TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA THỦY SẢN

CAO CHÍ THUẬN PHÁT HIỆN WHITE SPOT SYNDROME VIRUS (WSSV)
TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ
TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN


TRONG MẪU THỨC ĂN DÙNG NUÔI VỖ
TÔM SÚ BỐ MẸ (Penaeus monodon) LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
NGÀNH BỆNH HỌC THỦY SẢN CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TRẦN THỊ TUYẾT HOA
ĐẶNG THỊ HOÀNG OANH

2009
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm tạ Quý Thầy - Cô giảng viên Khoa Thủy Sản, trường Đại học
Cần Thơ đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý
báu trong suốt thời gian em học tập tại trường.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn cô Trần Thị Tuyết Hoa giảng viên Bộ môn
Sinh học và Bệnh Thủy Sản thuộc khoa Thủy Sản - trường đại học Cần Thơ đã
tận tâm dìu dắt, hướng dẫn em hoàn thành luận văn tốt nghiệp, tạo điều kiện để

thống nuôi này.
Việc phát hiện WSSV trên các mẫu thức ăn tươi sống được thực hiện với qui
trình PCR của Kimura et al.1996 (Trần Thị Phương Trang tối ưu tháng 5 năm
2009) và bộ kít IQ2000 của công ty Farming Intelligene Technology Corporation,
Đài Loan. Việc khẳng định những ảnh hưởng của WSSV trên các mẫu thứ ăn này
ở cấp đô mô, tế bào được thực hiện bằng phương pháp mô học. Thành phần các
loại thức ăn thu được ở Bạc Liêu là nhiều hơn Cà Mau nhưng tỉ lệ nhiễm trong
các mẫu ở Cà Mau (59 %) là cao hơn ở Bạc Liêu (54 %). Kết quả PCR của kít
IQ2000 cho thấy các mẫu nhiễm WSSV chỉ ở mức độ nhẹ. Kết quả mô học trên
một số ốc mượn hồn cho thấy sự ảnh hưởng của WSSV trên tế bào của mô liên
kết dạ dày. Từ đó hoàn toàn có thể khẳng định sự nhiễm WSSV trên các mẫu thức
ăn tươi sống trong các trại sản xuất giống thu từ Bạc Liêu và Cà Mau.
ii
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM TẠ ……………………………………………………………… i

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Tình hình sử dụng thức ăn tươi sống nuôi vỗ tôm sú bố mẹ tại hai tỉnh Bạc
Liêu và Cà Mau……………………………………………………… ……18
4.2 Xác định sự nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn…………………… 19
4.2.1 Sự nhiễm WSSV ở mẫu ốc mượn hồn………… ………………………19
4.2.2 Sự nhiễm WSSV ở mẫu mực…………………………………………….21
4.2.3 Sự nhiễm WSSV trên tôm tít………………… ………….…………… 22
4.2.4 Xác định sự nhiễm WSSV trong các mẫu thức ăn tươi sống với kít WSSV-
IQ2000 ……………………………………………………………………… 23
4.2.5 Xác định sự nhiễm WSSV trong mẫu thức ăn với phương pháp mô học 24
4.3.1 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Bạc Liêu……………25
4.2.3 Xác định tỉ lệ nhiễm WSSV ở các mẫu thức ăn tại Cà Mau…………… 27

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
PHẦN V
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT……………………………………………………28
5.1 Kết luận…………………………………………………………… …… 28
5.2 Đề xuất…………………………………………………………………… 28
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………… 29
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
DANH SÁCH HÌNH
Hình 4.1 Các mẫu ốc thu được từ các trại sản xuất giống tôm sú ở Bạc Liêu và
Cà Mau
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm PCR ốc mượn hồn, mực và tôm tít
Hình 4.3 Các mẫu mực dùng trong các trại sản xuất giống tại Bạc Liêu
Hình 4.4 Mẫu tôm tít dùng cho tôm mẹ tại Bạc Liêu
Hình 4.5 Kết quả điện di các mẫu chạy PCR với bộ kit IQ2000
Hình 4.6 Tế bào liên kết dạ dày của ốc mượn hồn nhiễm WSSV (H&E, 100X)
Hình 4.7 Cơ quan ống gan tụy của ốc mượn hồn (H&E, 40X)
Hình 4.8 Tỉ lệ nhiễm WSSV trong các mẫu thu từ Bạc Liêu
vi
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
1
PHẦN I
GIỚI THIỆU
Nghề nuôi trồng thủy sản của Việt Nam nói chung và Đồng Bằng sông Cửu
Long (ĐBSCL) nói riêng đã và đang phát triển mạnh, là một trong những ngành
kinh tế mũi nhọn của cả nước. Trong đó cá tra, cá ba sa và tôm sú là một trong
những đối tượng nuôi chính và chiếm ưu thế trong ngành nuôi thủy sản của cả
nước. Tuy nhiên trong những năm qua cùng với sự phát triển quá ồ ạt, tự phát,

