ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
TRẦN THỊ THANH TÚ
SO SÁNH ĐẶC ĐIỂM VI HỌC, THÀNH PHẦN HÓA HỌC,
VÀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY THIÊN NIÊN KIỆN
Ở CÔN ĐẢO VỚI THIÊN NIÊN KIỆN DƯỢC DỤNG
(Homalomena occulta (Lour.) Schott)
Chuyên ngành: SHTN – Hướng Hóa Sinh
Mã số : 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
có mặt của con luôn là thành công lớn nhất của đời mẹ.
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 12 – 2011
MỞ ĐẦU
Chi Thiên niên kiện (Homalomena) thuộc họ Ráy (Araceae) là một chi lớn, bao
gồm nhiều loài được dùng làm thuốc. Homalomena occulta (Lour.) Schott, hoặc
Homalomena aromatica Schott là một trong số loài thuộc chi này có tính dược dụng rất
cao. Loài này thuộc loại cây thảo to, mập, thân rễ dài, có mùi thơm, lá to mọc từ thân
gốc hình tim, cụm hoa hình bông mo; phân bố khá rộng, phổ biến ở các tỉnh Nam
Trung Quốc đến các nước trên bán đảo Đông Dương và khu vực Đông Nam Á Ở Việt
Nam, phân bố chủ y
ếu ở các tỉnh vùng núi, cả ở miền Nam lẫn miền Bắc. Độ cao phân
bố từ 300 -700 m hoặc hơn.
Thiên niên kiện được xếp vào loại cây thuốc quý, đóng vai trò quan trọng trong
các bài thuốc cổ truyền của Việt Nam cũng như một số nước khác như Trung Quốc, Ấn
Độ, Malaysia… Thiên niên kiện được dùng chữa thấp khớp, tay chân và các khớp
xương nhức mỏi hoặc co quắp tê bại, rất tố
t cho những người cao tuổi, già yếu; chữa
đau dạ dày, làm thuốc kích thích tiêu hóa; toàn cây được dùng chữa bệnh ngoài da …
Ngoài ra, thân rễ Thiên niên kiện được dùng làm chất thơm và kích thích, bột thân rễ
cho vào thuốc lá hoặc trong thành phần các thuốc bột để hít, tinh dầu Thiên niên kiện
được dùng làm hương liệu trong kỹ nghệ nước hoa, làm dầu xoa bóp…
Hiện nay, đã có những công trình nghiên cứu trong nước và ngoài nước chứng
minh được tính dược dụng của loài cây này. Tuy nhiên, chúng chưa nhiều, chưa phổ
biến và chưa đáp ứng triệt để nhu cầu sức khỏe con người. Có những nghiên cứu cụ thể
như: tách chiết và phân tích thành phần hóa học tinh dầu, tìm các chất mới thuộc nhóm
sesquiterpenoid trong thân rễ loài dược liệu này và chứng minh hoạt tính sinh học của
1.1.2. Phân loại khoa học 1
1.1.3. Hình thái học 2
1.1.4. Sinh thái học và phân bố 2
1.1.5. Thành phần hóa học 4
1.1.6. Công dụng và bộ phận dùng 4
1.1.7. Bài thuốc có Thiên niên kiện 5
1.1.7.1. Chữa thấp khớp, đau nhức xương 5
1.1.7.2. Chữa đ
au bụng kinh 5
1.1.7.3. Chữa dị ứng, mẩn ngứa, lở sơn 6
1.1.8. Các nghiên cứu về Thiên niên kiện 6
1.1.8.1. Nghiên cứu trong nước 6
1.1.8.2. Nghiên cứu ngoài nước 6
1.2. Gốc tự do và chất chống oxy hóa 8
1.2.1. Gốc tự do 8
1.2.2. Chất chống oxy hóa 9
1.3. Đại cương một số chủng khuẩn, nấm mốc, nấm men 12
1.3.1. Vi khuẩn Gram âm 12
1.3.1.1. Escherichia Coli 12
1.3.1.2. Pseudomonas aeruginosa 13
1.3.2. Vi khuẩn Gram dương 14
1.3.2.1. Staphylococcus aureus 14
1.3.2.2. Streptococcus pyogenes 15
1.3.3. Nấm mốc Trychophyton mentagrophytes 16
1.3.4. Nấm men Candida albicans 16
1.4. Giới thiệu sắc ký lớp mỏng 17
1.5. Giới thiệu sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) 18
1.6. Giới thiệu phương pháp khuếch tán đĩa 19
1.6.1. Phương pháp đặt khoanh giấy lọc 19
1.6.2. Phương pháp đục lỗ thạch 19
2.2.7. Phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn 42
2.2.7.1. Môi trường thử nghiệm 42
