TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN TRẦN VIẾT TOÀN

PHÁT TRIỂN QUY TRÌNH mPCR PHÁT HIỆN MBV
( Monodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome virus)
VÀ GEN BETA-ACTIN TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGHÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
BÙI THỊ BÍCH HẰNG 2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
i
LỜI CẢM TẠ
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với cô Bùi Thị Bích Hằng đã tận tâm
hướng dẫn, chỉ bảo, cung cấp tài liệu cũng như những kinh nghiệm giúp tôi
hoàn thành được đề tài.
Tôi xin chân thành cám ơn toàn thể quý thầy cô, anh chị Bộ môn Sinh Học và
Bệnh Thủy Sản – Khoa Thủy Sản, Trường Đại Học Cần Thơ đã giúp đỡ và tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành tốt đề tài luận văn tốt nghiệp.
Chân thành cám ơn các bạn lớp Bệnh học thủy sản K31 đã động viên và ủng
hộ tôi thực hiện được đề tài này.

hiện MBV và WSSV kết quả cho thấy hiện vạch 1441bp (WSSV) ở bước 1,
hiện đồng thời hai vạch 941bp (WSSV) và 361bp (MBV) ở bước 2. Thực hiện
tiếp quy trình phát hiện MBV, WSSV và gen β-actin nhưng kết quả ở hai bước
chỉ hiện vạch của WSSV (1441bp, 941bp). PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iii
MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ i
TÓM TẮT ii
MỤC LỤC iii

3.2. Dụng cụ và hóa chất 19
3.3. Phương pháp nghiên cứu 20
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu 20
3.3.2. Ly trích DNA 20
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
iv
3.3.3. Đo hàm lượng DNA 21
3.3.4. Quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 21
3.3.5. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 22
3.3.6. Phương pháp mPCR phát hiện MBV và WSSV 23
3.3.7. Phương pháp mPCR phát hiện MBV, WSSV và gen β –
actin 25
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26
4.1. Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al.,2006) 27
4.2. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và gen β – actin 29
4.3. Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 31
4.4. Thực hiện quy trình mPCR phát hiệnMBV,WSSVvà β–actin 34
4.5.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và β –actin 36
4.6.Ứng dụng quy trình mPCR phát hiện MBV và WSSV 39
CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 40
5.1. Kết luận 40
5.2.Đề xuất 41
Bảng 4.13. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 1) 31
Bảng 4.14. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) 31
Bảng 4.15. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV (bước 2) đã được điều chỉnh. 33
Bảng 4.16. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 1) . 35
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
vi
Bảng 4 .17. Thành phần hóa chất tham gia vào phản ứng khuếch đại của quy
trình mPCR phát hiện MBV, WSSV và β – actin (bước 2) . 35

Hình 4.11. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 32
Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV sao khi
chuẩn hóa 34
Hình 4.13. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV, WSSV và β –
actin 36
Hình 4.14. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 37
Hình 4.15. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và β – actin 38
Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm mPCR phát hiện MBV và WSSV 39

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 1 -

CHƯƠNG I
GIỚI THIỆU
Việt Nam có diện tích mặt nước lớn, kể cả nước ngọt, lợ và mặn, đây là
một lợi thế cho việc phát triển nuôi trồng thủy sản và cũng là một trong những
lý do dẫn tới sự thành công của ngành trong thời gian qua. Việt Nam đã trở
thành nước nuôi trồng thủy sản lớn thứ 3 và là một trong 10 nước xuất khẩu
thủy sản lớn nhất thế giới. Theo bộ thủy sản 2006, sản lượng thủy sản nuôi
trồng của Việt Nam đạt 1,67 triệu tấn với giá trị xuất khẩu đạt 1,7 tỷ USD,
tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản toàn ngành đạt 3,35 tỷ USD. Đồng bằng
Sông Cửu Long có diện tích tự nhiên khoảng 39.747 km
2
, chiếm 12% diện
tích cả nước. Trên thực tế, nuôi trồng thủy sản (NTTS) ở ĐBSCL đã trở thành
một nghề truyền thống và không ngừng thay đổi. Theo tính toán, tổng diện
tích có khả năng NTTS ở ĐBSCL hơn 1.200.000 ha, bằng gần 60% của cả
nước. Trong đó, diện tích có khả năng NTTS vùng triều khoảng 750.300 ha,
chiếm trên 26% tổng diện tích đất tự nhiên của 8 tỉnh ven biển của vùng và
chiếm 74% tổng diện tích có khả năng NTTS trên vùng triều toàn quốc. Năm

