1
LỜI CẢM ƠN
Con xin cám ơn bố mẹ và những người thân yêu trong gia đình đã luôn bên con.
Tôi xin chân thành cảm ơn quí thầy cô Viện CNSH& MT trường Đại học
Nha Trang đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu trong những năm qua.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Công ty cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp
đỡ tôi hoàn thành đề tài.
Tôi xin cảm ơn Ths. Nguyễn Thị Hải Thanh - Viện CNSH&MT Đại học Nha
Trang, anh Nguyễn Trọng Hiếu công ty CPCN Việt Á, đã hướng dẫn tôi tận tình
trong quá trình thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới các anh chị phòng R&D và phòng Dịch vụ công ty
cổ phần công nghệ Việt Á đã giúp đỡ tôi về mặt tài liệu và thực nghiệm để tôi có
thể hoàn thành tốt đề tài.
Ngoài ra, tôi cũng xin được cảm ơn tất cả những người đã chia sẻ và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Sinh viên thực hiện Nguyễn Thành Trang
2
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN 1
2.1.2. Mẫu thí nghiệm 27
2.1.3. Mồi cho phản ứng 27
2.1.4. Hóa chất tách chiết RNA 28
2.1.5. Hóa chất cho phản ứng RT 28
2.1.6. Hóa chất cho phản ứng PCR 28
2.1.7. Hóa chất cho điện di 28
2.1.8. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 29
2.2. PHUƠNG PHÁP 30
2.2.1. Chuẩn bị mẫu 30
2.2.2. Tách chiết RNA 30
2.2.2.1. Nguyên tắc 30
2.2.2.2. Tiến hành 30
2.2.3. Phản ứng RT 31
2.2.3.1. Nguyên tắc 31
2.2.3.2. Tiến hành 31
2.2.4. Khuếch đại bằng phản ứng PCR 31
2.2.4.1. Nguyên tắc 31
2.2.4.2. Tiến hành 32
1. Thành phần phản ứng PCR 32
2.2.5. Điện di trên gel agarose 32
2.2.5.1. Nguyên tắc 32 4
2.2.5.2. Tiến hành 32
1. Chuẩn bị dung dịch nạp mẫu 32
2.2.6. Phương pháp đánh giá mồi trên lý thuyết 33
2.2.6.1. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi 33
2.2.6.2. Phương pháp đánh giá mồi. 33
2.2.7. Phương pháp xác định nhiệt độ lai tối ưu của mồi. 33
DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1: Tế bào mang tôm bị nhiễm virus YHV 14
Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV. 15
Hình 3: Hội chứng Taura 16
Hình 4: Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR 22
Hình 5 : Các dạng cấu trúc self-dimer của các mồi 36
Hình 6: Các dạng cấu trúc hetrodimer của các mồi 38
Hình 7: Khảo sát mồi YHVf trên BLAST 39
Hình 8: Khảo sát độ dặc hiệu của mồi YHVr 40
Hình 9: Khảo sát độ dặc hiệu trên BLAST của GAVf 40
Hinh 10: Khảo sát độ đặc hiệu của mồi GAVr trên BLAST 41
Hình 11: Khảo sát dộ đặc hiệu của mồi TSVf trên BLAST 41
Hình 12: Khảo sát độ đặc hiệu của TSVr trên BLAST 42
Hình 13: Kết quả sắp gióng mồi YHVf 42
Hình 14: Kết quả sắp gióng của mồi YHVr 43
Hình 15: Kết quả sắp gióng mồi GAVf 43
Hình 16: Kết quả sắp gióng của mồi GAVr 44
Hình 17: Kết quả sắp gióng của mồi TSVf 44
Hình 18: Kết quả sắp gióng của mồi TSVr 45
Hình 19: Kết quả khảo sát sự hoạt động của hệ Primer 46
Hình 20: Kết quả khảo sát tỉ lệ mồi 48
Hình 21: Khảo sát nhiệt độ lai 49
Hình 22 : Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của 3 cặp mồi 50 7
Hình 23: Kết quả khảo sát độ nhạy cho 3 cặp mồi 51
