sửa” bản sao RNA, trong quá trình phiên mã và sao chép
RNA hệ gen virus ở nhân tế bào nhiễm.
- Các enzym sao chép phụ thuộc RNA có thể gài thêm, hoặc làm mất đi hay
thay thế một hoặc nhiều nucleotide mà không được sửa chữa trong trình tự RNA
phân đoạn gen mới của virus (Hình 1.7) [6], [46].
- Đột biến điểm xảy ra thường xuyên, liên tục ở tất cả các phân đoạn trong hệ
gen virus cúm A, với tần suất xuất hiện khoảng 1/10.000 nucleotide (tương ứng với
độ dài hệ gen virus) trong một chu kì sao chép hệ gen của virus. Hầu như mỗi hạt
virus cúm A mới được hình thành đều chứa đựng một đột biến điểm trong hệ gen
của nó và được tích lũy qua nhiều thế hệ, làm xuất hiện biến chủng virus mới thay
đổi đặc tính di truyền so với chủng virus ban đầu [2], [46], [47].
Copyright: Tài liệu đại học ©