1
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA: SINH HỌC
NGUYỄN PHÚ THIỆN
§¸nh gi¸ kÕt qu¶ thô tinh trong èng nghiÖm
cña hai ph¬ng ph¸p IVF vµ IVF/ICSI
t¹i BÖnh viÖn Phô S¶n Hµ Néi
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ TẠI CHỨC
Ngành: SINH HỌC
HÀ NỘI - 2013
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
2
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
KHOA: SINH HỌC
NGUYỄN PHÚ THIỆN
§¸nh gi¸ kÕt qu¶ thô tinh trong èng nghiÖm
cña hai ph¬ng ph¸p IVF vµ IVF/ICSI
t¹i BÖnh viÖn Phô S¶n Hµ Néi
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP HỆ TẠI CHỨC
Ngành: SINH HỌC
Cán bộ hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Thị Bình
2. TS. Nguyễn Lai Thành
HÀ NỘI - 2013
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
3
ICSI (Intra Cytoplasmic Sperm Injection):Tiêm trinh trùng vào bào tương noãn.
IVF (In Vitro Fertilization): Thụ tinh trong ống nghiệm.
IVM (In Vitro Maturation): Trưởng thành noãn trong ống nghiệm.
PZD (Patial Zona Dissection): Đục thủng màng trong suốt.

mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, người thân bạn bè
của tôi đã luôn động viên, góp ý, giúp đỡ tôi vượt qua mọi khó khăn trong học
tập và trong nghiên cứu.
Hà nội, Ngày 28 tháng 8 năm 2013
Nguyễn Phú Thiện
5
ĐẶT VẤN ĐỀ
Từ khi đứa trẻ đầu tiên Louis Brown ra đời bằng phương pháp thụ tinh
ống nghiệm vào năm 1978 ở Anh, các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản đã hình thành
và không ngừng phát triển[33],[35].
Trên thế giới, theo số liệu của Hiệp hội Sinh sản và Phôi người Châu
Âu, ước tính có gần một triệu rưỡi chu kỳ hỗ trợ sinh sản được thực hiện và
cho ra đời gần 350.000 trẻ mỗi năm. Tại Việt Nam, riêng những năm gần đây,
mỗi năm có xấp xỉ 1000 em bé thụ tinh ống nghiệm.
Kỹ thuật hỗ trợ sinh sản (KTHTSS - Assisted Reproductive
Technologies-ART) là những kỹ thuật kết hợp giữa y học và sinh học, can thiệp
vào các bước trong sinh lý sinh sản tự nhiên nhằm giúp làm tăng khả năng sinh
sản. KTHTSS được định nghĩa chính xác là những kỹ thuật có chọc hút trứng và
thao tác trứng bên ngoài cơ thể. Nói chung, KTHTSS bao gồm kỹ thuật cơ bản
là TTTON và các kỹ thuật có kết hợp hoặc có liên quan đến TTTON.
Nếu thập kỷ 80 là thời kỳ hoàng kim của IVF thì vào những năm đầu
thập kỷ 90, Palermo [59]. với thành công trong kỹ thuật tiêm tinh trùng vào
bào tương trứng (ICSI) đã giải quyết được phần lớn những hạn chế của IVF
bằng những chỉ định rộng rãi hơn, xu hướng áp dụng kỹ thuật ICSI tại các
trung tâm HTSS trên Thế Giới và Việt Nam ngày càng tăng và được coi như
một cuộc cách mạng trong điều trị vô sinh nam. Tỷ lệ thành công của hai
phương pháp IVF và IVF/ICSI tại các trung tâm HTSS như ở Mỹ tỷ lệ thành
công của IVF là 38,2% cao hơn một chút so với ICSI là 36,5%[27]. Còn ở
6

khoảng 10% không rõ nguyên nhân, 10% do cả vợ và chồng, 80% có nguyên
nhân trong đó vô sinh nữ là 40%, vô sinh nam 40% [20],[21].
