ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip

Sở GIO DC V O TO HNG YấN
TRNG THPT TIấN L
Sáng kiến kinh nghiệm
Nm hc: 2012 2013
Mụn: Sinh hc
Đề tài: ứng dụng công nghệ sinh học
thực vật trong nông nghiệp Ngời thực hiện: đỗ ngọc thái

Tiên Lữ, tháng 4 năm 2013

GV: Ngc Thỏi - 1 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
Mục lục
Tran
g
Phần A: Đặt vấn đề
I. Lí do chọn đề tài 2
II. Mục đích và yêu cầu của đề tài 2

5.2.1. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens.
27
5.2.2. Chuyển gen nhờ vi khuẩn đất Agrobacterium tumefaciens và virus.
28
5.2.3. Phơng pháp chuyển gen trực tiếp.
28
5.2.4. Phơng pháp chuyển gen nhờ sung gắn gen.
29
5.2.5. Phơng pháp chuyển gen bằng vi tiêm
29
5.3. ứng dụng kĩ thuật chuyển gen trong nông nghiệp
31
VI. Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam 31
VII. Kết quả nghiên cứu và thực nghiệm s phạm 33
VIII. Điều kiện áp dụng đề tài
Phần C: Kết luận và kiến nghị
I. Kết luận 34
II. Kiến nghị 34

GV: Ngc Thỏi - 2 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
III. Những hạn chế và hớng phát triển tiếp của đề tài 35
Tài liệu tham khảo
36
Phần A: đặt vấn đề
I. Lí do chọn đề tài

- Chuyển gen thực vật
- Thành tựu công nghệ sinh học thực vật ở Việt Nam
III. ý nghĩa thực tiễn của đề tài
Sự hoàn thiện đề tài này sẽ trở thành nguồn t liệu phong phú giúp cho mỗi giáo
viên và học sinh có cái nhìn toàn diện và sâu sắc về tầm quan trọng của ứng dụng công
nghệ sinh học thực vật trong nông nghiệp. Từ nhận thức đến hành động, biến mỗi giáo
viên và học sinh trở thành những kĩ thuật viên, tuyên truyền viên tích cực, cổ vũ cho sự
phát triển của ngành công nghệ sinh học nớc nhà.
Ngoài ra, đề tài này còn giúp giáo viên và học sinh dạy - học tốt môn Sinh học nói
chung và chuyên đề ứng dụng công nghệ sinh học nói riêng. Qua đó nâng cao tỉ lệ thi đỗ
vào chuyên ngành khối B của các trờng Đại học, Cao đẳng và Trung cấp chuyên nghiệp.
IV. Đối tợng và phạm vi nghiên cứu
Đối tợng nghiên cứu: Thực vật.
Phạm vi nghiên cứu: Công nghệ sinh học là môn khoa học đa ngành và đa lĩnh vực.
Tuy nhiên, với đề tài này tôi chỉ tập trung nghiên cứu ứng dụng của 5 lĩnh vực: nuôi cấy
mô, tạo cây đơn bội bằng nuôi cấy hạt phấn, chọn dòng tế bào, lai tế bào và kĩ thuật
chuyển gen ở thực vật. Vì đây là những kiến thức có liên quan trực tiếp đến vần đề dạy -
học và ôn thi đại học và cao đẳng của học sinh Trung học phổ thông.
V. Phơng pháp nghiên cứu
Phơng pháp nghiên cứu các tài liệu đợc lấy từ các nguồn thông tin nh giáo trình đại
học và cao học, các chuyên đề chuyên sâu dành cho bồi dỡng giáo viên các trờng chuyên,
internet, Rồi tiến hành tổng hợp, so sánh, đối chiếu các tài liệu để thực hiện đề tài.
Phơng pháp trao đổi kinh nghiệm, học hỏi các đồng nghiệp và các chuyên gia.
Phơng pháp tham gia các hội thảo về chuyên đề Công nghệ sinh học
Phơng pháp tham quan các cơ sở Công nghệ sinh học : Viện rau quả trung ơng,
Viện công nghệ sinh học, Khoa công nghệ sinh học,
Đặc biệt là trực tiếp làm thí nghiệm: trong thời gian học cao học, tôi đã trực tiếp

8
5
15
chồi/tháng). Đặc biệt là nhân chồi trong
môi trờng lỏng có lắc hoặc nhân trong các reactor.
Trong một số trờng hợp, vi nhân giống có thể thực hiện thông qua việc tạo phôi
hoặc tái sinh cây thẳng từ mô sẹo. Phơng pháp này cho hệ số nhân cao hơn, nhng thờng
kéo theo sự biến dị sôma nên trớc khi chuyển sang giai đoạn nhân đại trà cần kiểm tra kỹ
những thay đổi về di truyền.
Vi nhân giống có những u việt sau:
- Hệ số nhân cao, rút ngắn thời gian đa giống vào sản xuất.
- Nhân đợc một số lợng cây lớn trong một diện tích nhỏ. Trong 1 m
2
nền có thể để
đợc tới 18.000 cây.

