- 1 -
ĐẶT VẤN ĐỀ
Trong những năm gần đây, vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đã và
đang trở thành mối quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới. Nhiều nghiên
cứu của các nhà khoa học đã đưa ra những cảnh báo về tình trạng mất an toàn
trong thực phẩm tiêu dùng.
Theo thống kê, mỗi năm Việt Nam có khoảng chừng 250-500 vụ ngộ
độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân, trong đó 100 - 200 ca tử vong. Có
rất nhiều nguyên nhân dẫn đến ngộ độc thực phẩm, chẳng hạn do: thực phẩm
bị nhiễm vi sinh vật, thực phẩm bị ô nhiễm hóa chất, thực phẩm bị biến chất,
thực phẩm vốn hàm chứa các chất độc tự nhiên…Xét về nguyên nhân do vi
sinh vật, trong số các vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thì vi khuẩn C.
pefringens đã được nhiều tác giả nghiên cứu và xác định chúng là một trong
những tác nhân phổ biến gây ngộc độc thực phẩm [25].
Vi khuẩn Clostridium perfringens (C. perfringens) là loại trực khuẩn,
bắt màu Gram dương, chúng có thể đứng riêng rẽ hoặc kết thành chuỗi hoặc
đứng song song. Vi khuẩn có khả năng hình thành nha bào, không di động, chỉ
hình thành giáp mô trong cơ thể động vật. Căn cứ vào sự sản sinh các loại độc
tố chính (alpha, beta, epsilon, iota) người ta phân chia vi khuẩn này ra làm 5
type là A, B, C, D, E. Mỗi type sản sinh ra những độc tố khác nhau và gây
bệnh cho từng loại đối tượng khác nhau. Type A sản sinh độc tố Alpha, type B
sản sinh các độc tố Alpha, Beta và Epsilon, type C sản sinh Alpha và Beta,
type D sản sinh Alpha và Epsilon, type E sản sinh Alpha và Iota. Ngoài ra C.
perfringens còn sản sinh một số độc tố khác như: gama, delta, eta, theta, kapa,
lambda, mu, nu, neuraminidase, enterotoxin,…[11].
Vi khuẩn C. perfringens tồn tại rất phổ biến trong tự nhiên: trong đất,
nước, đặc biệt là trong đường ruột của động vật và con người [3]. Do đó chúng
rất dễ dàng lây nhiễm vào trong thực phẩm và gây ngộ độc cho con người.
Bệnh ngộ độc thực phẩm thường do các vi khuẩn type A và C đôi khi D gây
ra. Các type này có thể sản sinh độc tố enterotoxin nguồn gốc nha bào kết hợp
- 2 -
Theo thống kê của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy trong 3
năm trở lại đây số người ngộ độc trong mỗi năm là rất lớn. Trong đó ngộ độc
do nguyên nhân thực phẩm nhiễm vi sinh vật chiếm tỷ lệ khá cao. Ngộ độc
thực phẩm không chỉ gây tổn thất lớn về sức khỏe mà còn thiệt hại rất lớn về
kinh tế của mỗi quốc gia. Vì vậy, vấn đề kiểm soát ngộ độc thực phẩm của
mỗi quốc gia là rất cần thiết, đặc biệt là vấn đề ngộ độc thực phẩm do vi sinh
vật.
Bảng 1.1 Thống kê ngộ độc thực phẩm trong 3 năm [24]:
Chỉ tiêu
Năm 2006
Năm 2007
Năm 2008
Số vụ ngộ độc
170
234
69
Số người mắc
7250
6896
4270
Số tử vong
63
123
15
Ngộ độc do vi sinh vật
29
87
26
Ngộ độc do độc tố
39
277 vụ, chiếm 45% trong số các vụ ngộ độc thực phẩm trong cả nước. Thiệt
hại mỗi năm gần chục tỷ USD cho việc giải quyết những hậu quả của các vụ
ngộ độc thực phẩm.