tôm biển, chiếm khoảng 80 % sản lượng tôm nuôi trên thế giới, gồm các nước
như: Trung Quốc, Ấn Độ, Thái Lan, Indonesia, Nhật Bản, Đài Loan,Việt Nam
(trích dẫn bởi Lý Ngọc Hà, 2008). Theo FAO (2006), châu Á có 9 trong tổng số
10 quốc gia đứng đầu về nuôi trồng thủy sản trên thế giới.
Cùng với sự phát triển mạnh mẽ nghề nuôi tôm thế giới là sự bùng phát và sự
tàn phá của dịch bệnh. Năm 1988, Đài Loan đã bị thiệt hại nặng nề, tiếp đó là
Indonesia năm 1992, Trung Quốc năm 1993, Ấn Độ năm 1994, Thái Lan 1997
và Ecuado năm 1999, Mehico năm 1999-2000, Pháp và Iran năm 2002, Brazil
2005 (C M Escobedo-Bonilla et al. 2008).
2.2 Ở Việt Nam
Nghề nuôi tôm ở Việt Nam bùng phát vào những năm đầu của thập niên 90 khi
Chính phủ ban hành Nghị quyết 09, cho phép chuyển đổi một phần diện tích
trồng lúa, làm muối năng suất thấp, đất hoang hoá sang nuôi trồng thuỷ sản.
Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên đến 478.000 ha năm
2001 và 540.000 ha năm 2003. Chỉ trong vòng 1 năm sau khi ban hành Nghị
quyết 09, đã có 235.000 ha gồm 232.000 ha ruộng lúa, 1.900 ha ruộng muối và
1.200 ha diện tích đất hoang hoá ngập mặn được chuyển đổi thành ao nuôi tôm.
Cho đến nay, diện tích nuôi tôm ở Việt Nam vẫn tiếp tục tăng, tuy nhiên tốc độ
đã có phần chững lại (
&news-ID=6471106). Tổng kim ngạch xuất khẩu toàn ngành tính đến ngày
14/11/2008 đã chạm mức 4 tỉ USD. Trong mười tháng đầu năm 2008, xuất
khẩu cả nước đạt 1.054.600 tấn trị giá 3,828 tỉ USD tăng 39,4 % về lượng và
24,4 % về giá trị so với cùng kỳ năm ngoái (tạp chí thủy sản Việt Nam, 2009).
Trong khoảng năm 1993-1994, bệnh đốm trắng đã được ghi nhận ở Việt Nam,
đặc biệt là từ tháng 3 năm 1993 bệnh đã làm thiệt hại cho nghề nuôi tôm ở hầu
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
3
hết các tỉnh ĐBSCL (trích dẫn bởi Nguyễn Trường Quang, 2004). Trong những
năm gần đây, bệnh đốm trắng xuất hiện thường xuyên ở các khu vực nuôi tôm
ven biển Việt Nam. Hầu hết các ao bị nhiễm đốm trắng sẽ gây chết hàng loạt và

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
4
bào biểu mô là tạo thể vùi trong nhân phì đại. Thể vùi WSSV bắt màu hồng của
Eosin và cả màu tím của Haematoxylin, ở giai đoạn đầu thể vùi bắt màu tím của
Haematoxylin và có vùng sáng xung quanh nhưng dần về sau, khi chuyển sang
tế bào Cowdry type A thì chúng sẽ bắt màu hồng của Eosin.
Theo Lightner 1996, thể vùi là dấu hiệu bệnh lý đặc trưng dùng trong việc chẩn
đoán bệnh đốm trắng. Khi xâm nhập vào cơ thể tôm, WSSV tạo các thể vùi
trong nhân của tế bào mang, biểu bì ruột, dạ dày, biểu bì dưới vỏ, cơ quan
lymphoid, tim, tuyến râu (Phạm Trần Nguyên Thảo, 2003).