đồng thời MBV (M onodon baculovirus), WSSV (White spot syndrome
virus) và gen beta – actin của tôm sú (Penaeus monodon)” được thực hiện.
Mục tiêu của đề tài
Phát triển và ứng dụng quy trình mPCR phát hiện đồng thời MBV, WSSV trên
tôm sú (Penaeus monodon) và kiểm soát kết quả âm tính giả.
Nội dung đề tài
Thực hiện quy trình PCR phát hiện MBV (Karlo et al., 2006)
Thực hiện quy trình mPCR phát hiện MBV và nội chuẩn β – actin
Thực hiện quy trình mPCR phát hiện WSSV, MBV và nội chuẩn β – actin

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 3 -

CHƯƠNG II
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU


114
Ecuador 96 98 119 66 108
Philippine 90 76 40 34 40

Tôm sú đã được nuôi ở rất nhiều quốc gia trên thế giới, tính đến nay có hơn 65
nước và vùng lãnh thổ đang tiến hành nuôi, tập trung ở hai khu vực chính là
Châu Á Thái Bình Dương chiếm 72% và Mỹ La Tinh chiếm 28% tổng sản
lượng tôm nuôi. (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 4 -

Hình 2.1: Sản lượng tôm sú thế giới năm 2001 (Bộ Thủy Sản số 4 năm 2003)
2.1.2. Tình hình nuôi tôm ở Việt Nam
Bờ biển Việt Nam trãi dài 3.260 km suốt từ Bắc vào Nam là tiềm năng to lớn
cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ. Diện tích nuôi tôm gia tăng
nhanh chóng từ 250.000ha năm 2000 lên đến 959.000 ha năm 2005 (Tạp chí
thủy sản, 2006). Tính đến hết năm 2005 cả nước có 4.281 trại giống sản xuất
được 28,8 tỷ con tôm giống tăng 151,64% so với năm 2000. Theo số liệu hiện
có, Việt Nam là nước có diện tích nuôi tôm vào loại lớn trên thế giới, vượt xa
Indonesia, nước có diện tích nuôi tôm lớn nhất vào năm 1996, khoảng 360.000
ha. Phần lớn diện tích nuôi tôm ở Việt Nam tập trung ở ĐBSCL, rải rác dọc
các cửa sông, kênh, rạch ven biển miền Trung và ở đồng bằng sông Hồng,
sông Thái Bình ở miền Bắc ( 276

Quốc gia
Sản lượng (tấn)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 5 -

Hình 2.2: Sản lượng tôm nuôi tính theo khu vực. (Nguồn: tổng cục thống kê,
2008 )
Các loài tôm nuôi chính ở Việt Nam gồm tôm sú (P. monodon), tôm he (P.
merguiensis), tôm nương (P. orientalis), tôm đất/rảo (metapenaeus ensis),
trong đó tôm sú là loài nuôi chủ đạo, đóng góp sản lượng cao nhất. Việt Nam
tồn tại 3 hình thức nuôi tôm là quãng canh (cải tiến), bán thâm canh và nuôi
thâm canh.
Bảng 2.2: Tình hình nuôi tôm sú ở VN qua một số năm (Bộ Thủy Sản số 4
năm 2003)
Năm Diện Tích (ha) Sản lượng ( 1000
tấn)
Năng
Suất(kg/ha/năm)
1995 260.000 53 200
1996 200.000 58 290
1997 195.000 105 538
1998 265.000 115 433
1999 295.000 128 433
2000

326.407

105

487

2
0
0
3
2
0
0
4
2
0
0
5
2
0
0
6
2
0
0
7
Năm
Sản Lượng (tấn)
Đồng bằng sông Hồng
Đông Bắc
Tây Bắc
Bắc Trung Bộ
Duyên hải Nam Trung
Bộ
Tây Nguyên
Đông Nam Bộ

tôm ở Ấn Độ cũng bị thiệt hại đến 95% do dịch bệnh đốm trắng gây ra. Sự
thiệt hại do bệnh đốm trắng gây ra rất nghiêm trọng, nhiều trại tôm bị thiệt hại
đến 60% hoặc mất trắng (Thông tin KH & CNTS, số 10/2001). Ở Thái Lan
bệnh WSSV làm giảm sản lượng tôm nuôi từ 225.000 tấn năm1995 xuống
160.000 tấn năm 1996 làm thiệt hại trên dưới 500 triệu USD. Ở các nước châu
Á bệnh gây thiệt hại khoảng 3 tỷ USD mỗi năm (Nguyễn Văn Hảo, 2003)
Theo Chanratchakool et all. (1999). YHV là virus gây thảm khốc và làm suy
giảm nền kinh tế châu Á. Bệnh được phát hiện đầu tiên ở Thái Lan vào năm
1990. Làm thất thoát hơn 30,6 triệu USD năm 1992 và 650 triệu USD vào năm
1994. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 7 -