8
Nguyên nhân chính gây nên tình trạng vô sinh nữ là do rối loạn rụng
trứng (30%), rối loạn chức năng của vòi tử cung (30%). Rối loạn chức năng
vòi tử cung xảy ra do dính vòi tử cung sau viêm nhiễm. Nhiễm trùng lậu cầu
và Chlamydia Trachomatis là nguyên nhân chính gây nên những rối loạn này.
Các nguyên nhân khác gây nên vô sinh là do bệnh lạc NMTC, bất thường về
giải phẫu, các khác thể kháng tinh trùng và một số yếu tố khác chưa được biết
tới[9].
Nguyên nhân chính dẫn đến vô sinh nam là do suy giảm sinh tinh, có
thể do di truyền, hoặc do di chứng của bệnh quai bị và các vết sẹo ở thừng
tinh xuất hiện sau các nhiễm trùng lây qua đường sinh dục [9]. Theo tác giả
Aribarg A (1995) vô sinh nam có tinh dịch đồ bất thường khoảng 35,2% [38].
1.2.2. Vấn đề vô sinh ở Việt Nam
Theo nghiên cứu của Nguyễn Viết Tiến (2012), tỷ lệ vô sinh ở Việt
nam là 7,7% [30]. Tại Việt Nam, theo công bố của Trần Thị Trung Chiến,
Trần Văn Hanh, Lê Văn Vệ và cs thì nguyên nhân vô sinh do nam giới chiếm
40,8%.Theo nghiên cứu của Nguyễn Khắc Liêu và cs tại VBMVTSS trong
các năm 1993 – 1997 trên 1000 trường hợp vô sinh có đầy đủ các xét nghiệm
thăm dò về độ thông đường sinh dục nữ, về phóng noãn, về tinh trùng, thống
kê tỷ lệ vô sinh nữ chiếm 54,4%, vô sinh nam chiếm 35,6% và không rõ
nguyên nhân 10%, trong đó vô sinh nữ theo tác giả, nguyên nhân do tắc vòi tử
cung 46,7%. Nghiên cứu của Phạm Như Thảo (2003) tại BVPSTW cho thấy
nguyên nhân vô sinh nữ do tắc vòi tử cung là 58,6%[28].
Nguyên nhân chủ yếu dẫn đến vô sinh nam là do rối loạn sinh tinh
[10].Ngoài ra vô sinh nam còn do một số nguyên nhân khác như: rối loạn về
tình dục và xuất tinh, rối loạn nội tiết, tắc ống dẫn tinh. Theo Trần Đức Phấn
(2001) trong số các cặp vợ chồng vô sinh có 44% có TDĐ bất thường [17].
9

noãn. Chúng phải trải qua quá trình trưởng thành (maturation) trong khi di
chuyển ở mào tinh (khoảng 20 ngày). Tuy vậy, sự trưởng thành này chỉ là về
mặt hình thể, để có thể thụ tinh tự nhiên với trứng, tinh trùng trưởng thành
còn phải tiếp tục hoàn thiện về mặt chức năng. Các bước hoàn thiện bao
gồm:sự trưởng thành về sinh lý, sinh hóa cũng như chuyển hóa. Khả năng di
động của tinh trùng được hoạt hóa khi có xuất tinh (activation). Trong tự
nhiên, khi di chuyển trong đường sinh dục nữ, chức năng của tinh trùng mới
được hoạt hóa [12], [15],[39].
1.3.3. Quá trình thụ tinh[4],[11].
* Tinh trùng vượt qua lớp tế bào hạt:
Trước đây người ta cho rằng nhiều tinh trùng cùng đến bám quanh lớp tế bào
hạt và tiết ra men hyaluronidase phá hủy lớp tế bào hạt để cho tinh trùng xâm
nhậm vào màng trong suốt. Theo quan điểm mới hiện nay, sự xâm nhập của
tinh trùng qua lớp tế bào hạt là kết quả của sự phối hợp tác dụng của các
enzyme của tinh trùng và của niêm mạc vòi tử cung tiết ra.
* Tinh trùng xuyên qua lớp tế bào nang, gắn vào màng trong suốt của
noãn bào 2 và gây ra phản ứng cực đầu, tạo điều kiện giải phóng các enzyme
từ túi cực đầu.