Hình 24 : Kết quả ứng dụng qui trên mẫu tôm nghi ngờ mắc bệnh 53
nghề nuôi trồng thủy sản ven bờ trong những năm gần đây phát triển mạnh là một
thực tế khách quan và là nhu cầu cần thiết. Ở nước ta, mặc dù nghề nuôi tôm mới
thực sự phát triển từ năm 1988 nhưng do lợi nhuận cao và do sự ưu đãi của thiên
nhiên, nghề nuôi tôm phát triển khá nhanh ở một số tỉnh ven biển miền Trung và
các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, nhất là các tỉnh Long An, Tiền Giang, Bến Tre,
Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng… Diện tích nuôi tôm ngày càng được mở rộng với
khoảng 260.000 ha với nhiều hình thức nuôi khác nhau. Khoa học kỹ thuật đã được
áp dụng rộng rãi nhằm đáp ứng nhu cầu về con giống, nuôi tôm tăng sản…với mục
tiêu đạt sản lượng cao nhất trong thời gian ngắn nhất. Khi phát triển các hình thức
nuôi tôm công nghiệp thì tôm được nuôi với mật độ cao. Do đó nếu kỹ thuật nuôi
chưa được đảm bảo. Hơn nữa việc áp dụng khoa học kỹ thuật trong các công đoạn
nuôi chưa được đồng bộ thì vấn đề ô nhiễm môi trường nước, phá vỡ môi trường
sinh thái, bùng nổ dịch bệnh…là một thực tế không thể tránh khỏi và đã gây ra
nhiều thiệt hại lớn cho người nuôi và cho nền kinh tế. Dịch bệnh vào cuối năm 1993
đầu 1994 lan rộng khắp các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long, gây thiệt hại gần 294 tỷ
đồng (Nguyễn Việt Thắng, 1994 và Bùi Quang Tề, 1995) là một minh chứng cụ thể.
Nghề nuôi tôm hiện đang phải đương đầu với nhiều loại bệnh xuất hiện trong
quá trình nuôi tôm, nhất là bệnh do virus gây ra như virus gây hội chứng Taura
(Taura syndrome virus -TSV), virus gây bệnh đầu vàng (yellow head virus - YHV)
và virus gây bệnh mang (gillassociated virus - GAV). Đặc trưng của bệnh là tỷ lệ
chết cao và chết hàng loạt trong một thời gian rất ngắn trên các ao nuôi. Hiện nay,
ba loại virus này đang gây nhiều trở ngại cho ngành nuôi tôm và gây thiệt hại lớn
trong nuôi trồng thủy sản vì chưa có biện pháp chữa trị đặc hiệu. Do đó, ngoài biện
pháp kỹ thuật nuôi tốt, còn phải có phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả nhằm
giám sát ba mầm bệnh này từ lúc thả giống cho đến khi thu hoạch, phát hiện kịp
thời tôm bị nhiễm bệnh để có biện pháp xử lý thích hợp. Việc ứng dụng các phương 10
pháp sinh học phân tử trong đó có phương pháp multiplex RT-PCR để chẩn đoán
hại 50% tổng sản lượng. Đài Loan năm 1987 với đỉnh cao sản xuất 45.000 tấn tôm
sú nuôi, năm liền sau đó sản lượng giảm xuống còn 30.000 tấn do tôm bị dịch bệnh.
Indonesia cũng đang bị thiệt hại nặng do môi trường xấu và do dịch bệnh. Trong
quý ba năm 1994, sản lượng tôm xuất khẩu của Indonesia sang Hoa Kỳ giảm 38%.
Thái Lan năm 1990, thiệt hại hơn 20.000 ha nuôi thâm canh tôm sú vì nước bị ô
nhiễm bởi chất thải công nghiệp và bị bệnh. Năm 1994, tôm nuôi ở Thái Lan bị chết
gần 30.000 ha, mức thiệt hại lên đến 40 triệu USD [Nguyễn Mạnh Hùng, 1994].
Bệnh đầu vàng gây chết tôm sú nuôi ở miền Trung và miền nam Thái lan,
đặc biệt nguy hiểm cho các vùng nuôi thâm canh [Boonyaratpalin và CTV, 1992].