2.2.7.2. Phương pháp khuếch tán đĩa 43
2.2.8. Phương pháp MIC 47
PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Vi học 49
3.1.1. Vi phẫu thân rễ 50
3.1.2. Soi bột 54
3.2. Khảo sát độ tinh khiế
t 58
3.2.1. Độ ẩm 58
3.2.2. Độ tro 59
3.3. Khảo sát sơ bộ thành phần hóa học 59
3.3.1. Phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 59
3.3.2. Định tính xác định các nhóm hợp chất 63
3.3.2.1. Định tính bằng phản ứng hóa học 63
3.3.2.2. Định tính bằng SKLM 64
3.4. Khảo sát tính chất và hàm lượng tinh dầu 67
3.4.1. Định tính bằng phản ứng hóa học 67
3.4.2. Định tính bằng SKLM 68
3.4.2.1. Tinh dầu 68
3.4.2.2. Cắn n-hexan 71
3.4.3. Xác định hàm lượng tinh dầu 72
3.4.4. Định tính và định lượng bằng GC-MS 73
3.5. Kết quả các mẫu cao chiết 77
3.5.1. Kết quả độ ẩm 77
3.5.2. Hiệu suất 78
3.6. Khảo sát khả năng chống oxy hóa của các mẫ
u cao chiết 78
3.6.1. Năng lực khử 78
DANH MỤC CÁC BẢNG, HÌNH, ĐỒ THỊ VÀ CÁC THUẬT
NGỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1: Các chất chống oxy hóa và cơ chế tác dụng 11
Bảng 2.2: Thuốc thử dùng phân biệt 2 loại tannin 32
Bảng 2.3: Quy trình khảo sát năng lực khử 38
Bảng 2.4: Quy trình khảo sát khả năng kháng gốc hydroxyl tự do 40
Bảng 2.5: Quy trình thử nghiệm DPPH 42
Bảng 2.6: Thứ tự đặt đĩa giấy trên các mẫu cao 45
Bảng 2.7: Thứ tự đặt đĩa giấy trên các mẫu tinh dầu 45
Bảng 2.8: Quy trình khảo sát MIC của mẫu cao 48
Bảng 2.9: Quy trình khảo sát MIC của mẫu tinh dầu 48
Bảng 3.10: Cảm quan các mẫu dược liệu 49
Bảng 3.11: Kết quả vi phẫu 50
Bảng 3.12: Kết quả soi bột 54
Bảng 3.13: Kết quả độ ẩm 58
Bảng 3.14: Kết quả độ tro 59
Bảng 3.15: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật mẫu TNK-DD 60
Bảng 3.16: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật mẫu TNK-Xanh 61
Bảng 3.17: Kết quả phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật mẫu TNK-Đỏ 62
Bảng 3.18: Kết quả định tính xác định các nhóm hợp chất 63
Bảng 3.19: Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu 72
Bảng 3.20: Thành phần hóa học tinh dầu 73
Bảng 3.21: Kết quả độ ẩm các mẫu cao chiết 77
Bảng 3.22: Hiệu suất chiết cao 78
Hình 1.7: Streptococcus pyogenes 15
Hình 1.8: Trychophyton mentagrophytes 16
Hình 1.9: Candida albicans 16
Hình 2.10: Quy trình phân tích sơ bộ thành phần hóa thực vật 27
Hình 3.11: Các mẫu bột dược liệu 50
Hình 3.12: Mảnh bần 56
Hình 3.13: Mảnh mô mềm 56
Hình 3.14: Mảnh mô cứng 56
Hình 3.15: Mảnh mạch vạch 57
Hình 3.16: Mảnh mạch mạng 57
Hình 3.17: Mảnh mạch xoắn 57
Hình 3.18: Tinh thể calci oxalat hình cầu gai 57
Hình 3.19: Tinh thể calci oxalat hình kim nằm rải rác 58
Hình 3.20: Tinh thể calci oxalat hình kim trong túi bao bọc 58
Hình 3.21: Hạt tinh bột 58
Hình 3.22: Kết quả vi phẫu thân rễ 53
Hình 3.23: SKLM định tính hợp chất coumarin 64
Hình 3.24: SKLM định tính nhóm polyphenol 66
Hình 3.25: Kết quả định tính tinh dầu bằng phản ứng hóa học 67
Hình 3.26: SKLM định tính tinh dầu với h
ệ benzen - ethyl acetat (9-1) 68
Hình 3.27: SKLM định tính tinh dầu với hệ toluen - ethyl acetat (15 - 5) 69
Hình 3.28: SKLM định tính cắn n- hexan với hệ dung môi Toluen - Ethyl acetat (15 -
5) 71
Hình 3.29: Khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao với MRSA 91
Hình 3.30: Khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao với Staphylococcus aureus 91