Ở các nước phương tây, nhiễm C. perfringens là nguyên nhân thứ ba về
ngộ độc thực phẩm phần lớn là do thực phẩm chưa được nấu chín.
Trên đây là những con số sơ bộ về tình hình ngộ độc thực phẩm ở một số nước
phát triển. Còn tại các nước đang phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm cũng
đang diễn biến khá phức tạp và cũng gây ra nhiều hậu quả nghiêm trọng, trong
đó có Việt Nam.
- 5 -
2. Nguyên nhân và một số loại ngộ độc thực phẩm
Ngộ độc thực phẩm thường do các nguyên nhân sau [4]:
- Thức ăn bị ôi hỏng.
- Bản thân thức ăn có chất độc.
- Thức ăn bị nhiễm vi sinh vật.
- Ngộ độc do hóa chất thêm hoặc lẫn vào thức ăn.
2.1. Ngộ độc thực phẩm do thức ăn bị ôi hỏng
Trong quá trình bảo quản, nếu không đảm bảo vệ sinh hoặc không theo
đúng yêu cầu kĩ thuật, các cất dinh dưỡng trong thức ăn sẽ bị các tác nhân
như: vi sinh vật, hoá học, vật lý… phân hủy thành những chất có hại. Chẳng
hạn như: các chất đạm bị phân hủy thành amoniac, hydrosulphua, các chất
amin độc; Các chất béo có thể bị oxy hóa thành các peroxyt, aldehyd, cetol,…;
Nitrat bị chuyển thành nitrit…Các chất này không những làm cho thức ăn có
mùi khó chịu mà có thể còn gây ngộ độc cho người sử dụng [4].
2.2. Ngộ độc do ăn phải thức ăn bản thân có chất độc
Một số động vật, thực vật bản thân nó có chứa trong tế bào những chất
độc, hoặc trong điều kiện nào đó tiết ra chất độc có thể gây ra ngộ độc khi cơ
thể người ăn phải. Ngộ độc loại này chia làm ba nhóm [4]:
- Một số thực vật có chất độc: khoai tây nảy mầm, sắn, măng, hạnh nhân. Một
số loại hạt, vỏ cây, rễ cây có chứa saponin có tính chất tán huyết, phá hủy
Ngoại độc tố (exotoxin): là chất độc được sinh ra trong tế bào rồi tiết ra
ngoài tế bào. Các ngoại độc tố có tính độc cao đối với cơ thể động vật [6].
Nội độc tố (endotoxin): là độc tố được tạo thành liên kết với các thành
phần của tế bào vi sinh vật, chỉ giải phóng ra ngoài khi tế bào chết hoặc bị
phân hủy. Nội độc tố có tính độc yếu hơn ngoại độc tố nhưng bền nhiệt (ở
nhiệt độ sôi của nước độc tố không bị mất hoạt tính) [6].
Ngộ độc thực phẩm do ăn phải thức ăn có độc tố của vi sinh vật mà
không cần có mặt các tế bào sống của chúng. Ngộ độc thức ăn trong trường
- 7 -
hợp này là ngộ độc do độc tố vi sinh vật điển hình, thường là do ăn phải một
lượng lớn ngoại độc tố có trong thức ăn [6].
Ngộ độc do ăn phải một lượng lớn vi sinh vật chủ yếu là do vi khuẩn
trong thức ăn khi vào trong cơ thể chúng tiếp tục sinh trưởng, phát triển và sản
sinh độc tố. Trong cơ thể chúng tiết độc tố hoặc khi bị chết sinh khối của
chúng tự phân giải và giải phóng độc tố gây ngộ độc. Ngộ độc dạng này gọi là
ngộ độc thức ăn có điều kiện hay là ngộ độc thực phẩm nhiễm khuẩn [6].