GV: Ngc Thỏi - 5 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
- Cây đợc làm sạch bệnh và không tiếp xúc với các nguồn bệnh vì vậy bảo đảm các
cây giống sạch bệnh.
- Thuận tiện và hạ giá thành vận chuyển (một thùng 40.000 cây dâu tây chỉ nặng
15kg). Việc bảo quản cây giống cũng thuận lợi. Các cây giống giữ ở nhiệt độ 4
o
C trong
hàng tháng vẫn cho tỉ lệ sống đến 95%.
Nhu cầu về cây giống nhân in vitro ngày càng nhiều. Mấy năm gần đây, hàng năm


phát triển ở nhiệt độ thấp hoặc ngắn ngày với cờng độ chiếu sáng cao cho tỉ lệ tạo phôi từ
hạt phấn cao hơn.
ở một số loại cây hạt phấn ở giai đoạn nhân sớm cho tỉ lệ tạo phôi và mô cao, ở
một số giống khác thì hạt phấn ở giai đoạn mitos đầu cho hiệu quả tốt hơn. Vấn đề kiểu
gen cũng rất quan trọng, Jacobsen (1978) bao phấn của các cây khoai tây nhị bội tạo từ
cây đơn bội sử dụng để nuôi bao phấn có hiệu quả hơn so với bao phấn từ cây bố mẹ.
Ngoài ra, xử lí bao phấn ở nhiệt độ thấp (3 - 10
o
C) cũng gia tăng tỉ lệ tạo mô và phôi từ
hạt phấn (Wenzel & cs, 1977).
2.1.2.Các yếu tố liên quan đến điều kiện nuôi cấy in vitro
Thành phần cacbonhydrat trong môi trờng hết sức quan trọng, đặc biệt là đờng
sucrose khi nuôi cấy bao phấn thuốc lá cần từ 2% - 4%. Đối với khoai tây và lúa cần đến
6%, thậm chí 12%.
Trong các chất hữu cơ, các axit nh glutamic có tác dụng kích thích phát triển phôi
ở một số giống cải và thuốc lá, serin đặc biệt cần cho phát triển phôi từ hạt phấn thuốc lá.
Các dịch chiết tự nhiên nh dịch chiết khoai tây, dịch chiết nấm và một số chất khác nh
vitamin C, nớc dừa có tác dụng tích cực cho tạo phôi, mô sẹo và tái sinh cây trong nuôi
cấy bao phấn.
Auxin đặc biệt quan trọng cho tạo mô sẹo nhng lại ức chế tạo phôi. Vì thế trong tr-
ờng hợp tạo phôi cần tránh sử dụng auxin. Nói chung auxin thờng có tác dụng ở giai đoạn
nuôi cấy ban đầu. Xytokinin cực kì quan trọng cho phản ứng của hạt phấn nuôi cấy.
Trong một số ít trờng hợp etylen kích thích tạo mô sẹo. Wilson & cs (1978) cho biết nuôi
cấy bao phấn trong môi trờng lỏng làm tăng tần số tạo phôi ở thuốc lá và lúa mạch.
Bổ sung vào môi trờng than hoạt tính có tác dụng loại bỏ các chất ức chế và làm
tăng hiệu quả nuôi cấy bao phấn.
Đối với nuôi cấy hạt phấn, mật độ hạt thích hợp làm tăng hiệu quả nuôi cấy. Đối
với thuốc lá mật độ tối u là 10
5

Mô già do lâu không cấy chuyển hoặc mô qua cấy chuyển nhiều lần thờng cho tỉ lệ
tái sinh cây thấp hoặc mất khả năng tái sinh. Khi nuôi cấy bao phấn, các cây ngũ cốc th-
ờng có hiện tợng tái sinh nhiều cây bạch tạng (có khi đến 50%). Wang và cs (1977) thấy
rằng tăng nhiệt độ và nồng độ 2,4D là nguyên nhân dẫn đến tỉ lệ cây bạch tạng cao. Ngoài
ra, cây bạch tạng xuất hiện nhiều từ các bao phấn chứa nhiều vi nhân (Teng Li-Ping,
1978).
Phần lớn cây tái sinh từ hạt phấn là cây đơn bội, nhng ở một số loài cây có cả cây
nhị bội và đa bội. Những kết quả nghiên cứu tế bào học cho thấy sự tạo thành các cây nhị
bội và đa bội là do kết quả của dung hợp nhân hoặc nhân bản di truyền mà không có sự
phân chia nhân xảy ra trong quá trình nuôi cấy.
2.3. ứng dụng cây đơn bội từ hạt phấn
Các cây đơn bội từ hạt phấn có ý nghĩa thực tiễn lớn, trớc hết là làm nguyên liệu để
tạo các dòng thuần. Muốn tạo dòng thuần phải lỡng bội hóa các cây đơn bội bằng xử lí
consixin hoặc thông qua tạo mô sẹo từ các cây đơn bội sau đó tái sinh cây. Nh đã nói trên,
ở một số loại cây có thể nhận đợc cây nhị bội ngay trong quá trình nuôi cấy bao phấn
hoặc hạt phấn, nhng trong trờng hợp này cần kiểm tra sinh hóa và tế bào học kỹ lỡng.