Hình 3.31: Khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao với Streptococcus pyogenes 92
Hình 3.32: Khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao với Pseudomonas aeruginosa 92
Hình 3.33: Khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao với E. coli 92
Hình 3.34: Khả năng kháng khuẩn của các mẫu cao với AREC 92
CC Repeated column chromatography (Sắc kí cột lặp lại)
CHCl
3
Chroloform
GC - MS Gas liquid chromatography - mass spectrometry (Sắc ký khí ghép
khối phổ)
EtOH Ethanol
EtOAc Ethyl acetat
HTCO% Hoạt tính chống oxy hóa tính theo phần trăm
IC
50
Nồng độ có hoạt tính chống oxy hóa đạt 50%
IR Infrared Spectroscopy
n - BuOH n - Buthanol
NMR Nuclear Magnetic Resonance
MS Mass spectrometry
MeOH Methanol
Me
2
CO Aceton
MSD Mass spectrometry detector
PƯ Phản ứng
SKLM Thin layer chromatography (Sắc kí lớp mỏng)
TT Thuốc thử
UV Ultra Violet
DĐVN Dược điển Việt Nam
TNK-DD Mẫu Thiên niên kiện dược dụng
TNK-Xanh Mẫu Thiên niên kiện có cuống lá xanh
TNK-Đỏ Mẫu Thiên niên kiện có cuống lá tím đỏ
Lá mọc tập trung ở đầu thân rễ, có thể dài đến 30 cm, rộng 18 cm, thùy bên 6
cm, gốc hình tim sâu, toàn bộ lá nom giống hình tam giác, đầu nhọn, mép nguyên, gân
ở gốc có 3 cái ở mỗi bên, tỏa rộng, hướng lên, gân bên mờ ở mặt trên, mỗi bên 7 - 9
cái; cuống lá dài 27 - 50 cm, gốc cuống phình và xòe ra chiếm 1/3 cuống tính từ dưới
lên.
Cụm hoa là một bông mo màu lục nhạt, không bao gi
ờ mở rộng, dài 4 - 5 cm,
rộng 10 - 15 mm; mỗi khóm thường có 3 - 4 bông mo, cuống bông mo dài 5 - 15 cm;
bông mo ngắn hơn mo, chỉ dài 3 - 4 cm; phần mang hoa cái hình bầu dục chỉ dài bằng
một nửa phần mang hoa đực, không có bao hoa; hoa đực có 4 nhị rời, chỉ nhị rộng rất
ngắn, bao phấn song song; hoa cái có nhị lép hình khối, dài bằng đầu nhụy, bầu hình
trứng, điểm những chấm mờ, noãn nhiều.
Quả mọng, thuôn, chứa nhiều hạt có vân.
Mùa hoa quả: tháng 4 - 6.
Cây có công dụng tương tự: Loài Homalomena tonkinensis Engl. và những loài
khác mới phát hiện như H. gigantea Engl., H. pierreana Engl. cũng được gọi là Thiên
niên kiện và được dùng [12].
1.1.4. Sinh thái học và phân bố
Chi Homalomena Schott gồm một số loài thân cỏ, phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt
đới châu Á và châu Mỹ. Ở khu vực Đông Nam Á, có 7 loài, đều được dùng làm thuốc.
Việt Nam có 6 loài, 4 loài được dùng làm thuốc:
- H. occulta (Lour.) Schott phân bố khá phổ biến ở các tỉnh vùng núi, cả ở
mi
ền Nam lẫn miền Bắc. Độ cao phân bố từ 300 – 700 m hoặc hơn.
- H. gigantea Engl. có tên khác là Thiên niên kiện lá to, được phát hiện ở xã
3
Đinh Trang Hòa, Đinh Trang Thượng, huyện Di Linh, tỉnh Lâm Đồng; vùng rừng Suối
Lạnh thuộc xã Hòa Thịnh, huyện Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên và vùng rừng Khe Lét,
Hương Sơn tỉnh Hà Tĩnh. Độ cao phân bố từ 100 - 600 m, riêng ở Khe Lét đã trên 700
miên cũng là nguyên nhân làm thu hẹp vùng phân bố tự nhiên của Thiên niên kiện.
1.1.5. Thành phần hóa học
Thân rễ Thiên niên kiện Homalomena occulta chứa tinh dầu 0,25%, trong đó có
α - pinen, β - pinen, limonen, linalol, α - terpineol, nerol, myrcenol và eugenol (Rue
Hakai và cs, 1982).
Zhou Chenning và cs, 1991 cho biết tinh dầu Thiên niên kiện chứa linalol
36,8%, terpinen – 4 – ol, cedrenol, sausurea lacton, U - cadinol, α – terpineol và
moslen.