Virus đầu vàng có thể liên quan đến đợt dịch bệnh của tôm sú nuôi ở Đài loan năm
1987-1988. Những nơi khác thuộc Đông Nam Á như: Indonesia, Malaysia, Trung
quốc, Philippine gặp ít nhưng nguy hiểm cho tôm sú nuôi [Linhtner, 1996]. Với khả
năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh hưởng không nhỏ đến nền kinh tế
của những quốc gia có nghề nuôi tôm phát triển.
Bệnh do Taura syndrome virus (TSV) gây chết trên tôm thẻ chân trắng được
phát hiện lần đầu tiên ở khu vực cửa sông Taura tỉnh Guayas, Ecuador, do nhà khoa
học Jimenez công bố, sau đó lây lan khắp lãnh thổ nước này. Nạn nhân tiếp theo
của dịch bệnh này là các nước Peru, Columbia, Honduras, Guatemala, El Salvador,
vùng đông bắc Brazil, Nicaragua, Mexico và các bang ở miền bắc nước Mỹ cùng
với quần đảo Hawaii… gây nên đại dịch đã làm thiệt hại nặng về kịnh tế: năm 12
1993-1994 Châu Mỹ thiệt hại 132.000 tấn, năm 1998-1999 có đến 90% ao nuôi tôm
thẻ chân trắng ở Đài Loan bị nhiễm bệnh khi nhập giống từ Ecuador.
Virus GAV được phát hiện ở Úc liên quan đến phức hợp bệnh đầu vàng.
Virus tồn tại cục bộ trong quần thể tôm sú ở Queensland - Úc, Malaysia và Thái
Lan Lây nhiễm tự nhiên với GAV chỉ được tìm thấy ở tôm Penaeus monodon,
nhưng lây nhiễm thực nghiệm đã gây ra tử vong ở tôm P. esculentus, P.merguiensis
và P.japonicus. Với tôm P.japonicus tính kháng bệnh có liên quan đến tuổi và kích
đường kính gần 15 nm, chiều dài có thể tới 800 nm. Cấu trúc nhân là ARN, kích
thước 26.662bp và mã hóa cho 4 tiểu phần protein cấu trúc 170, 135, 67 và 22 kDa.
Hiện nay virus YHV cùng với GAV được coi là thành viên của loài Gill-associated
virus, giống Okavirus, họ Roniviridae trong bộ Nidovirales [Walker và CTV, 2005]
Bộ gen bao gồm bốn khung đọc mở dài (ORFs). ORF1a và ORF1b mã hóa
protein phi cấu trúc là các polyproteins (pp1a và pp1ab). ORF1b là một phần mở
rộng của ORF1a thông qua một frameshift ribosome. ORF2 mã hóa protein
nucleocapsid (P20). ORF3 mã hóa lớp vỏ glycoprotein.
Sử dụng những phương pháp phát hiện gene trên đối tượng là tôm Penaeus
monodon đã tìm ra 6 genenotyp của YHV. Sử dụng mồi kiểm tra giới hạn và mục
tiêu là vùng gene ORF1b đã xác định được trình tự gen được bảo tồn cao trong số
57 chủng trong sáu kiểu gen phát hiện ở P. monodon nguồn gốc từ các vùng khác
nhau của Ấn Độ-Thái Bình Dương [5].
1.2.1.2. Cách thức lan truyền
Bệnh đầu vàng lây truyền theo đường nằm ngang, virus từ tôm nhiễm bệnh
bài tiết ra môi trường hoặc từ một số tôm tự nhiên nhiễm bệnh sẽ lây truyền cho các
tôm trong ao nuôi. Có thể một số loài chim nước đã ăn tôm bị bệnh đầu vàng từ ao
khác và bay đến ao nuôi và mang theo mầm bệnh.
14
1.2.1.3. Dấu hiệu bệnh lý
Theo báo cáo của các nhà khoa học, từ năm 2001 đến nay phát hiện thấy tôm
bị bệnh vàng đầu có độ tuổi từ 25 ngày đến 70 ngày. Nếu là tôm nhỏ từ 25-35 ngày
thì nhiễm bệnh càng nặng và sẽ chết toàn bộ trong vòng 2-3 ngày. Bệnh gây hại chủ
yếu trên tôm sú.