11
* Với sự trợ giúp của các enzyme túi cực đầu, tinh
trùng lọt qua màng trong suốt, noãn bào 2 tạo phản ứng
vỏ không cho tinh trùng khác lọt vào:
• Phản ứng cực đầu diễn ra từ 10 – 15 phút với các điều kiện sau:
+ Tinh trùng đã được năng lực hóa
+ Túi cực đầu có kích thước bình thường và cân đối
+ Khi đầu của tinh trùng bắt đầu gắn vào màng trong suốt của noãn
theo kiểu ổ khóa và chìa khóa.
• Diễn biến phản ứng:
+ Màng bào tương đầu tinh trùng ở nhiều nơi hòa với màng ngoài của
túi cực đầu hình thành các cấu trúc dạng nhỏ và dẹt

được gọi là lá nuôi sẽ phát triển thành rau thuộc con. Lá nuôi biệt hóa thành lá
nuôi tế bào và lá nuôi hợp bào.
1.3.4. Kết quả thụ tinh
- Sự kết hợp giữa 2 tế bào sinh dục đực và cái đã biệt hóa cao đã tạo ra
tế bào sinh dưỡng kém biệt hóa, có khả năng phân chia tích cực.
13
- Sự thụ tinh khôi phục lại ở tế bào sinh dưỡng bộ nhiễm sắc thể lưỡng
bội đặc trưng cho loài.
- Nhờ thụ tinh, cá thể mới sinh ra mang đặc tính di truyền của cả cha
lẫn mẹ.
- Giới tính di truyền của cá thể mới được quyết định ngay từ khi thụ
tinh, nếu noãn kết hợp với tinh trùng mang nhiễm sắc thể Y, sẽ sinh con trai,
với tinh trùng mang nhiễm sắc thể X, sẽ sinh con gái.
- Sự thụ tinh khơi mào cho hàng loạt quá trình gián phân liên tiếp xảy ra.
1.3.5. Những yếu tố đảm bảo xảy ra sự thụ tinh
Chất lượng tinh trùng và chất lượng noãn bình thường: đây là điều kiện
tiên quyết để đảm bảo thụ tinh. Có rất nhiều loại bất thường noãn: bất thường
cấu trúc màng trong suốt làm cho tinh trùng bình thường không thể sâm nhập,
bất thường trong bào tương noãn: bào tương chưa trưởng thành, bào tương có
không bào, lưới nội bào hoặc mật độ hạt cao…đều là những nguyên nhân ảnh
hưởng đến thụ tinh. Tương tự vậy, tinh trùng dị dạng hoặc khả năng tiến tới
của tinh trùng cũng hạn chế hoặc làm tinh trùng không có khả năng thụ tinh tự
nhiên với noãn.
Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng noãn và tinh trùng:
+ Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng noãn: tuổi mẹ, bất thường về di
truyền, suy tuyến yên, suy buồng trứng, buồng trứng đa nang…
+ Các yếu tố ảnh hưởng chất lượng tinh trùng:(1) suy dinh dưỡng,(2)
nghề nghiệp: làm việc trong môi trường nhiệt độ cao kéo dài làm nhiệt độ bìu
tăng thường dẫn tới giảm sinh tinh, tinh trùng thoái hóa nhiều; làm việc tiếp
súc với hóa chất, tia xạ…(3) các bệnh lý của tinh hoàn: viêm, ứ nước, chấn

- Khi hợp tử phân chia thành 2 phôi bào vào khoảng 23-26 giờ sau thụ
tinh, phôi tiến hành hàng loạt quá trình gián phân nối tiếp nhau liên tục làm
cho số lượng phôi bào tăng lên nhanh chóng. Chỉ có nhân đôi rồi phân chia
nhiễm sắc thể và phân cắt mà không có sự lớn lên. Qua mỗi lần gián phân,
kích thước mỗi phôi bào sinh ra trở nên nhỏ hơn. Vào ngày thứ 2, phôi phân
chia thường có khoảng 3-4 hoặc 5 phôi bào, ngày thứ 3 có khoảng 6-8 phôi
bào. Các phôi bào trong những lần phân chia đầu tiên (phân chia 2-4-8 tế bào)
có tính toàn năng, ít có sự khác biệt về hình dạng, hoạt động sinh học và khả
năng phát triển. Càng về sau, sự khác biệt giữa các phôi bào ngày càng tăng
lên. Mỗi phôi bào sẽ thiết lập chương trình phát triển để biệt hóa các dòng tế
bào đặc hiệu. Các phôi bào được tổ chức theo nhóm, mỗi nhóm có tốc độ
phân cắt riêng để làm cơ sở cho sự hình thành các cơ quan sau này. Vào
khoảng cuối ngày thứ 3 hoặc đầu ngày thứ 4 sau thụ tinh, phôi phân chia 12-
32 phôi bào, gọi là phôi dâu. Cấu tạo của phôi dâu đã có sự biệt hóa phôi bào
gồm: một nhóm tế bào nằm ở vị trí trung tâm có kích thước lớn hơn gọi là đại
phôi bào, còn những tế bào tạo thành một lớp bao quanh phía ngoài có kích
thước nhỏ hơn gọi là tiểu phôi bào. Những đại phôi bào sau này sẽ tạo ra phôi
và một số bộ phận phụ của phôi như màng ối, túy noãn hoàng, niệu nang.