3. Một số vi sinh vật thường gây ngô độc thực phẩm.
Ngộ độc do vi khuẩn Salmonella
Vi khuẩn gây ngộ độc chủ yếu là Salmonella typhimurium, Salmonella
choleraesuis và Salmonella enteritidis ngoài ra còn có các loại Salmonella
thompson, Salmonella derby, Salmonella newport,…Salmonellae là loại trực
khuẩn gram âm, không sinh bào tử, lên men đường glucose sinh hơi, thường
không lên men đường lactose, sucrose. Nhiệt độ tối thích để chúng phát triển
là 37
0
C, khoảng pH dành cho sự phát triển là 4,1 – 9,0. Khả năng chịu nhiệt độ
và phát triển phụ thuộc vào loại thực phẩm và type huyết thanh. Vi khuẩn bị
tiêu diệt ở 66
0
C ít nhất là 12 phút hoặc 60
3
, O
4
, O
44
, O
26
, O
56
, O
86
, O
111
,
O
125
, O
126
, O
127
, O
157
…
Dựa vào hội chứng bệnh và tính chất gây bệnh của E. coli người ta
chia thành 5 nhóm: EaggEC (enteroaggregative E. coli = E. coli kết tập ở
ruột), EHEC (enterohemorrhagic E. coli = E. coli gây xuất huyết ở ruột),
EIEC (enteroinvasive = E. Coli xâm lấn niêm mạc ruột), EPEC (entero-
pathogenic E. coli = E. coli gây bệnh đường ruột) và ETEC (enterotoxogenic
E. coli = E. coli sinh độc tố ruột). Thời gian ủ bệnh từ 8 – 44 giờ tùy theo
dòng vi khuẩn và loại độc tố. Loại độc tố ruột có thời gian gây bệnh trung bình
4.1. Đặc điểm hình thái, tính chất bắt màu
C. perfrigens là trực khuẩn có khả năng sinh nha bào, nha bào hơi lệch
tâm, vi khuẩn không có khả năng di động chỉ hình thành giáp mô trong cơ thể
động vật. Là trực khuẩn ngắn bắt màu thuốc nhuộm gram dương đứng riêng rẽ
hoặc kết thành chuỗi hoặc đứng song song. Kích thước vi khuẩn (0,6 – 2,4)
(1,3 - 19) m [13], [14].
Hình 1.1 Hình thái vi khuẩn C. perfringens
- 10 -
4.2. Đặc điểm nuôi cấy
Trên môi trường Fluid Thioglycolate: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy vi khuẩn
phát triển tốt làm đục môi trường.
Trên môi trường thạch máu: sau 24 – 28 giờ nuôi cấy ở 37
o
C, vi khuẩn
phát triển tạo khuẩn lạc tròn ướt có hai vòng dung huyết xung quanh [14].
Trên môi trường SPS, TSC agar vi khuẩn phát triển cho khuẩn lạc tròn
màu đen, do vi khuẩn sinh H
2
S tác dụng với Fe (trong môi trường) tạo thành
FeS có màu đen [20].
Trên môi trường nước thịt gan yếm khí vi khuẩn mọc rất tốt, nhanh
chóng làm đục môi trường.
4.3. Đặc tính sinh vật, hóa học
Môi trường Egg yorlk, vi khuẩn phát triển sinh men lecithinane phân
giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc.
Trên môi trường Litmus milk: vi khuẩn lên men đường lactose, làm đông
vón casein. Môi trường chuyển từ tím sang nâu rồi sang trắng với chỉ thị pH
Litmus.
Vi khuẩn có khả năng lên men các loại đường: glucose, lactose,
maltose, sucrose. Không lên men manitol, không sinh indol [20].
+
-
E
+
-
-
+
Tất cả các type đều sản sinh Alpha toxin (gene mã hoá là Cpa), là loại
phospholipase C có khả năng thuỷ phân phosphotidylcholine và
sphingomyeline là nguyên nhân gây tan huyết, cả 2 loại protein này đều có thể
kết hợp với màng tế bào của vật chủ [16].