Biểu hiện đầu tiên tôm phát triển rất nhanh và ăn nhiều hơn mức bình
thường. Tôm đột ngột dừng ăn, sau một hai ngày tôm dạt vào gần bờ và chết.
tự motif của các protein phi cấu trúc như helicase (NTP-binding protein), protease
và RNA polymerase phụ thuộc RNA. ORF2 có chứa trình tự cho các protein cấu
trúc của TSV, trong đó có 3 protein capsid chính là VP1 tới VP3 ( tương ứng có
khối lượng 55, 40, 24 kDa) và một protein phụ là VP0 (58 kDa). Để phát hiện hội
chứng Taura trên tôm người ta thường nghiên cứu trên gene protein capsid hoặc protein áo
(coat protein) nằm trong gene protein capsid (vùng gene VP1) [4].
Hình 2: Biểu đồ tổ chức của bộ gen TSV.
Số: chỉ vị trí nucleotide. ORFs 1 và 2 được hiển thị như là các hộp mở. ORF1 chứa
gene qui định trình tự của các protein phi cấu trúc như Bir, helicase (H), protease (P)
và RNA phụ thuộc RNA polymerase (RdRp). ORF2 qui định trình tự của các protein
cấu trúc VP1, VP2, VP3. Mũi tên đại diện cho đầu cuối N của protein capsid.
16
1.2.2.2. Cách thức lan truyền
Bệnh TSV có thể lan truyền theo chiều ngang hoặc chiều thẳng đứng. Sự lan
truyền theo đường ngang là do tập tính ăn thịt lẫn nhau của tôm hoặc do nguồn
nước bị nhiễm. Ấu trùng tôm giống ở giai đoạn sớm có thể nhiễm virus nếu bố mẹ
mang mầm bệnh (lây lan theo chiều thẳng đứng).
1.2.2.3. Dấu hiệu bệnh lý
Virus này xuất phát từ trong tế bào chất và sau đó lây sang các biểu mô và
biểu bì con bệnh. Bệnh gây hại trên tôm thẻ ngay trong giai đoạn trưởng thành,
trọng lượng phổ biến từ 0,1-0,5 gram từ 2-4 tuần tuổi. Đây được xác định là loại
virus cực kỳ nguy hiểm, thời gian ủ bệnh dài và khả năng chết lên tới 95%. Bệnh
kéo dài cho tới giai đoạn tôm lột xác và có khả năng cấp tính làm cho tôm èo uột,
mềm vỏ, phá huỷ hệ tiêu hoá và khuếch tán, lan truyền rất nhanh. Tôm sống sót giai
đoạn cấp tính đi qua một giai đoạn chuyển tiếp vào giai đoạn mãn tính. Trong giai
hoặc từ bố hoặc từ mẹ hoặc cả hai nhưng không rõ là sự lây nhiễm có ở trong trứng
hay không.
1.2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý
Tôm bị nhiễm GAV cấp tính có biểu hiện lờ đờ, kém ăn, bơi lâu trên mặt
nước hoặc quanh bờ ao. Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt ở các phần phụ
bộ, cánh đuôi và phần miệng; mang biến sang vàng-hồng, còn quan sát thấy giun
hình ống và con hà bám trên mang bẩn. Những biểu hiện chung của nhiễm GAV
cấp tính luôn thay đổi và không phải luôn nhận thấy được, vì thế chúng không đáng 18
tin cậy ngay cả chẩn đoán sơ bộ. Bệnh có thể gây chết 80-90%, hoặc giảm chất
lượng thương phẩm.[Bệnh học thủy sản, 2005].
1.3. Các phƣơng pháp phát hiện bệnh
1.3.1. Phương pháp mô bệnh học
Dựa vào biểu hiện trên các cơ quan của tôm để có thể đánh giá mức độ bệnh
và chủng gây bệnh.Có thể dùng để chuẩn đoán các bệnh do YHV, GAV, TSV gây
ra bằng các biểu hiện mô biểu bì, mang, gan có những dấu hiệu đặc trưng cho từng
loại bệnh. Như:
- Khi tôm nhiễm bệnh đầu vàng, kiểm tra tiêu bản máu thấy có dấu hiệu bất
thường: Nhân tế bào hồng cầu thoái hoá, kết đặc lại hoặc bị phá huỷ phân mảnh.