Tiểu phôi bào sẽ tạo lá nuôi, sau này sẽ phát triển thành rau thai và màng bọc
thai. Sự phân chia phôi trong quá trình phôi di chuyển từ vòi tử cung đến tử
cung. Các tế bào hạt vây quanh noãn bị thoái hóa dần dần, màng trong suốt
vẫn tồn tại trong thời gian phân chia phôi đến khi phôi thoát màng rồi cuối
cùng biến mất.
1.5. SỰ LÀM TỔ CỦA PHÔI [2].
- Phôi lọt vào khoang tử cung vào khoảng ngày thứ 4 sau thụ tinh, khi
đó phôi ở giai đoạn cuối phôi dâu hoặc đầu phôi nang. Niêm mạc tử cung sẽ
cung cấp cho phôi nguồn dinh dưỡng như oxy và các chất chuyển hóa.
16
+ Khi phôi vào đến khoang tử cung, phôi vẫn tiếp tục phân chia trong
môi trường dịch tiết của niêm mạc tử cung vài ngày trước khi làm tổ. Đến

nang noãn, chọc hút noãn, cho tinh trùng thụ tinh với noãn và nuôi cấy thành
phôi. Sau đó, một số phôi sẽ được chuyển trở lại vào buồng tử cung. Quá
trình phát triển của phôi và thai sẽ diễn ra hoàn toàn bình thường trong tử
cung người mẹ[4],[35],[44].
Kỹ thuật này được thực hiện thành công trên thế giới lần đầu tiên năm
1978 và thành công lần đầu tiên ở Việt nam 1998.
1.6.2. Chỉ định
Chỉ định ban đầu của TTTON là tổn thương vòi trứng không có khả
năng hồi phục do bệnh lý vùng chậu hoặc phẫu thuật trước đó. Tuy nhiên, sau
đóTTTON được mở rộng cho nhiều chỉ định khác như: rối loạn phóng noãn,
vô sinh nam, vô sinh không rõ nguyên nhân, IUI thất bại 4-6 chu kỳ, lạc nội
mạc tử cung [37],[50].
Điều kiện cần để bệnh nhân làm TTTON thành công là chức năng
buồng trứng còn tốt, buồng tử cung có khả năng mang thai. Tuy vậy, những
trường hợp phụ nữ cao tuổi hay mãn kinh vẫn có thể thực hiện được TTTON
với noãn của người cho. Những bệnh nhân có buồng tử cung bất thường hoặc
không có tử cung vẫn có thể làm TTTON bằng cách nhờ mang thai hộ[33].
1.6.3. Phác đồ thực hiện TTTON hiện nay
Chọc hút noãn qua âm đạo
Nuôi cấy phôi
Chuyển phôi
Kích thích nang noãn
18
Hình 1. Quy trình thụ tinh trong ống nghiệm [22].