Theo Alder và Lucius 1963, tinh dầu Thiên niên kiện có nguồn gốc ở Việt Nam
chứa linalol 56,84%, terpinen – 4 – ol, acetaldehyd, aldehyd propionic, aldehyd
butyric, U
3
– caren, sabinen, limonen, α - terpinen, β - terpinen, γ – terpineol, α –
terpineol.
Theo Trần Văn Sung và cs (1992), rễ Thiên niên kiện chứa (-) - α – cadinol, (-)
– T- muurolol, homalomenol C và homalomenol D [24].
Theo công bố khác của Trần Văn Sung và cs, 1992, rễ Thiên niên kiện còn có
oplopanol, oplodiol, bulatantriol, homalomenol A, homalomenol B, 1β, 4β, 7α –
trihydroxyeudesman [24].
1.1.6. Công dụng và bộ phận dùng
Thiên niên kiện có vị đắng, cay, mùi thơm, tính ấm, vào 2 kinh can, thận, có tác
dụng trừ phong thấp, mạnh gân xương.
Thiên niên kiện được dùng chữa thấp khớp, tay chân và các khớp xương nhức
mỏi hoặc co quắ
p tê bại, rất tốt cho những người cao tuổi, già yếu.
Ngày dùng 6 - 12 g dưới dạng thuốc sắc, rượu thuốc hoặc dạng bột phối hợp với
nhiều vị khác làm hoàn tán. Cũng có thể dùng tươi giã nát, ngâm rượu xoa bóp chỗ đau
tê nhức, tê bại. Rễ Thiên niên kiện khô, tán nhỏ, rắc trừ được sâu, nhậy, và còn được
dùng trong bài thuốc chữa phù với lá phù dung, rễ cỏ xước, ý dĩ, hy thiêm, thổ phục
5
ngựa, cây Xấu hổ, Dây đau xương, cây Cà gai. Các vị lượng bằng nhau, rửa sạch phơi
khô. Đun kỹ, cứ 1 kg dược liệu lấy 1 lít nước thuốc, chế thành 2 dạng: rượu thuốc và
sirô để uống.
6
1.1.7.2. Chữa đau bụng kinh
Thân rễ thiên niên kiện, rễ Bưởi bung, rễ Bướm bạc, gỗ Vang, rễ Sim rừng, các
vị bằng nhau. Sắc uống.
1.1.7.3. Chữa dị ứng, mẩn ngứa, lở sơn
Rễ Thiên niên kiện, Sả, Gừng, mỗi vị 10 g. Sắc uống trong ngày.
1.1.8. Các nghiên cứu về Thiên niên kiện
1.1.8.1. Nghiên cứu trong nước
Trong Hội nghị khoa học và công nghệ hóa hữu cơ toàn quốc lần thứ III ở
Hà
Nội năm 2005, Bùi Thị Yến My và ctv, trường ĐH Khoa Học Tự Nhiên Tp. HCM đã
tiến hành khảo sát tinh dầu căn hành Thiên niên kiện (Homalomena aromatica Schott)
ở Côn Đảo.
Kết quả thu được là: Căn hành Thiên niên kiện thu hái ở Vườn Quốc gia Côn
Đảo tuy cho hiệu suất tinh dầu thấp nhưng các cấu phần chính trong tinh dầu đa dạng
hơn trong đó murolol, α – cadinol chiếm tỉ lệ cao. Sự hiện diện của các cấu ph
ần này
trong tinh dầu làm cho tinh dầu có tính đặc thù góp phần làm hoạt tính sinh học của
tinh dầu này mạnh hơn. Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu trên một số chủng khuẩn
như Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus
subtilis… cũng khá cao (dựa trên đường kính vòng vô khuẩn) [8].
1.1.8.2. Nghiên cứu ngoài nước
Năm 1992, T.V.Sung và ctv đã công bố 3 chất mới thuộc nhóm sesquiterpene:
1β,4β,7α - trihydroxyeudesmane (1), homalomenol A (2) và homalomenol B (3) từ rễ
của Thiên niên kiện dược dụ
đó ester (6) chưa thấy biểu hiện rõ tác dụng với nguyên bào xương, 4 sesquiterenoid có
tác dụng mạnh đến sự phát triển và phân chia của nguyên bào xương. Theo nghiên cứu
này, rễ thiên niên kiện được thu hái ở Longseng – tỉnh Guangxi – Trung Quốc, sau quá
trình phơi khô và xay thành bột thô, mẫu đượ
c chiết ngấm kiệt với EtOH - H
2
O (95 : 5)
3 lần, dịch EtOH cô tới cắn sau đó được lắc phân đoạn với petroleum ether, CHCl
3
, n -
Copyright: Tài liệu đại học ©