Beta toxin (gene mã hoá là Cpb) nằm trên plasmid của vi khuẩn, gây tổn
thương các tế bào biểu mô ruột, tế bào màng trong ruột. Ngoài ra, beta toxin
còn tác động đến mô thần kinh làm ảnh hưởng đến trao đổi canxi màng gây rối
loạn chức năng thần kinh bình thường. Mới đây nhiều tác giả còn đề cập đến
độc tố Beta toxin 2 (Cpb2) nhưng vai trò của nó trong gây bệnh còn chưa xác
định rõ, gene mã hoá của nó nằm trên plasmid. Theo khảo sát của Dawn và
cộng sự (2003) [15] tại trường đại học Arizona Mỹ thì tỷ lệ lưu hành của gene
Cpb2 trong các chủng C. perfringens phân lập trên bò bị bệnh tiêu chảy, bệnh
nhiễm độc huyết đường ruột và chết đột tử là 21,4%, trên bê bị bệnh do type A
là 11,8%, type C là 40% và type E là 97,3%.
Epsilon toxin, gene mã hóa độc tố nằm trên plasmid. Đích của độc tố
này là nhóm lipid: cholesterol và sphingolipid có mặt trên màng tế bào của
Độc
tố
Type
- 12 -
động vật Eukaryotic, vì vậy độc tố này tập trung ở não và thận. Độc tố epsilon
được tiết ra như là 1 tiền độc tố và được kích hoạt bằng men proteolytic.
Iota toxin có 2 vị trí: vị trí gắn độc tố với tế bào biểu mô đích (Ib) và
không (1 – 30 phút ở 100
0
C). Phần lớn các chủng nhạy cảm với nhiệt độ
nhưng những chủng gây bệnh lại chịu được nhiệt độ cao. Các nha bào sống sót
rất lâu trong môi trường và chịu được điều kiện lạnh đông [7].
Về khả năng sống sót qua thời gian trữ đông kết quả nghiên cứu ở thịt
gà đông lạnh cho thấy chỉ có 4% tế bào sống sót được khi trữ ở - 17,7
0
C sau
180 ngày trong khi tỷ lệ này ở bào tử khô là 40% sau 90 ngày và 11% sau 180
ngày. Về pH, nhiều chủng tăng trưởng trong khoảng 5,5 – 8,5 nhưng thường
không dưới 5,5 và không trên 8,5. Nồng độ Sodium chlorua 5% ức chế sự phát
triển của vi khuẩn và vài dòng thì bị ức chế ở 2,5% sodium nitrat [3].
4.7. Ngộ độc do C. perfringens
Vi khuẩn C. perfringens là một ví dụ điển hình về type huyết thanh gây
ngộ độc thực phẩm trong giống Clostridia, chiếm một vị trí khá đặc biệt vừa là
tác nhân gây bệnh do thực phẩm vừa gây ngộ độc thực phẩm. Một mặt C.
perfringens gây bệnh khi nạn nhân ăn phải một lượng lớn tế bào vi khuẩn, mặt
khác chúng còn sinh độc tố gây ngộ độc [3].
Vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm là do C. perfringens type A. Triệu
chứng gây bệnh: hầu hết sự ngộ độc xảy ra khi người tiêu thụ thực phẩm
nhiễm C. perfringens ở mật độ khoảng 1 triệu vi khuẩn/1gam. Triệu chứng
thường biểu hiện sau 8 – 24 giờ, trung bình là 12 giờ, gồm: đau bụng, tiêu
chảy và giải phóng nhiều chất khí, sốt, buồn nôn, ít khi ói mửa. Trong quá
trình vi khuẩn hình thành bào tử chúng giải phóng độc tố ruột, hậu quả là trong
ruột tích lũy một lượng lớn chất lỏng. Độc tố này bị bất hoạt ở 60
0
C trong 10
phút [3].