GV: Ngc Thỏi - 8 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
Các dòng thuần có ý nghĩa rất lớn trong cải biến cây trồng. Chúng đợc sử dụng tạo
các cây lai khỏe mạnh từ các cặp lai giữa bố mẹ bất tơng hợp ( Chu & cs, 1978) và rút
ngắn thời gian tạo hạt lai. Các dòng đơn bội kép đã tạo đợc ứng dụng trong sản xuất lúa
mạch, thuốc lá, cải dầu, lúa Trong thời gian ngắn khoảng 3 đến 4 năm hai giống thuốc
lá cho năng suất cao và chất lợng tuyệt hảo đã đợc tạo ra bằng phơng pháp cấy bao phấn
(Hu han & cs, 1978). Nhiều giống lúa mới nh Huayu1, Huayu2, Tanfong1 (Yin & cs,
1976), những giống lúa mì Huapei1, Lunghua1 (Tsun, 1978) cũng đã đợc tạo bằng phơng


đấy cũng diễn ra những thay đổi về kiểu gen, kiểu hình và tuổi. Khi những tế bào đợc tái
sinh thành cây sẽ thể hiện những thay đổi đó ở mức độ cơ thể, thậm chí có những quần
thể tế bào phát triển từ một tế bào ban đầu nhng trong suốt quá trình sinh trởng và phát
triển tế bào đến khi hình thành một cơ thể hoàn chỉnh có thể diễn ra nhiều thay đổi về di
truyền do ảnh hởng của các yếu tố trong môi trờng nuôi cấy, đặc biệt là các chất điều hòa
sinh trởng. Mặt khác, cũng có các quần thể tế bào đồng đều về mặt sinh lý, di truyền và
phát triển, những quần thể tế bào này là đối tợng hết sức lí tởng trong việc sử dụng các
chất gây đột biến để thu nhận các đột biến có ý nghĩa. Cũng nh cây trồng, trong nuôi cấy
mô và tế bào, có thể quan sát thấy hai loại thay đổi kiểu hình. Một loại là kết quả của sự
thay đổi gen, đợc gọi là những thay đổi di truyền, còn một loại không liên quan đến thay
đổi gen, đợc gọi là biến đổi ngoài gen. Những thay đổi ngoài gen không di truyền đợc.
Ngoài những vấn đề vừa nêu, trong nuôi cấy mô và tế bào còn gặp một hiện tợng
phổ biến là: một phần đáng kể mô hoặc cây tái sinh từ cụm tế bào thậm chí từ một tế bào
có thể thay đổi một số đặc điểm mà không cần áp dụng các phơng pháp chọn lọc nào.
Hiện tợng này gọi là hiện tợng phân dòng sôma. Có tác giả gọi các dòng cây tái sinh từ tế
bào nuôi cấy là calliclones (Skirvin & cs, 1976), tác giả khác gọi các dòng cây tái sinh
từ protoplast là protoclones (Sheppard & cs, 1980). Larkin va Scowcroft (1981) đa ra
một định nghĩa có tính chất khái quát hơn somaclonal variation để chỉ tất cả những thay
đổi của cây tái sinh từ bất kỳ loại tế bào nuôi cấy nào.
3.2. Vật liệu và phơng pháp chọn dòng
Chọn vật liệu cho các thí nghiệm CDTBTV là rất quan trọng. Các vật liệu có thể là
tế bào cho đến các mô phân hóa. Mỗi loại vật liệu có những u điểm và nhợc điểm riêng.
Việc chọn vật liệu này hay vật liệu khác còn phụ thuộc vào sự thuần phục của các phơng
pháp nuôi cấy đối với từng loại cây.
Vật liệu thờng dùng hơn cả trong CDTBTV là mô sẹo (callus). Mô sẹo đợc dùng
để chọn các dòng chống chịu nh chịu bệnh (Chawla & Wenzel, 1987), chịu muối
(McHughen, 1987; Kavi Kishor, 1988), và chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp
cao (Nozue và cs, 1987; Hiraoka, 1986).
Đối với mô sẹo có thể sử dụng các phơng pháp chọn lọc trực tiếp tức là chọn trên

và tích lũy các chất thứ cấp thì phù hợp hơn. Trong trờng hợp này thì tế bào dịch lỏng đáp
ứng đợc mục đích nuôi cấy tế bào trên qui mô lớn đặc biệt là việc sử dụng các công nghệ
nuôi tế bào thực vật trên qui mô công nghiệp.
Protoplast (tế bào trần) thực vật là nguyên liệu có thể đáp ứng đợc nhiều mặt trong
CDTBTV. Protoplast là hệ thống tế bào đơn triệt để nhất. Từng tế bào đợc phát triển đồng
đều trong môi trờng, mỗi tế bào phân chia tạo ra các quần thể tế bào và mô sẹo, cuối cùng
là các mô sẹo tái sinh thành cây hoàn chỉnh, chính vì thế có thể tránh đợc hiện tợng khảm.
Nhiều dòng tế bào kháng thuốc (Cseplo & cs, 1985; Blonstein & cs, 1988; Hamill & cs,
1986) và các dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao (Fujita & cs, 1985) đã đợc chọn lọc
nhờ sử dụng hệ thống protoplast.
Trớc đây việc nuôi cấy và tái sinh cây từ protoplast còn gặp nhiều khó khăn, nhất
là tái sinh cây từ protoplast của những loài cây có ý nghĩa kinh tế, nên việc sử dụng hệ
thống nuôi cấy protoplat trong CDTBTV còn bị hạn chế. Hiện nay hệ thống nuôi cấy