A B
Hình 2.1 Dầu hiệu bệnh lý của bệnh đốm trắng (Bùi Quang Tề, 2006)
A. Nhân tế bào biểu bì dạ dày tôm bệnh trương to, có thể vùi WSSV.
B. Dấu hiệu bên ngoài của bệnh đốm trắng
2.3.2 Phổ loài cảm nhiễm:
WSSV thường gây bệnh trên tôm giống và tôm trưởng thành ở các khu vực nuôi
tôm thâm canh và quảng canh. Là loài virút gây tỉ lệ chết cao và có phổ loài cảm
nhiễm rộng, trên 40 loài động vật giáp xác tự nhiên, có độc lực với hầu hết các
loài tôm có giá trị kinh tế (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004).
Từ khi xuất hiện (năm 1992) WSSV đã là mối đe dọa lớn cho nghề nuôi tôm thế
giới. Tác nhân này đã lây lan cho các loài tôm nuôi chủ lực ở các nông trại và
hầu hết các giáp xác mười chân. Cho đến nay có: (i) 18 loài tôm he nuôi và
hoang dã bị nhiễm WSSV (Fennero- penaeus chinensis, F. indicus, F. mergui-
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
5
ensis, Litopenaeus setiferus, L. Sty- liro- stris, Marsupenaeus japonicus,
Metapenaeus ensis, Penaeus monodon, P. penicillatus, Parapenaeopsis
stylifera, Solenocera indica, Trachypenaeus cur- virostris ) (Wongteerasupaya
et al. 1996; Durand et al 1997; Lu et al. 1997; Chou et al 1998, Lightner et al

bệnh đốm trắng từ ao khác và bay đến ao nuôi đã mang theo các mẩu thức ăn
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
6
thừa rơi vào ao nuôi (Trần Thị Tuyết Hoa, 2004). Bệnh đốm trắng không có khả
năng lây truyền qua đường thẳng đứng vì các noãn bào (trứng) phát hiện chúng
nhiễm virus đốm trắng thì chúng không thành thục được. Nhưng trong quá trình
đẻ trứng của tôm mẹ có thể thải ra các virút đốm trắng từ trong buồng trứng của
chúng, do đó ấu trùng tôm dễ dàng nhiễm virút ngay từ giai đoạn sớm (Bùi
Quang Tề, 2006).
2.3.4 Phương pháp chẩn đoán – phát hiện bệnh
Với những thiệt hại đáng kể do virút gây ra đã có không ít nhà khoa học nghiên
cứu về tác nhân gây bệnh này với nhiều phương pháp từ truyền thống đến hiện
đại, có thể chia thành các mức độ sau:
- Dự chuẩn
Quan sát chung: bệnh đốm trắng có thể được biểu hiện trước vài ngày với dấu
hiệu là ngừng ăn, tôm sắp chết lờ đờ gần bờ, xuất hiện những đốm trắng dưới vỏ
hoặc thân tôm thường biến đỏ.
Có thể dùng phương pháp làm tiêu bản ép nhanh để chẩn đoán bệnh.
Nhưng đây không phải là những dấu hiệu đặc trưng chỉ có ở bệnh do WSSV gây
ra nên việc kiểm khẳng định bằng những phương pháp khác là rất cần thiết (trích
dẫn bởi Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007).
- Kiểm khẳng định
Việc khẳng định nhiễm WSSV có thể được tiến hành bằng phương pháp PCR
(bước đơn hoặc Nested PCR), kỹ thuật lai tại chổ, lai Western, kính hiển vi điện
tử (TEM) hay phương pháp mô học hoặc có thể kết hợp nhiều phương pháp
(Đặng Thị Hoàng Oanh, 2007)(C M Escobedo-Bonilla, 2008).
2.3.5 Cách phòng bệnh
Theo Bùi Quang Tề (2006), cách phòng bệnh đốm trắng tốt nhất là chọn tôm bố
mẹ có chất lượng tốt, không vận chuyển tôm với mật độ cao, không nên dùng
thức ăn tươi sống, nguồn nước nuôi và nước thải phải qua xử lý, ngăn chặn giáp