Mang và gan tuỵ có màu vàng nhạt, toàn thân có màu nhợt nhạt. Cố định tôm nghi
bị bệnh đầu vàng sắp chết trong dung dịch Davidson và xử lý cho nhuộm màu
chuẩn H&E. Hầu hết các mô nõi có huyết tương đều có thể bị nhiễm bệnh, tuy
nhiên những vị trí quan trọng như cơ quan bạch huyết, các tế bào gan tụy trung gian
(không phải các tế bào biểu mô ống), tim, cơ và các mô liên kết (không phải các tế
bào biểu mô), các mô biểu bì dạ dày và mô mang . Bằng kính hiển vi quang học có
thể xác định được một lượng lớn thể vùi tế bào chất hình cầu có đường kính khoảng
2mm (nhỏ hơn đối với mô trung bì và ngoại bì) bắt màu thuốc nhuộm kiềm và khá
đồng màu.
- Trong chẩn đoán bệnh do GAV gây ra ta sẽ chú ý tới những biểu hiện mô
học sau: Thân tôm biến thành màu đỏ sẫm, đặc biệt ở các phần phụ bộ,cánh đuôi và
phần miệng; mang biến sang vàng-hồng. Tách giáp đầu ngực của tôm nhiễm bệnh
ra khỏi phần bụng và tách ra theo chiều dọc. Sau đó đem cố định mẫu bằng dung
dịch Davidson và xử lý dùng cho mô học. Nhuộm các lát cắt bằng H&E. Các cơ
quan bạch huyết của tôm bệnh bị mất cấu trúc dạng tiểu quản thông thường. Tại
những nơi bị phá vỡ, không có nhân hoặc tế bào rõ ràng với nhân phình to, ngưng
kết hoặc tạo ra không bào. Foci của các tế bào không bình thường thấy ở trong các
cơ quan bạch huyết và chúng bắt màu Eosin sẫm. Các mang của tôm bệnh có biểu
hiện hư hại về cấu trúc như gắn kết các đầu tơ mang, hoại tử toàn bộ và mất lớp 20
biểu bì của các lá mang sơ cấp và thứ cấp. Cấu trúc tế bào của mang biểu hiện bình
thường tách biệt với foci nhỏ bắt màu kiềm của các tế bào hoại tử.
1.3.2. Phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization)
Lai tại chỗ là một kiểu lai phân tử, trong đó trình tự nucleic acid cần tìm
(trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô. Lai tại chỗ cho phép nghiên cứu
nucleic acid mà không cần qua giai đoạn tách chiết chúng ra khỏi mô, tế bào.
Phương pháp này được sủ dụng để phát hiện RNA của virus YHV, GAV và
TSV sử dụng tế bào và mô của ký chủ. Vì vậy phải trải qua một loạt các thao tác xử
lý mô (như cố định, khử nước, tẩm paraffin cắt thành những lát mỏng (7-10µ) trải
trên lam kính). Đọc kết quả trực tiếp trên lam kính chứa mẫu mô. Phương pháp lai
acid nucleic giúp hiểu chi tiết hơn về bộ gen, nó là cơ sở của phương pháp chẩn
đoán mới dùng acid nucleic đang sử dụng rộng rãi.
1.3.3. Phương pháp sinh học phân tử
Phương pháp sinh học phân tử tuy là một phương pháp mới nhưng đã thể
hiện độ vượt trội về độ nhạy và tính chính xác trong việc phát hiện các bệnh do
virus YHV, TSV, GAV gây ra so với các phương pháp khác. Đặc biệt là phương
pháp PCR thể hiện sự vượt trội trong chẩn đoán các loại bệnh.
C trong vòng 30 giây – 1 phút, làm cho
phân tử DNA mạch kép tách thành hai mạch đơn, chính hai mạch đơn này đóng vai
trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới. Đây là giai đoạn biến
tính (denaturation).
Bước 2: Trong bước này, nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn nhiệt độ nóng
chảy của các primer), cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực
nghiệm, nhiệt độ này tùy thuộc vào T
m
của các primer sử dụng, dao động từ 40 –
70
0
C, kéo dài từ 30 giây đến 1 phút. Đây là giai đoạn lai (hybridization).