GV: Ngc Thỏi - 11 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
protoplast với hiệu quả cao ở nhiều loài cây trong đó có cả các cây trồng quan trọng nh
khoai tây, cà chua, ngô, lúa, lúa mì đã đợc công bố. Vì vậy protoplast sẽ trở thành vật liệu
lý tởng cho CDTBTV. Cần phải nói thêm rằng protoplast còn là đối tợng quan trọng trong
cải biến di truyền thực vật thông qua hệt thống nuôi cấy in vitro đặc biệt là dung hợp tế
bào và chuyển gen.
Để tránh những khó khăn trong tái sinh cây từ mô sẹo, tế bào nuôi cấy dịch lỏng và
protoplast, một số tác giả đã sử dụng các mô phân hóa hoặc mô tách rời làm nguyên liệu
CDTBTV. Một trong những mô phân hóa đợc sử dụng là phôi từ hạt (Kueh & Bright,
1981) hoặc phôi phát triển từ tế bào nuôi cấy (Chandler & Vasil, 1984). Fluhr & cs
(1985) đã chọn đợc dòng kháng thuốc khi xử lí mầm bằng kháng sinh. McCabe & cs

Từ 1970 đã có nhiều nghiên cứu cho thấy kỹ thuật CDTBTV in vitro có thể khắc
phục đợc nhiều vấn đề trong chọn dòng chịu bệnh nh: qui mô thí nghiệm, thời gian chọn
lọc, khống chế đợc điều kiện gây nhiễm. Ngoài ra có thể nhận đợc các đột biến đơn gen
và đột biến lặn. Nếu tần số đột biến đơn gen trong trờng hợp đột biến thực nghiệm là 10
-4
- 10
-6
thì ở quần thể cây tái sinh (R
o
) từ mô hoặc tế bào lên tới 0,2-0,5% (Larkin &
Scowcroft, 1981). Nếu kết hợp xử lí các tác nhân gây đột biến trong nuôi cấy in vitro có
thể làm tăng tần số đột biến hơn nữa ( Maliga & cs, 1981).
Tuy nhiên chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro có một số vấn đề cần
nghiên cứu giải quyết nh vấn đề tơng hợp giữa chủ và tác nhân gây bệnh vì đối tợng lây
nhiễm ở đây là mô sẹo hoặc tế bào chứ không phải là cây trong tự nhiên vì thế tác nhân
gây bệnh không nhận ra chủ (nhất là đối với các nấm kháng sinh).
Để chọn dòng chịu bệnh có thể sử dụng trực tiếp tác nhân gây bệnh hoặc các độc
tố gây bệnh (ĐTGB).
Phần lớn tác nhân gây bệnh đã đợc sử dụng là virus và đối tợng đợc lây nhiễm là
protoplast. Vấn đề then chốt là phải tạo đợc quần thể tế bào bị nhiễm đồng đều và phân
biệt đợc tế bào chịu bệnh với tế bào không bị nhiễm vì cả hai đều có khả năng phát triển
trên cùng một điều kiện nuôi cấy. Để giải quyết các vấn đề trên, Shepard (1975),
Murakishi và Carlson (1982) đã tách protoplast từ cây bị lây nhiễm liên tục, sau đó nuôi
vấy và chọn lọc. Murakishi và Carlson còn sử dụng chủng virus (TMV-Flavum) có màu
vàng lây nhiễm cây thuốc lá đơn đơn bội, sau đó cấy mảnh lá lên môi trờng phù hợp cho
sự sinh trởng của tế bào sạch virus hoặc kháng virus. Các tác giả thấy rằng mô từ tế bào
sạch virus sinh trởng nhanh và có màu xanh, còn tế bào kháng virus sinh trởng chậm hơn

(Carlson, 1973).
Bên cạnh những u điểm của ĐTGB, trong chọn dòng chịu bệnh cần lu ý một số vấn
đề nh xác định cụ thể vai trò của độc tố trong quá trình gây bệnh vì trong nhiều trờng hợp
cây bị bệnh nhng không phát hiện có độc tố hoặc xác định đợc trong cây có độc tố gây
bệnh nhng độc tố lại không có vai trò trong việc gây bệnh (Scheffer, 1983). Một vấn đề
nữa là trong nhiều trờng hợp cây tái sinh từ mô kháng ĐTGB lại không có khả năng
kháng bệnh. Để khắc phục vấn đề này, Meredith (1984) cho rằng mặc dù có những đặc
điểm có thể không thể hiện ở cây tái sinh, nhng nếu ta tái sinh đợc số lợng cây nhiều đến
mức cần thiết thì cũng có thể có những cây mang những đặc điểm mong đợi. Điều này đã
đợc khẳng định bằng công trình của Thanutong & cs (1983). Các tác giả đã nhận đợc 10-
20% số cây tái sinh có khả năng kháng độc tố của Pseudomonas và độc tố của Alternaria.
ĐTGB dùng trong chọn dòng chịu bệnh có thể là dạng thô hoặc tinh khiết. ĐTGB
thô dới dạng dịch chiết từ nấm hoặc vi khuẩn đợc sử dụng nhiều để chọn dòng chịu bệnh.
Nhiều dòng cây kháng ĐTGB đã đợc công bố khi sử dụng ĐTGB thô nh khoai tây kháng
P.infestas (Behnke, 1979), thuốc lá kháng Alternarria alternata f.sp.tabaci, thuốc lá
kháng Pseudomonas syringe pv-tabaci (Thanutong, 1983), alffa kháng F.oxysporum
f.sp.medicaginis (Hartman et al, 1984). Brettel & cs (1980), Rines và Luke (1985) đã
nhận đợc dòng ngô kháng H.maydis r.t và dòng lúa mạch kháng H.victoriae khi sử dụng
độc tố sạch (tinh khiết) từ hai loại nấm trên.