Một chu kỳ TTTON bao gồm: kích thích nang noãn, chọc hút lấy noãn
ra ngoài cho kết hợp với tinh trùng trong phòng thí nghiệm, nuôi cấy thành
phôi để chuyển trở lại vào buồng tử cung.
- Kích thích nang noãn.
Mục đích của kích thích nang noãn trong kỹ thuật HTSS là có nhiều
noãn phát triển và trưởng thành. Ưu điểm của kích thích nang noãn là tạo ra

chuyên dụng. Tinh dịch sẽ được đánh giá để có kỹ thuật lọc rửa chuẩn bị tinh
trùng thích hợp. Kỹ thuật lọc rửa tinh trùng trong lab TTTON thường được áp
dụng hiện nay là lọc bằng phương pháp “thang nồng độ” (gradient) và quay ly
tâm để thu được cặn gồm các tinh trùng có chất lượng tốt và sạch nhất, cặn
bẩn, tinh trùng chết và lớp tinh tương sẽ được các lớp thang nồng độ giữ lại.
Sau đó, lớp cặn thu được sẽ được rửa lại bằng môi trường chuyên biệt để loại
bỏ môi trường thang nồng độ (môi trường thang nồng độ có ảnh hưởng không
tốt đên tinh trùng và noãn). Nếu tinh trùng có chất lượng tốt, có nhiều tinh
20
trùng tiến tới nhanh đạt tiêu chuẩn của WHO 2010, cặn ly tâm sau lọc rửa tinh
trùng sẽ được áp dụng kỹ thuật “bơi lên’’(swim-up). Các trường hợp tinh
trùng ít, yếu hoặc hai vợ chồng vô sinh không rõ nguyên nhân sẽ được chỉ
định làm ICSI (tiêm tinh trùng vào bào tương của noãn). Một số trường hợp
khi xuất tinh không có tinh trùng nhưng chọc hút tinh trùng từ mào tinh qua
da (PESA – Percutanous Epididymal Sperm Aspiration) hoặc chọc hút mào
tinh vi phẫu (MESA – Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration) hoặc
chọc hút tinh trùng từ tinh hoàn (TESA - TesticularSperm Aspiration) có tinh
trùng sẽ được chỉ định làm ICSI để thụ tinh với noãn [25],[51],[52],[52].
Chuẩn bị tinh trùng cho mẫu tinh trùng ít yếu này có thể có nhiều cách khác
nhau tùy trung tâm.
* Cho thụ tinh bằng cách cấy tinh trùng với noãn theo IVF cổ điển hoặc làm ICSI.
- IVF cổ điển
Tinh trùng sau khi đã được sử dụng phương pháp swim-up trong tủ cấy
CO2,37
0
C trong khoảng 30 phút, tinh trùng thu được từ nước nổi của swim-
up sẽ được nuôi cấy với noãn ở phòng thí nghiệm. Mật độ cấy khoảng 100-
150 nghìn tinh trùng/ 2noãn/một giếng môi trường nuôi cấy.
- ICSI
ICSI là kỹ thuật dùng hệ thống vi thao tác xử lý tiêm tinh trùng vào bào

tinh trùng vào bào tương noãn [36].
Noãn sau khi làm ICSI được để vào môi trường chuyên biệt trong tủ
cấy CO2,37
0
C.
22
- Kiểm tra thụ tinh.
Đánh giá thụ tinh được tiến hành 18-20h sau khi noãn được cấy với
tinh trùng theo IVF cổ điển, 14-16h sau khi tiêm tinh trùng vào bào tương
noãn. Đánh giá thụ tinh bình thường khi thấy hai tiền nhân. Nếu kiểm tra thụ
tinh sớm hơn thời điểm trên, hai tiền nhân có thể chưa xuất hiện, có thể chỉ
thấy một tiền nhân. Nếu kiểm tra thụ tinh muộn hơn thời điểm trên có thể thấy
hai tiền nhân hòa vào nhau. Khi đó có thể đánh giá nhầm là noãn không thụ
tinh (ngày hôm sau sẽ thấy phôi phân chia). Trong trường hợp đa thụ tinh (thụ
tinh bất thường) sẽ thấy ba đến bốn tiền nhân (do có hơn một tinh trùng xâm
nhập vào noãn). Noãn thụ tinh bất thường cần phải loại bỏ vì chuyển phôi thụ
tinh bất thường sẽ gây chửa trứng hoặc sảy thai. Kiểm tra thụ tinh muộn sẽ
không phát hiện được thụ tinh bất thường, khó loại bỏ được các phôi bất
thường sau đó [59].