Bước 3: Tổng hợp mạch DNA mới nhờ sự hoạt động của DNA
polymerase, nhiệt độ được tăng lên đến 72
0
C, là nhiệt độ tối ưu cho Taq DNA
polymerase hoạt động. Thời gian tổng hợp tùy thuộc độ dài của trình tự DNA cần
khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Đây là giai đoạn tổng hợp,
hay kéo dài (elongation). 22
Mỗi chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp đi lặp lại nhiều lần, và mỗi lần
lại làm tăng gấp đôi số lượng mẫu của lần trước. Đây là sự khuếch đại theo cấp số
nhân. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = m
*
2
n
. Trong đó:
Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
- Bắt cặp đặc hiệu với trình tự nucleotide mục tiêu.
- Bắt cặp đặc hiệu với ít nhất 70% chiều dài primer.
- 5 nucleotide đầu tiên của primer bắt cặp hoàn toàn với trình tự nucleotide mục tiêu.
- Thành phần GC lý tưởng của đoạn primer nằm trong khoảng 40 – 60% để
nhiệt độ bắt cặp của primer là không quá thấp.
- Tránh lặp lại các cặp GC nhiều lần, dễ tạo ra các khuếch đại ký sinh do bắt
cặp với các trình tự khác, dẫn đến việc tổng hợp không chính xác.
- Thành phần nucleotide của primer phải cân bằng. 24
- Nhiệt độ nóng chảy của 2 primer không nên cách nhau quá xa, vì nếu sự
chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, hoặc
primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA.
- Tránh sự tạo thành các cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung giữa các
phần khác nhau của một primer.
- Thành phần 5 nucleotide cuối cùng trong đầu 3’ không nên có hơn hai G
hoặc C nhằm tránh hiện tượng nhân bản ký sinh trong phản ứng PCR.
- Trình tự nằm giữa 2 primer “xuôi” và “ngược” không quá lớn; phản ứng
PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1kb.
Nồng độ primer sử dụng trong phản ứng PCR phải được tính toán và tối ưu
qua thực nghiệm . Nếu nồng độ primer quá cao sẽ dễ gây khuếch đại “ký sinh”, còn
nếu nồng độ primer quá thấp sẽ làm hiệu quả khuếch đại của phản ứng không cao.
Thông thường nồng độ primer sử dụng nằm trong giới hạn từ 0.1 – 1.0 µM.
3. Nồng độ dNTPs (các deoxynucleotide triphotphat)
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20 – 200 µM/ mỗi
loại nucleotide. Nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”, làm giảm
hiệu quả của phản ứng PCR, còn sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide
lại làm tăng lỗi sao chép của DNA polymerase.
2
sử dụng cần được tối ưu hóa cho từng hệ thống
PCR cụ thể. Thông thường, MgCl
2
được sử dụng ở nồng độ từ 1.5 mM – 4 mM.
6. Dung dịch đệm (PCR buffer)
Dung dịch đệm có tác dụng cung cấp lực ion (inonic strength) cần thiết cho
phản ứng xảy ra, tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR. Nồng độ, pH của dung
dịch đệm cũng như nồng độ KCl tối ưu thường tùy thuộc vào nguồn DNA
polymerase sử dụng, không có một quy luật chung cho vấn đề này.
7. Các chất tăng cường
Trong phản ứng PCR, ngoài những thành phần cơ bản, đôi khi người ta còn
bổ sung thêm chất tăng cường với mong muốn phản ứng xảy ra hiệu quả hơn. Các
chất thường được sử dụng là betaine, DMSO (dimethylsulfoxide), glycerol… Tuy
nhiên cần thận trọng khi sử dụng các những chất này bởi vì nếu sử dụng ở nồng độ
không thích hợp thì những chất này sẽ gây ức chế phản ứng PCR.
8. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
Thực chất một thiết bị dùng để tiến hành phản ứng PCR chỉ cần đáp ứng
được yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác. Các thiết bị hiện nay đã
được cải tiến để tránh tối đa sự bốc hơi nước trong quá trình phản ứng, hay cho
phép tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào… Tuy nhiên, mỗi kiểu thiết bị có đặc
Copyright: Tài liệu đại học ©