GV: Ngc Thỏi - 14 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
Ngoài phơng pháp chọn dòng chịu bệnh trong điều kiện in vitro, bằng xử lí tế bào,
mô hoặc cây tái sinh từ tế bào và mô với virus, nấm, vi khuẩn gây bệnh hoặc ĐTGB, ứng
dụng khả năng phân dòng sôma của cây tái sinh từ tế bào hoặc mô, ta có thể chọn đợc
dòng chịu bệnh mà không cần xử lí tác nhân gây bệnh. Nhiều tác giả (Bretter & cs, 1980;


ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
Ngoài ra do việc cải tạo môi trờng nh tới tiêu, bón phân, sử dụng các chất diệt sâu bọ và
diệt cỏ cũng dẫn đến việc cần thiết chọn tạo các giống cây trồng chống chịu với các tác
nhân trên.
Nh đã trình bày ở các phần trên, nuôi cấy mô và tế bào có thể đóng góp một phần
trong việc tạo chọn các dòng chống chịu các stress môi trờng. Trớc khi giới thiệu một số
thành tựu trong lĩng vực này chúng tôi đề cập đến một số vấn đề liên quan đến cơ sở cũng
nh phơng pháp chọn các dòng chống chịu stress môi trờng. Ngoài một số vấn đề chung đ-
ợc đề cập ở các phần chọn dòng chịu bệnh và dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao,
chọn dòng chống chịu stress môi trờng còn có một số vấn đề liên quan đến cơ sở của tính
chống chịu ở mức độ tế bào và ở cây hoàn chỉnh. Đặc biệt là cơ sở di truyền của tính
chống chịu stress môi trờng còn cha đợc biết rõ.Nhiều tác giả cho rằng có thể có nhiều
alen tham gia vào tính chống chịu stress môi trờng, ngoài ra các alen này thờng là lặn nên
không thể hiện trong trờng hợp dị hợp tử. Đây là những vấn đề làm cho việc chọn các
dòng chống chịu stress môi trờng cha có đợc những thành tựu mong muốn. Ngoài ra một
số vấn đề quan trọng nữa là tơng quan giữa khả năng chống chịu các stress môi trờng ở
cây hoàn chỉnh và tế bào nuôi cấy rất phức tạp vì thế chọn dòng bằng nuôi cấy mô có thể
không tạo đợc cây chống chịu những điều kiện đặc biệt trên đồng ruộng. Mặc dù có một
số vấn đề hết sức quan trọng đợc nêu ở trên, thực tế vẫn có những cơ sở và số liệu đáng
tin cậy về triển vọng ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào để chọn các dòng chống chịu với
các stress môi trờng: chúng ta đều biết nhiều đặc điểm đa gen có thể biến đổi bởi đột biến
xảy ra ở một trong các gen tham gia vào đặc điểm này. Những kết quả nghiên cứu của
Gorham và cs ( 1987 ) và Ashraf và cs ( 1986 ) đã cho thấy tính chống chịu với một số
stress liên quan đến thay đổi nhiễm sắc thể và di truyền qua thế hệ sau. Ngoài ra đã có
những số liệu về sự phân ly theo Mendel của các đặc điểm đợc chọn lọc (Comner &
Meredits, 1985).

Lộc & cs, 1990). Kết quả nghiên cứu của một số tác giả cho thấy abscisic axit (ABA) là
chất có liên quan đến việc tổng hợp các protein mới (đặc biệt là protein với phân tử lợng
26) xuất hiện ở các dòng chịu muối (Sigh & cs, 1987). Mối tơng quan giữa ABA, tính
chịu muối và sự tổng hợp các protein đặc biệt là vấn đề nghiên cứu hết sức lý thú trong
những năm tới. Các dòng chịu hạn đã đợc thông báo (Bressan & cs, 1981, Hand & cs,
1983), các tác giả đã sử dụng chất gây hạn PEG 4000 hoặc PEG 6000 đa vào môi trờng
để chọn. Vấn đề tạo dòng kháng nhôm đợc Couner và cs nghiên cứu khá tỉ mỉ (Conner &
Meredith, 1985). Các tác giả đã chọn đợc các dòng thuốc lá kháng nhôm ổn định, tính
kháng nhôm là đặc điểm trội và di truyền qua thế hệ sau. Việc chọn các dòng chống chịu
với nhiệt độ thấp hoặc cao cũng đã có tiến bộ: Preil và cs. (1983) đã nhận đợc các cây cúc
chịu đợc nhiệt độ thấp. Nhìn chung phần lớn các nghiên cứu từ trớc đến nay đều tập trung
vào tìm cơ chế của tính chịu lạnh và chịu nóng. Những kết quả của Chen và Gusta (198)
nhận đợc trên Triticum aetivum L, Secale cereale L, và Bromus inermis Leyss cho thấy
ABA làm tăng khả năng chịu lạnh đáng kể. Các tác giả cho rằng ABA là chất cần thiết để
tạo dòng chịu lạnh. Orr và cs cũng nhận đợc những kết quả tơng tự về tác dụng của ABA.
Cả tính chịu lạnh và tính chịu nhiệt đều liên quan đến việc tổng hợp hàng loạt các protein
mới nhng vai trò cụ thể của từng loại protein mới này nh thế nào? Chúng có vai trò gì
trong quá trình chịu lạnh và chịu nhiệt cao? Đây là những câu hỏi còn đang để ngỏ.