pháp này họ đã thành công trong việc phát hiện WSSV trên tôm nuôi, tôm đánh
bắt từ tự nhiên, các loài cua và cả các một số loài động vật chân đốt khác.
Với mỗi nhóm đối tượng trên họ có phương pháp phát hiện WSSV khác nhau.
Đối với các loài trong nhóm mười chân đươc nuôi như tôm sú (P. monodon),
tôm he Nhật (P. japonicus), tôm thẻ đuôi đỏ (P. penicillatus), tôm càng xanh
(Macrobrachium rosenbergii) và cua bùn có dấu hiệu đốm trắng được thu từ
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
8
những vùng địa lý khác nhau với những giai đoạn khác nhau, vào những mùa
khác nhau ở Đài Loan. Mẫu thu được trữ trong nitơ lỏng -70
0
C cho đến khi
dùng kỹ thuật PCR để kiểm tra. ADN của chúng được chiết tách theo qui trình
của Lo et al (1996) đã được tối ưu sau một số nghiên cứu. Kết quả khi phân tích
những mẫu tôm lớn đánh bắt từ tự nhiên bằng phương pháp PCR bước 2 cho
thấy tỉ lệ nhiễm với WSSV của tôm sú (P. monodon) là 50/66 mẫu; tôm he Nhật
(P. japonicus) là 14/23 mẫu; tôm rằn (P. semi- sulcatus) là 2/32 mẫu và tôm thẻ
đuôi đỏ (P. penicillatus) là 3/27 mẫu. Kết quả nghiên cứu mô học cũng tìm thấy
những thể vùi nội nhân WSSV tồn tại trong tế bào của mang, dạ dày, cơ quan
lymphoid và chân bơi. Riêng tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii thì
cũng cho kết quả dương tính với WSSV ở PCR 2 bước nhưng nhóm tác giả
không đề cập đến tỉ lệ nhiễm. Các mẫu tôm dại, cua dại, côn trùng thủy sinh và
nhóm giáp xác mười chân thu từ nông trại tôm đang bùng phát bệnh đốm trắng
cũng cho kết quả dương tính với WSSV. Nhộng của côn trùng thủy sinh
(Ephydridae) nhiễm với tỉ lệ là 8/10 mẫu, họ mười chân là 4/6 mẫu, tôm mang
(Palaemonidae) là 12/15 mẫu và mẫu cua dại (Helice tridens) là 5/11 mẫu.
Nghiên cứu mô học không được thực hiện trên nhóm đối tượng này cũng cho
thấy các thể vùi nội nhân của các cơ quan có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung
phôi bì.
S. K. Otta et al. 1999 đã dùng kỹ thuật PCR để phát hiện WSSV trên các loài

ủ, máy sấy chân không, máy PCR, bộ điện di, thiết bị chụp ảnh gel, tủ lạnh, lò vi
sóng, cân điện tử, micropipette các loại, ống eppendorf chuyên dùng trong PCR
(1,5 ml; 0,5 ml; 0,2 ml), bộ kit IQ2000-WSSV…
Hoá chất: Nitơ lỏng, nước đá, dung dịch đệm TAE 0.5X, agarose, Ethidium
Bromide, nước cất, ethanol, chloroform, nước Javel…
Dùng trong nghiên cứu mô
Dụng cụ: bộ tiểu phẩu, kính hiển vi, lame, lamelle, lọ đựng mẫu, khay nhựa,
máy đúc khối, máy cắt mẫu, máy chụp ảnh, máy xử lý…
Hoá chất: Cồn tuyệt đối, Davidson’s AFA, nước cất, parafin, sáp ong, keo
Enterlan, Xylen, dung dịch 2% Potassium, dung dịch 1% acid-alcohol, thuốc
nhuộm Haematoxylin và Eosin…

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
10
3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp chiết tách ADN (bộ chiết tách CTAB-DTAB của công ty
Farming Intelligene Technology Corporation, Đài Loan)
Chuẩn bị mẫu: cho khoảng 20mg mẫu vào ống eppendorf (1,5 ml) chứa 600µl
dung dịch DTAB. Nghiền mẫu bằng que nghiền tiệt trùng.
Ủ mẫu đã chuẩn bị ở 75
0
C trong 5 phút, sau đó làm lạnh đến nhiệt độ phòng.
Lắc đều mẫu, ly tâm nhẹ, sau đó thêm 0,7 ml Chloroform, lắc đều 20 giây và ly
tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
Chuyển phần dung dịch trong ở trên sang ống eppendorf 1,5 ml mới, thêm 100
µl CTAB Solution và 900 µl nước cất, lắc đều sau đó ủ ở 75
0
C trong 5 phút.
Làm lạnh xuống nhiệt độ phòng và ly tâm 12.000 vòng/phút trrong 10 phút.
Bỏ phần nước trong ở trên, hòa tan phần còn lại bằng 150 µl Dissolve solution,

P2 5
’
-CGC-TGG-AGA-GGA-CAA-GAC-AT-3
’

P3 5
’
-TCT-TCA-TCAGAT-GCT-ACT-GC-3
’

P4 5
’
-TAA-CGC-TAT-CCA-GTA-TCA-CG-3
’