2.2.2.Tình hình bệnh tôm ở Việt Nam
Ở Việt Nam ngay từ những năm đầu thập niên 90, cùng với sự phát triển của
nghề nuôi tôm công nghiệp thì dịch bệnh bắt đầu xuất hiện. Từ năm 1993 –
1995 dịch bệnh tôm đã báo động trên toàn quốc, làm thiệt hại hàng ngàn tỷ
đồng. Trong năm 1994 tổng diện tích nuôi tôm có dịch bệnh là 84.558 ha với
sản lượng thiệt hại ước tính là 5.225 tấn (Bộ thủy sản, 1995). Theo Nguyễn
Văn Hảo (2003) đợt dịch bệnh thứ nhất năm 2001 xảy ra vào tháng 2 và tháng
3 rộng khắp trên tôm nuôi ở các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Tiềng
Giang, riêng ở Bạc Liêu thiệt hại khoảng 10.212 ha. Dịch bệnh đợt hai xảy ra
vào tháng 7 cùng năm cũng làm tỉnh thiệt hại 47.333 ha
Theo điều tra của Nguyễn Văn Hậu năm 2006 thì tôm giống tới tay người nuôi
ở Đồng bằng sông Cửu Long có tới 23% tôm giống bị nhiễm WSSV và 43,8%
nhiễm MBV. Tính đến 9/2003, cả nước có 546.757 ha nuôi tôm nước lợ
thương phẩm, trong đó diện tích có tôm nuôi bị bệnh và chết là 30.083 ha. Các
tỉnh, thành ven biển từ Đà Nẵng đến Kiên Giang có tới 29.200 ha nuôi tôm bị

sú (Penaeus monodon) tại Đài Loan. Năm 1989 ở Thái Lan tìm thấy một số
lượng lớn thể ẩn polyhedral của MBV trong cơ quan gan tụy của postlarvae ở
tôm sú (đây là loài tôm nuôi chủ yếu ở Thái Lan và các nước châu Á). MBV
hiện diện phổ biến ở các Châu lục, gây bệnh cho tôm nuôi và tôm tự nhiên.
Virus gây tỷ lệ chết cao cho ấu trùng và ít nghiêm trọng hơn đối với tôm
trưởng thành. Tuy nhiên khả năng gây bệnh của MBV còn tùy thuộc vào độc
lực của từng chủng virus ở từng vùng địa lý khác nhau. (Bùi Quang Tề và ctv,
2004)
2.3.1 Tác nhân gây bệnh.
Tác nhân gây bệnh MBV (Monodon Baculovirus) là virus type A Baculovirus
monodon, cấu trúc nhân là ADN, có lớp vỏ bao, dạng hình que. Theo Mari
(1993) thì chủng MBV của tôm sú từ Ấn Độ Thái Bình Dương có kích thước
nhân 42 ± 3 x 246 ± 15 nm, kích thước vỏ bao 75 ± 4 x 324 ± 33 nm.
Virus cảm nhiễm trên nhân gan tụy và nhân của biểu mô ruột giữa. Sự lây
nhiễm bệnh MBV còn xảy ra trong cơ quan bạch huyết. (Bondad-Reantaso,
M.G et al., 2001)
2.3.2. Vật chủ cảm nhiễm
MBV có thể nhiễm ở nhiều loài tôm he khác nhau: Penaeus monodon, P.
merguiensis, P. semisulcatus, P. kerathurus, P. plebejus, P. indicus, P.
penicillatus, P. esculentus, P. Vannamei. Trong đó, tôm sú (P. monodon)
thường bị nhiễm nặng và phổ biến nhất. (K.K. Vijayan et al., 1995)
2.3.3. Dấu hiệu bệnh lý
Đối với tôm Postlarvae khi nhiễm nhẹ không có dấu hiệu rõ ràng, khi nhiễm
nặng thể hiện một số dấu hiệu như: yếu, bơi lội lờ đờ, cơ thể đổi màu xanh lơ
hay xanh đen, chuyển giai đoạn chậm không đều. Tỷ lệ chết tích lũy đến 90%
nếu môi trường không ổn định. (Bùi Quang Tề và ctv, 2004)
Cũng theo Bùi Quang Tề và ctv, (2004) tôm thịt khi bị nhiễm MBV thường
có màu đen tối, kém ăn còi cọc, chậm lớn, chu kỳ lột xác kéo dài, nên trên
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 9 -


PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 10 - Có thể dùng phương pháp mô học, để phát hiện các thể ẩn hình cầu bắt màu
hồng của thuốc nhuộm Eosin, nằm trong nhân phình to của tế bào gan tụy, trên
các lát cắt mô gan tụy với thuốc nhuộm H&E, ở độ phóng đại đại lớn hơn hoặc
bằng 40X

Có thể dùng các phương pháp hiện đại để chẩn đoán và nghiên cứu virus này
như dùng kỹ thuật PCR để nhận biết ADN đặt trưng của MBV, dùng phương
pháp kính hiển vi điện tử (TEM) phát hiện các thể MBV trong trong nhân tế
bào biểu mô gan tụy

Hình 2.5: Gan tụy tôm sú bị nhiễm MBV, nhuộm H&E
(Bùi Quang Tề, 2004)

Hình 2.4: Tiêu bản ép mô gan tụy của hậu ấu trùng tôm P. monodon bị nhiễm

MBV nhuôm malachite green

(700X). (Bondad
-
Reantaso, M.G et al., 2001
)


Virus Trung Quốc (HHNBV) 120 x 360 nm
Virus tôm Nhật 1(RVPJ-1) 84 x 226 nm
Virus tôm Nh
ật 2 (RV
-
PJ
-
2)

83 x 275 nm

54 x 216 nm

Virus b
ệnh đốm trắngThái Lan
(SEMBV)
121 x 276 nm

89 x 201 nm

Virus bệnh đốm trắng (WSBV) 70-150x350-380nm 58-67x330-350nm
Hội nghị virus học quốc tế lần thứ 12 (Paris, 2002) các tác giả: Just M. Vlak,
Jean-Robert Bonami, Tim W. Flegel, Guang-Hsiung Kou, Donald V. Lightner,
Chu-Fang Lo, Philip C. Loh và Peter J. Walker đã phân loại virus gây hội
chứng đốm trắng là một giống mới Whispovirus thuộc họ mới Nimaviridae.
Virus có dạng hình trứng, kích thước 120 x 275nm, có một đuôi phụ ở một
đầu, kích thước 70 x 300nm. Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân

đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thừa rơi vào
ao nuôi. Ngòai ra bệnh đốm trắng còn có khả năng lây truyền qua đường thẳng
Hình2.6: Tôm sú bị bệnh đốm trắng có các đốm trắng dưới vỏ (Bùi
Quang T
ề, 2004
)

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 13 -

đứng, virus đốm trắng có thể lây lan theo chiều dọc khi gây cảm nhiễm từ tôm
bố mẹ mang mầm bệnh đốm trắng đã chuyển sang thế hệ con (Lo et al. 1997,
trích dẫn Trần Việt Tiên, 2007)
2.4.5. Phương pháp chẩn đoán
Theo tài liệu của FAO (2001) hướng dẫn chẩn đoán bệnh trên động vật thủy
sản Châu Á thì có các phương pháp chẩn đoán sau:
Quan sát chung: Bệnh đốm trắng thường được báo hiệu trước bằng việc tôm
ngừng ăn trong một vài ngày, tôm sắp chết bơi gần mặt nước ở bờ ao nuôi.
Những con tôm này sẽ có các thể vùi màu trắng lẫn trong biểu bì và thân tôm
thường hơi biến đỏ. Các thể vùi ở lớp vỏ thay đổi từ những chấm nhỏ thành
những đĩa có đường kính vài mm và chúng có thể liên kết lại với nhau thành
những mảng lớn. Chúng rất dễ nhận thấy nhờ việc bóc lớp vỏ cutin khỏi giáp
đầu ngực, loại bỏ các mô bám và vỏ cutine soi ra ngoài ánh sáng. Sự xuất hiện
những đốm trắng trong lớp vỏ cutin có thể do một vài nguyên nhân khác tạo
ra.
Làm tiêu bản ép nhanh: Hai kiểu làm tiêu bản ép nhanh có thể dùng để dự
chẩn bệnh đốm trắng: (i) mẫu tôm tươi, không nhuộm màu, được cố định
trong Formalin 10%, và soi trên nền tối của kính hiển vi với kính tụ quang ướt,
và (ii) các mô đã cố định được nhuộm màu bằng Haematoxylin và Eosin
(H&E).