GV: Ngc Thỏi - 17 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
Chọn dòng chống chịu stress môi trờng là yêu cầu chiến lợc trong công tác giống
cây trồng nhng cho đến nay phần lớn các công trình tập trung vào tìm kiếm các phơng
pháp chọn lọc và tìm ra cơ chế của loại chống chịu này. Những kết quả nhận đợc mới chỉ
là những cơ sở hết sức ban đầu. Để có đợc những thành công trong tơng lai và có đợc
những áp dụng vào thực tiễn những nghiên cứu thuộc hai hớng trên vẫn là điều quan tâm

Để thiết lập một hệ thống chọn các dòng tế bào cho năng suất các chất thứ cấp cao
thành công, việc nghiên cứu các yếu tố liên quan đến tích lũy các chất trong tế bào nuôi
cấy là rất quan trọng, mặc dù vấn đề này cho đến nay vẫn cha đợc sáng tỏ.Tuy nhiên vai
trò của các chất điều hoà sinh trởng và nồng độ đờng đã đợc ghi nhận. Hàm lợng các chất
thứ cấp trong tế bào còn phụ thuộc vào tăng trởng về sinh khối, tốc độ tổng hợp và tiết ra
môi trờng của các chất này.
Thờng thờng tế bào nuôi cấy tích lũy các chất thứ cấp ở giai đoạn cuối của chu kỳ
sinh trởng (Zenk & cs, 1977) vì thế tế bào nuôi cấy có tốc độ sinh trởng nhanh và không
kèm theo sự gia tăng tốc độ tổng hợp các chất thứ cấp. Những tế bào nuôi cấy có tốc độ
phân chia chậm thì có u thế hơn trong việc tạo các chất thứ cấp.
Vật liệu khởi đầu cho chọn dòng cho năng suất các chất thứ cấp cao là một vấn đề
đợc nhiều tác giả quan tâm. Zenk (1978) nhận thấy tế bào dịch lỏng từ cây C.roseur có
năng suất cao cho hàm lợng chất thứ cấp cao hơn tế bào dịch lỏng từ cây có năng suất
thấp. Cũng trên đối tợng này Roller (1978) lại nhận thấy tế bào nuôi cấy từ cây có năng
suất cao không phải lúc nào cũng cho năng suất chất thứ cấp cao. Kết quả này cũng đợc
công bố trên những loài cây khác (Bohm 1977, 1980, Kurz & Constabel, 1979). Cho đến
nay vẫn cha có chứng minh chắc chắn về tơng quan giữa năng suất của cây làm nguyên
liệu và năng suất của tế bào nuôi cấy. Theo Wilson (1990) nên sử dụng những cây đa
dạng về di truyền để tạo dòng tế bào khởi đầu.
Một số tác giả thấy rằng các bộ phận khác nhau của cây dùng để tạo ra các dòng tế
bào không ảnh hởng tới năng suất các chất thứ cấp (Speake & cs, 1964). Nhiều tác giả
khác lại nhận đợc các kết quả cho thấy các dòng tế bào từ các bộ phận khác nhau của cây,
thậm chí từ cùng một bộ phận cũng cho năng suất các chất thứ cấp khác nhau (Zenk & cs,
1975; Constabel & cs, 1981; Kinnersley, 1982). Hall và Yeoman (1987) còn cho biết
trong quần thể tế bào nuôi cấy khả năng tổng hợp các chất (đặc biệt là đối với các chất
màu) cũng khác nhau giữa các tế bào. Những sự biến động về tích lũy các chất thứ cấp
này là những cơ sở để tìm các phơng pháp phù hợp cho việc chọn ra các dòng cho năng

1989).
Thực vật là nguồn cung cấp nhiều chất sinh học quan trọng sử dụng trong công
nghiệp dợc, công nghiệp thực phẩm và mỹ phẩm. Các chất này rất khó tổng hợp và hiện
nay nguồn cung cấp chủ yếu vẫn là từ cây trồng. Việc sử dụng tế bào nuôi cấy để tăng
nguồn cung cấp hoặc thay thế việc trồng trọt các cây cho những chất này đang đợc quan
tâm đặc biệt. Vấn đề tìm ra các phơng pháp chọn các dòng cho năng suất các chất thứ cấp
cao là khâu then chốt để đa nuôi cấy tế bào thực vật lên quy mô công nghiệp. Những
thành tích đạt đợc trong lĩnh vực này đặc biệt là việc công nghiệp hoá sản xuất Shikonin
bằng tế bào nuôi cấy là những tiền đề cho việc sử dụng tế bào thực vật nuôi cấy để nhận
các chất thứ cấp có giá trị kinh tế cao.
ở Việt Nam các nghiên cứu liên quan đến vấn đề thu nhận các chất thứ cấp đã đợc
bắt đầu từ những năm 80 trên các đối tợng thuốc lá, tam thất, thanh hao, taxus. Năm
1988, Phan Huy Bảo và cs đã thông báo chọn đợc dòng tam thất cho hàm lợng saponin
cao. Những thay đổi về hàm lợng nicotine liên quan đến quá trình phân hoá mô và cây tái
sinh cũng đã đợc công bố (Nguyễn Đức Thành và cs, 1991 ).