Điều kiện và nguồn gốc giúp ngộ độc bộc phát là: (1) thực phẩm phải
Ông đã định type vi khuẩn phân lập được bằng kỹ thuật Multiplex – PCR với
4 cặp mồi đặc hiệu mã hóa cho 4 gene sản sinh độc tố alpha, betha, epsilon,
iota. Kết quả là type A với độc tố alpha là nguyên nhân gây bùng phát bệnh
viêm ruột hoại tử ở các trang trại này [17].
- 15 -
5. Thịt và con đường nhiễm vi sinh vật vào thịt
Thịt gà là một thực phẩm giàu dinh dưỡng, trong thịt có các thành phần:
protein, lipid, các chất khoáng, vitamin, nước. Do đó thịt là không chỉ là thực
phẩm tốt cho người và còn là môi trường thích hợp cho vi sinh vật phát triển.
Vi sinh vật nhiễm vào thực phẩm không chỉ gây thiệt hại lớn về giá trị dinh
dưỡng, chất lượng của thực phẩm mà còn có thể gây bệnh cho con người.
Các con đường lây nhiễm vi sinh vật vào thịt [6]:
- Do bản thân gia súc, gia cầm đã bị bệnh trước khi giết mổ do đó trong
thực phẩm đã có sẵn vi sinh vật.
- Thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật từ môi trường bên ngoài như đất, nước
và các dụng cụ không sạch nhiễm vào thực phẩm, thực phẩm bị hỏng, ôi
thiu, ô nhiễm chéo vào thực phẩm.
- Lây nhiễm vi sinh vật do vật môi giới lây truyền: đó là ruồi, nhặng,
muỗi, côn trùng… mang vi sinh vật từ phân hoặc rác thải nhiễm vào khi
chúng nhiễm vào thịt.
Chỉ tiêu vi sinh vật trong thịt tươi được quy định theo TCVN 7046 –
2002 do bộ khoa học và công nghệ ban hành theo quyết định số 22/2002/QĐ –
BKHCN. TCVN quy định sản phẩm thịt tươi đạt tiêu chuẩn với số lượng C.
perfringens không quá 10 vi khuẩn/gam [2].
- 16 -
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.
1. Nội Dung.
Phân lập vi khuẩn C. perfrigens trên thịt gà ở một số chợ trong TP Nha
Trang.
- Thời gian nghiên cứu: Từ ngày 01/08/2008 đến 30/10/2008.
4. Phương pháp nghiên cứu.
4.1. Phương pháp lấy mẫu.
Lấy mẫu thịt gà theo TCVN 4833 - 1 : 2002 (ISO 3100 - 2 : 1988) [1].
Mẫu sau khi lấy để riêng trong túi PE vô trùng. Ký hiệu mẫu: Thời gian lấy
mẫu, địa điểm lấy mẫu và ký hiệu mẫu rõ ràng. Sau đó cho mẫu vào thùng đá,
vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
Thời gian và số lượng mẫu được bố trí lấy như ở bảng 2.1.
Bảng 2.1 Thời gian và số lượng mẫu khảo sát ở mỗi địa điểm
STT
Địa điểm
Thời gian
Số lượng mẫu
1
Chợ Vĩnh Hải
10 giờ
6
2
Chợ Xóm Mới
10 giờ
6
3
Chợ Đầm
10 giờ
6
4
Chợ Vĩnh Thọ
10 giờ
6
4.2. Phương pháp phân lập vi khuẩn C. perfringens
Mẫu
Fluid
Thyoglycolate
Môi trường đặc
hiệu (TSC agar)
Chọn khuẩn lạc tăng sinh
trên môi trường thạch máu
Xác định các đặc tính
sinh vật hóa học
Định danh vi khuẩn
Định type vi khuẩn
- 19 -
- Cấy đếm vi khuẩn trên đĩa thạch
Đổ khoảng 15ml môi trường TSC vào mỗi đĩa petri đã được đánh dấu
nồng độ pha loãng. Ở mỗi nồng độ pha loãng, hút chính xác 1ml canh khuẩn
nhỏ lên mặt thạch sau đó dùng pipet dàn đều mẫu trên bề mặt thạch, mỗi nồng
độ cấy trên 2 đĩa tương ứng. Đợi bề mặt thạch khô, đổ tiếp 15ml môi trường
TSC rồi láng đều để môi trường phủ kín bề mặt đĩa. Khi môi trường đông lại,
lật ngược đĩa, cho đĩa vào túi yếm khí, đặt vào tủ ấm 37
0
C, 10%CO
2
.
Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, tiến hành đọc kết quả sơ bộ. Đếm toàn bộ
những khuẩn lạc có các đặc tính tròn, lồi, bờ đều nhẵn, màu đen. Số lượng vi
khuẩn có trong 1 gam thịt gà được tính bằng trung bình cộng giữa các đĩa nuôi
cấy cùng nồng độ pha loãng nhân với hệ số pha loãng tương ứng.
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường TSC, cấy kiểm tra trên môi
trường thạch máu. Sau đó kiểm tra các đặc tính sinh vật, hóa học. Trên cơ sở
những đặc tính sinh vật, hóa học đã được kiểm tra tiến hành định danh vi
cố định trong 1 phút, rửa Crystal violet với nước cất. Phủ dung dịch Lugol
trong 1 phút, sau đó đổ bỏ dung dịch Lugol và rửa nhẹ với nước cất. Cầm một
đầu lam kính, nhỏ từ từ cồn 95% cho đến khi vùng phiến phết bạc màu đi (thời
gian tẩy cồn thông thường khoảng 5 – 10 giây), rửa ngay với nước để dừng
công đoạn tẩy cồn. Sau đó phủ dung dịch Fuchsin lên lam kính 1 phút, đổ bỏ
dung dịch và rửa nhẹ qua nước.
Để tiêu bản khô tự nhiên hoặc dùng giấy thấm để thấm khô, quan sát
hình thể và tính chất bắt màu của vi khuẩn dưới kính hiển vi vật kính 40X [3].
Phương pháp kiểm tra Gram bằng KOH 3%
Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên một phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn
lạc cần kiểm tra đặt vào vị trí có giọt KOH 3%. Dùng que cấy làm tan khuẩn
lạc trong KOH. Sau đó từ từ đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo, nhầy kéo lên
thì vi khuẩn cần kiểm tra là vi khuẩn Gram âm, nếu không có sợi tơ nhầy kéo
theo thì vi khuẩn cần kiểm tra là Gram dương [3].
4.6. Phương pháp kiểm tra đặc tính nuôi cấy, một số đặc tính sinh vật hoá
học của vi khuẩn
- Kiểm tra khả năng dung huyết trên môi trường thạch máu: Dùng que cấy vô
trùng lấy một lượng nhỏ môi trường Fluid thioglycolate ria đều trên bề mặt
- 21 -
thạch máu. Sau đó bỏ trong túi yếm khí, đặt trong tủ ấm 37
0
C, 10% CO
2
nuôi
cấy trong vòng 24 – 28 giờ, nếu xung quanh khuẩn lạc có 2 vòng dung huyết
thì phản ứng dương tính và ngược lại.
- Xác định khả năng lên men đường glucose, lactose, maltose, saccarose:
Dùng que cấy vô trùng chọn lấy một khuẩn lạc cần kiểm tra, chích sâu xuống
đáy mỗi ống nghiệm có chứa từng loại đường riêng biệt, để tủ ấm 37
0
2
sau 24 – 28 giờ lấy
ra đọc kết quả. Phản ứng dương tính khi vi khuẩn phát triển sinh men
lecithinase phân giải lecithin tạo thành vòng trắng sữa xung quanh khuẩn lạc
và ngược lại.