2.5. Sơ lược về gen β-actin
Beta-actin có ở khắp nơi trong cơ thể tôm, Beta-actin là một mRNA, đóng vai
trò rất quan trọng trong chức năng của cơ thể. Nó có vai trò và chức năng cơ
bản trong cơ thể sinh vật như: cấu trúc vỏ, sự phân chia tế bào, sự vận động và
co cơ. Hơn nữa, gen Actin được ứng dụng trong nghiên cứu khoa học như
phân tích sự phát sinh loài. Actin trong cơ thể sinh vật có thể chia làm 2 nhóm:
Actin tế bào chất (β và γ) và 4 Actin cơ (α-skeletal, α-cardiac, α-aortic, α-
enteric). Đối với động vật không xương sống và thực vật hầu hết là Actin tế
bào chất. (Zhu et al., 2004. trích dẫn Trần Nguyên Diễm Tú, 2008)
2.6. Kỹ thuật Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuyếch đại (tạo ra
nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.
coli hay nấm men. Kỹ thuật này được phát minh và đặt tên bởi Mullis et al.,
1985. PCR có tính nhạy cao và cho phép tìm ra nhanh chóng, thậm chí chỉ với
một tiểu phần virus. Những virus ẩn, không có các biến đổi về mô học cũng có
thể tìm thấy bằng kỹ thuật này. (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005)
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
- 15 -

Nguyên tắc của phản ứng PCR
Theo Đặng Thị Hoàng Oanh (2007) thì:
Tất cả các ADN polymerase khi tổng hợp một mạch ADN mới từ mạch khuôn
điều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn ADN
ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và ADN
polymerase sễ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu hai mồi chuyên biệt
bắt cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự ADN thì chỉ đoạn ADN nằm giữa
hai mồi được tổng hợp. Hai mồi này gồm một mồi xuôi và một mồi ngược so
với chiều phiên mã của gen
Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
3 giai đoạn sau:

ADN mẫu có vai trò rất quan trọng và ảnh hưởng rỏ rệt đến kết quả phản ứng
PCR. Hàm lượng ADN mẫu nằm trong khoảng 100ng-1μg. Hàm lượng ADN
quá thấp sẽ tạo ra ít sản phẩm, nhưng với hàm lượng lớn sẽ tạo ra nhiều sản
phẩm phụ. Hàm lượng ADN quá cao phản ứng PCR không xảy ra được.
(Newton và Graham, 1995 trích dẫn bởi Trần Thị Mỹ Duyên, 2006)
Enzyme (Taq ADN polymerase)
Thông thường người ta sử dụng nồng độ 2,5 U/phản ứng. Việc tăng nồng độ
Tap ADN polymerase hơn 2,5 U/ phản ứng đôi khi làm tăng hiệu quả của phản
ứng PCR, nhưng chỉ trong khoảng nhất định. Nếu nồng độ Taq ADN
polymerase quá cao sẽ làm giảm hiệu xuất sản phẩm và sẽ tạo ra nhiều sản
phẩm phụ không mong muốn. Hơn nửa đây là thành phần đắt nhất của phản
ứng PCR nên việc chọn nồng độ thích hợp là rất quan trọng. (Martha et al.,
2001 trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thúy Hằng, 2008)
Mồi và nhiệt độ gắn mồi
Mồi là yếu tố quan trọng quyết định hiệu quả phản ứng PCR, do đó phải tuân
theo một số nguyên tắt sau (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005):
+ Trình tự mồi được sao cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi
xuôi và mồi ngược và giữa các thành phần khác nhau của cùng một
mồi.
+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi xuôi và mồi ngược không được quá chênh
lệch nhau (không quá 3°C).
+ Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự ADN cần khuếch đại, không
trùng với trình tự lặp lại trên gen.
+ Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và mồi ngược không qua lớn, phản ứng
PCR sẽ tối ưu khi trình tự giữa hai mồi nhỏ hơn 1kb. Độ dài mồi tốt
nhất là từ 20-30 nucleotic.
Nồng độ các nucleotide tự do (dNTP)
Nồng độ các dNTP khoảng 200μM cho mỗi phản ứng. Nồng độ thấp hơn tăng
cường độ chính xác của phản ứng nhưng tạo ra ít sản phẩm, còn nồng độ cao
hơn thì làm giảm tính chính xác của phản ứng. Cần phải có 4 loại nucleotide