GV: Ngc Thỏi - 20 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
iv. lai tế bào
4.1. Dung hợp protoplast và lai nhân.
Do không có vách xellulô nên protoplast (tế bào trần) trở thành một đối tợng lý t-
ởng trong việc nghiên cứu biến đổi di truyền ở thực vật. Bằng phơng pháp dung hợp hai
loại protoplast có thể tạo đơc các cây lai sôma (lai nhân hoặc lai tế bào chất). Ngoài ra có
thể sử dụng kỹ thuật dung hợp protoplast để chuyển các bào quan nh nhân, lục lạp, ty thể
hoặc chuyển các vectơ mang các gen mã hoá cho một số đặc điểm biết trớc.
Protoplast có thể dung hợp tự nhiên. Hiện tợng này thờng xảy ra sau khi tách

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
Cuối những năm 70 và đầu 80 một số tác giả đã đa ra phơng pháp dung hợp bằng
dòng điện (Sanda & cs, 1979; Zimmermann & Sheurich, 1981; Zimmermann, 1982;
Zimmermann & Vienken, 1982; Vienken & cs, 1983). Bằng phơng pháp này, các tác giả
đã đạt đợc tần số dung hợp tới 60 và 80%. Tuy tần số dung hợp có cao nhng vấn đề tái
sinh các sản phẩm dung hợp lại gặp khó khăn. Chỉ gần đây một số tác giả mới nhận đợc
cây tái sinh sau khi sử dụng phơng pháp dung hợp này (Kohn & cs, 1985).
Khi dung hợp hai loại protoplast với nhau thờng có ba nguồn gen tham gia (nhân,
lục lạp, ty thể) đợc kết hợp trong các sản phẩm dung hợp. Nếu dung hợp hai loại
protoplast giống nhau ta sẽ tạo đợc các sản phẩm đồng hợp gen (homogenome). Trong tr-
ờng hợp dung hợp hai loại protoplast khác nhau sẽ tạo ra sản phẩm dị hợp gen
(heterogenome). Các sản phẩm đồng hợp gen sẽ tạo ra các kiểu hình giống nh bố mẹ nhng
với mức bội thể gấp đôi. Các sản phẩm dị hợp gen sẽ tạo ra tế bào dị nhân với hỗn hợp lục
lạp và ty thể. Một trong hai nhân có thể bị thoái hoá hoặc cả hai đều phân ly trong quá
trình phân chia tế bào. Sự thoái hoá hoặc phân ly của một nhân trong tế bào dị hợp gen sẽ
tạo ra những tế bào chứa tế bào chất của cả hai loại protoplast và chỉ có một nhân. Những
tế bào kiểu này đợc gọi là các thể lai tế bào chất.
Muốn chọn các thể lai sôma bằng dung hợp protoplast có thể sử dụng các đặc điểm
phối hợp, các đặc điểm kháng sinh hoá và các đột biến sắc tố, ngoài ra có thể sử dụng các
đặc điểm khác nhau tự nhiên giữa các loại protoplast.
Melcher là ngời đầu tiên sử dụng sự phối hợp hai đột biến bạch tạng để chọn sản
phẩm dung hợp ở thuốc lá (Melchers & Labil, 1974). Một số tác giả khác đã sử dụng ph-
ơng pháp tơng tự trong các thí nghiệm lai giữa các cây dại trên cùng loài nh P.innoxia
(Schieder, 1977) và các cây khác loài nh P Parodii + P.Hybrida (Cocking 1978), N.
Tabacum + N. Glauca (Evans & cs, 1978). Sự phối hợp các đột biến tự dỡng nh thiếu
nitrate reductase, thiếu các axit amin và vitamin hoặc mẫn cảm với nhiệt độ đã đợc nhiều
tác giả sử dụng có kết quả (Schieder, 1974; Glimelius & cs, 1978; Muller & Grafe, 1978;