- 22 -
4.7. Phương pháp giữ giống vi khuẩn
Dùng pipet 1000μl, hút 1000μl môi trường nuôi cấy vi khuẩn cho vào
ống eppendof. Tiến hành ly tâm tốc độ 5000 vòng/phút trong vòng 4 phút. Bỏ
nước trong, giữ lại cặn. Hút 500μl glycerol, sau đó bổ sung thêm 500μl môi
trường nuôi cấy vi khuẩn. Voltex cho hỗn hợp đồng nhất, sau đó giữ lạnh ở
nhiệt độ - 80
0
C.
4.8. Phương pháp định type độc tố vi khuẩn C. perfringens bằng kỹ thuật
Multiplex – PCR
Để xác định type vi khuẩn, chúng tôi dựa vào việc xác định gen mã hoá các
độc tố chính của các vi khuẩn phân lập được bằng việc sử dụng phản ứng
Multiplex – PCR. Từ đó kết luận type vi khuẩn phân lập được.
Ở đây chúng tôi sử dụng cặp mồi cho phản ứng Multiplex – PCR do Bộ môn
nghiên cứu Vi trùng Phân Viện Thú Y Miền Trung cung cấp. Trình tự các mồi
được sử dụng trong phản ứng Multiplex – PCR như ở bảng 2.2.
Bảng 2.2 Trình tự các mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex – PCR.
Genes
Trình tự mồi
Kích cỡ (bp)
CPA
5’-GTTGATAGCGCAGGACATGTTAAG -3’
5’-CATGTAGTCATCTGTTCCAGCATC -3’
402
C
4.8.2. Các thành phần của phản ứng
Bảng 2.3 Các thành phần của phản ứng Multiplex – PCR.
STT
Thành phần
Thể tích (μl)
1
H
2
O
12.6
2
Buffer x10
2.5
3
MgCl
2
25mM
1.5
4
dNTPs 10mM
2
5
Qx5
1
6
CPA
1
10 pmol
0.25
13
etx
2
10 pmol
0.25
14
Taq DNA
0.4
15
DNA
2
- 24 -
4.8.3. Chu trình nhiệt của phản ứng.
Hình 2.1 Chu trình nhiệt trong phản ứng Multiplex – PCR.
4.8.4. Phát hiện sản phẩm
Sản phẩm của phản ứng PCR được phát hiện bằng phương pháp chạy điện di
trên gel agarose nồng độ 1,5%.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị thạch: lấy 1,5 gam agarose cho vào 100ml đệm TBE cho vào
lọ thuỷ tinh chịu nhiệt, lắc đều và cho vào lò vi sóng trong 5 phút để làm nóng
chảy agarose.
Để nguội gel khoảng 50
0
C, cho 6μl thuốc nhuộm Ethydium Bromide đã
lắc đều vào, đổ gel đã tan chảy vào bể điện di. Sau 20 phút gel đông lại, rút
răng lược ở bể điện di ra sẽ được một dãy các giếng. Hút 10μl sản phẩm
Multiplex – PCR cho vào các giếng. Hút 8μl maker cho vào giếng, hút 10μl
mẫu đối chứng dương được cung cấp từ phòng thí nghiệm Bộ môn nghiên cứu
Vi trùng Phân viện Thú y miền Trung. Sau khi điện di, gel được soi qua tia
cực tím (UV) và chụp ảnh bằng máy đọc gel kết nối với máy tính.
∞
- 25 -
sau đó đổ mỗi ống đã xử lý nhiệt vào từng ống môi trường Fluid
Thyoglycolate tương ứng để tủ ấm 37
0
C, 10% CO
2
sau 24 giờ. Nếu vi khuẩn
có khả năng hình thành nha bào thì môi trường vẩn đục, vi khuẩn không có
khả năng hình thành nha bào môi trường vẫn trong suốt. Chúng tôi sử dụng
chủng vi khuẩn E. coli làm đối chứng bởi vì theo tài liệu thì vi này không có
khả năng hình thành nha bào. Đối chứng khác là môi trường Fluid
Thyoglycolate.
Copyright: Tài liệu đại học ©