Việc kiểm tra chất lương ADN ly trích được thực hiện dựa vào đoạn mồi đặc
hiệu cho giáp xác mười chân có trình tự như sau:
Bảng 3.2 Trình tự đoạn mồi của gen nội chuẩn (Csiro, 2008)
Tên mồi Trình tự
20a2 5’-ACT-TCC-CCC-GGA-ACC-CAA-AGA-CT-
3’
20s9 5’-GGG-GGC-ATT-CGT-ATT-GCG-A-3’
Phản ứng PCR được thực hiện qua hai bước với thành phần hóa chất và điều
kiện phản ứng như sau: PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version

C trong 30 giây
01 chu kỳ:72
0
C trong 5 phút
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
13
PCR bước 2: thể tích phản ứng là 20 µl, sử dụng sản phẩm của PCR bước 1 là 1
µl, và thành phần hóa chất giống như bước một nhưng đoạn mồi là P3 và P4 và
nồng độ MgCl
2
cũng thay đổi nhưng với điều kiện phản ứng như bước 1.
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất sử dụng cho phản ứng bước 2
Hóa chất Nồng độ
PCR buffer (5X) 1 X
MgCl
2
(25mM) 1 mM
dNTP (10 nm) 200 µM
P3 (mồi xuôi) 20 pmol
P4 (mồi ngược) 20 pmol
Taq DNA polymerase (5U) 1,5 U
20a2 10 pmol
20s9 10 pmol
Nước cất tiệt trùng
Sản phẩm bước 1
Điện di
Chuẩn bị bản thạch (gel): đun nóng dung dịch đệm TAE 0.5X với agarose 1,5%
(1,5 g/100ml) cho tới khi agarose tan hoàn toàn. Sau đó để nguội (50
0
C) và

C trong 20 giây, 72
0
C
trong 30 giây. Lặp chu kỳ trên 15 lần. Sau đó, ở 72
0
C trong 30 giây, 20
0
C trong
30 giây.
PCR bước 2: 94
0
C trong 20 giây, 62
0
C trong 20 giây, 72
0
C trong 30 giây. Lặp
chu kỳ trên 30 lần. Sau đó, ở 72
0
C trong 30 giây, 20
0
C trong 30 giây.
- Điện di: được thực hiện theo các bước đã được mô tả ở phần điện di mục 3.3.2.
- Đọc kết quả: Những mẫu dương tính theo bộ kit IQ2000 – WSSV hiện vạch
tương ứng 296 bp và/hoặc 550 bp.Vạch nội chuẩn tương ứng 848 bp. PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
15
3.3.4 Phương pháp mô học
Phương pháp thực hiện theo qui trình đang được áp dụng tại phòng thí nghiệm

Đúc khối: sau khi xử lý, chuyển khuôn nhựa chứa mẫu sang máy đúc khối. Mẫu
mô sẽ được đặt trong một khung cố định bằng inox và tiến hành đúc khối bằng
paraffin nóng chảy ở 65
o
C. Định hướng mẫu mô cho đúng, cẩn thận cho paraffin
nóng chảy vào khuôn. Để đảm bảo mẫu được giữ đúng vị trí thì cho khuôn đúc
qua khu vực làm lạnh nhanh để cố định. Khi mẫu mô được tẩm vào trong
PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version
16
paraffin, đặt khuôn nhựa có ký hiệu mẫu lên trên. Tiếp theo đặt khuôn mẫu qua
ngăn làm lạnh nhanh để paraffin rắn lại, sau đó tách paraffin khỏi khuôn.
Cắt lát mẫu mô: trước khi tiến hành cắt mẫu, phải điều chỉnh độ dày của lát cắt.
Có thể bắt đầu bằng những lát cắt 10-12 µm. Sau khi đã cắt bằng mặt khối mẫu
và đạt đến vị trí mong muốn, điều chỉnh độ dày của lát cắt bằng 4 µm.
Dán lát cắt vào phiến kính: Chuẩn bị một cốc nước ấm (40-50
o
C), lát cắt sẽ
được thả nổi trong cốc này. Sau khi lát cắt giãn thẳng trong cốc nước ấm, nhúng
phiến kính vào ngay bên dưới lát cắt. Cẩn thận đính một đầu lát cắt vào phiến
kính, điều chỉnh lát cắt đúng hướng, từ từ rút phiến kính ra khỏi nước, lát cắt sẽ
được dán vào phiến kính.
Sau khi dán lát cắt, tiến hành làm khô tiêu bản bằng cách sấy khô trên bàn sấy ở
nhiệt độ 45-60
o
C qua đêm (hoặc ít nhất 4 giờ) để lát cắt thẳng ra và khô.
Nhuộm màu: Tiêu bản được nhuộm màu Haematoxylin và Eosin (H&E) gồm
các bước như sau:
- Xylen trong 5 phút (lặp lại 3 lần)
- Cồn 100
o