Gần đây các nhà nghiên cứu đã tạo đợc cây lai sôma ở cả những giống cây trồng có ý
nghĩa kinh tế nh khoai tây, cà chua và lúa (Handley & cs, 1986; OConnell & Hasnon,
1986; Ausutin & cs, 1985, 1986; Terada & cs, 1987; Guri cs, 1988). Qua đây ta thấy đợc
triển vọng lớn lao của việc ứng dụng phơng pháp này để cải biến di truyền ở thực vật
nhằm tạo ra giống cây đáp ứng với yêu cầu đòi hỏi của thực tiễn.
4.2. Lai tế bào chất
Ngoài việc tạo ra các thể lai sôma chứa dị hợp nhân, dung hợp protoplast còn có
thể tạo đợc các thể lai tế bào chất (hay còn gọi là lai sinh chất). Trong những năm gần đây
nhiều phòng thí nghiệm ở Pháp, Thụy Điển, Canada, Ixraen, Nga, Ucrain và Hungary đã
đầu t nhiều cho các nghiên cứu trong lĩnh vực này, vì đến nay một số các đặc điểm chống
chịu của thực vật đợc chứng minh liên quan đến vật chất di truyền tế bào chất.
Trong thời kỳ đầu, các nhà nghiên cứu đã cố gắng tạo các thể lai tế bào chất bằng
cách đa các bào quan tách rời vào protoplast. Potrykus là ngời đầu tiên công bố chuyển đ-

GV: Ngc Thỏi - 23 - Trng THPT Tiờn L

ti: ng dng cụng ngh sinh hc thc vt trong nụng nghip
ợc lục lạp vào protoplast của Petunia hybrida (cây dạ yên) nhng không có những số liệu
chứng minh chắc chắn sự tồn tại của lục lạp trong tế bào (Potrykus, 1973). Những công
trình của Carlson (1973), Bonnet & Erikson (1974 ) và Kung ( 1975) cũng ở tình trạng t-
ơng tự.
Vasil và vợ của ông đã công bố kết quả chuyển ty thể từ cây bất dục đực (BDĐ) ở
cây ngô và cây Dã yên vào protoplast của cây bình thờng và tái sinh đợc cây (Vasil &
Vasil, 1974; Vasil, 1976). Các tác giả còn xác định đợc gen điều khiển tính BDĐ ở ngô.
Những công trình trên đã đi vào lịch sử. Từ đó đến nay không có những công bố
tiếp theo. Sở dĩ nh vậy là do những hạn chế về việc tách nhận các bào quan nguyên vẹn và
giữ nguyên hoạt động của chúng. Đây là vấn đề hết sức khó khăn vì trong quá trình tách

đột biến kháng sinh hoá nh kháng một số độc tố nấm (Aviv & cs, 1980; Flick & cs,
1985), các đột biến kháng thuốc (Medgyesy & cs, 1980; Maliga cs, 1982; Cseplo &
Maliga, 1982; Cseplo & cs, 1984) và các đột biến kháng chất diệt cỏ ( Gressel 1984).
Đại phân tử của enzim ribulozo 1, 5 difotfat carbonxylase đợc tổng hợp nhờ thông
tin di truyền lục lạp đã đợc sử dụng để nghiên cứu sinh hoá lục lạp (Kung & cs, 1975).
Phơng pháp phân tích sinh hoá chính xác hơn nữa đó là phơng pháp phân tích điện di đồ
của ADN lục lạp (cpADN) sau khi dùng các enzim cắt giới hạn, cắt cpADN thành những
đoạn khác nhau và phân lập các đoạn cắt này bằng điện di (Belliard & cs, 1978). Hiện nay
phơng pháp này đợc sử dụng rộng rãi ở nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới. Ngoài khả
năng sử dụng với bất kỳ tổ hợp lai nào, phuơng pháp này còn rất chính xác nó cho phép
xác định đợc 1% hỗn hợp của cpADN.
Khác với lục lạp các đặc điểm liên quan tới ty thể không có những chỉ thị để chọn
trong khi nuôi cấy in vitro. Một số tác giả đã dùng chỉ thị lục lạp để chọn (Medgyesy &
cs, 1980; Menczel & cs, 1982). Trờng hợp này chỉ sử dụng đợc khi lục lạp và ty thể liên
kết với nhau theo một cơ chế nào đó.
Nghiên cứu hình thái của hoa có thể gíup cho việc xác định ty thể ngoại lai trong
các cây lai. Tính BDĐ cũng đã đợc sử dụng làm chỉ thị để chọn đặc điểm ty thể ở thuốc lá
(Belliard & cs, 1979) và Dã yên (Izhar & Power, 1979; Izhar & Tabib, 1980).
Giống nh lục lạp phơng pháp phân tích điện di đồ của ADN ty thể (mtADN) cũng
đợc sử dụng rộng rãi để xác định ty thể trong cây lai tế bào chất. Belliard và cs đã dùng
phơng pháp này để nghiên cứu ty thể ở những cây lai trong thí nghiệm dung hợp
protoplast thuốc lá và đã phát hiện thấy sự tái tổ hợp của mtADN trong các cây lai
(Belliard & cs, 1979). Tiếp sau đó Nagy và cs (1981), Galun và cs (1982) và nhiều tác giả
khác đã sử dụng những phân tích mtADN để nghiên cứu và theo dõi hoạt động của ty thể
ở các cây lai tế bào chất.
Số phận của lục lạp cũng nh ty thể ngoại lai trong cơ thể lai tế bào chất là một vấn
đề đợc các nhà nghiên cứu quan tâm hàng đầu vì việc biến đổi di truyền tế bào chất chỉ có
ý nghĩa khi những thông tin di truyền lục lạp và ty thể ngoại lai tồn tại và hoạt động bình
thờng trong cơ thể lai.
Những kết quả đầu tiên của Kung (Kung & cs, 1975, 1977) và Chen (Chen & cs,