- Đánh giá chất lượng phôi và chọn phôi chuyển
Hiện nay, các trung tâm HTSS trên thế giới đánh giá chất lượng phôi
chủ yếu dựa vào hình thái và tốc độ phân chia của phôi. Hình thái của phôi
được theo dõi và đánh giá từ hình thái noãn, hợp tử rồi đến phôi phân chia.
Đánh giá hình thái phôi giai đoạn phân chia sớm (ngày 2,3) dựa vào các chỉ
tiêu chính là số lượng phôi bào, độ đồng đều giữa các phôi bào, tỷ lệ các
mảnh vỡ (fragment). Các chỉ tiêu phụ gồm có sự phân chia phôi bào đồng thời
(phân chia 2-4-8), mật độ hạt trong bào tương, số lượng hạt nhân, không bào
trong phôi bào. Đánh giá hình thái phôi nang dựa vào độ nở rộng của phôi,
hình thái của khối tế bào nội phôi, và màng nuôi. Các phôi tốt nhất sẽ được
chon lựa để chuyển phôi [37],[42],[52],[53]. Hiện nay đa số các trung tâm lớn

rã đông/tinh trùng sống trước đông thường đạt ≥50% nếu tỷ lệ tinh trùng sống
trước đông ≥ 50% [29],[51].
1.7.3. Đông noãn
Năm 1986, đứa bé đầu tiên ra đời từ noãn trữ lạnh. Đến năm 2004, trên
thế giới có khoảng 40 bé trữ lạnh noãn ra đời và khoảng 60 trường hợp đang
mang thai. Tỷ lệ thai lâm sàng từ các chu kỳ đông noãn còn thấp. Người ta
ước tính phải rã đông khoảng 100 noãn mới có một trường hợp mang thai
thành công. Noãn có thể trữ lạnh ở giai đoạn GV hoặc trưởng thành MII.
Nghiên cứu cho thất tỷ lệ sống sau rã đông của noãn giai đoạn GV cao hơn so
với giai đoạn MII. Tuy nhiên, noãn được đông ở giai đoạn GV sau khi rã lại
phải nuôi tiếp trong môi trường IVM đến giai đoạn trưởng thành. Nhìn chung,
tỷ lệ noãn sống sau rã đông khoảng 50-70%, tỷ lệ thụ tinh khoảng 50%[34].
Noãn sau khi rã đông noãn muốn thụ tinh được phải làm ICSI để khắc phục
khả năng thụ tinh thấp do thay đổi cấu trúc màng trong suốt khi đông lạnh.
1.7.4. Xin, cho phôi, noãn, tinh trùng [45].
Có nhiều trường hợp không có tinh trùng hoặc không có noãn, do vậy
cần phải dùng noãn hoặc tinh trùng của người cho. Một số trường hợp không
có phôi của chính mình mà muốn có con có thể xin phôi hiến. Các kỹ thuật
này được thực hiện với sự tham gia của “người thứ ba”, do vậy có nhiều vấn
đề liên quan về mặt pháp lý, đạo đức và quan niệm xã hội.
1.7.5. Mang thai hộ[23].
Mang thai hộ được áp dụng cho các trường hợp: không có tử cung hoặc
bị cắt tử cung, tử cung nhi hóa, tử cung có bất thường rõ ràng, có bệnh lý
không thể mang thai được.
25
Hiện tại, kỹ thuật này vẫn bị cấm ở Việt Nam và ở nhiều nước luật
mang thai hộ vẫn chưa được thông qua. Điều này có lẽ cũng là một thiệt thòi
lớn cho những người phụ nữ mà tử cung không có khả năng mang thai .
1.7.6. Hỗ trợ phôi thoát màng
Hỗ trợ thoát màng có thể được thực hiện từ các phôi ở giai đoạn phân