ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒCHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
o0o
BÙI QUANG KIỆT NGHIÊN CỨU TẠO PHÁT SINH PHÔI SOMA TỪ PHÔI
NON MỘT SỐ DÒNG THÔNG NHỰA Pinus merkusii

Jungh. et de Vriese CHUYÊN NGÀNH: SINH LÝ THỰC VẬT
MÃ SỐ: 60 42 302
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. VƯƠNG ĐÌNH TUẤN

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH-2010
LỜI CẢM ƠN


MỞ ĐẦU

Thông nhựa hay còn gọi là thông hai lá có tên khoa học là Pinus merkusii
Jungh. et de Vriese, là một trong số ít những loài thông nhiệt đới trên thế giới. Thông
nhựa phân bố nhiều ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam.
Thông nhựa chủ yếu được trồng để lấy nhựa phục vụ một số ngành công nghiệp
như sơn, sản xuất nhựa đường. Nhựa thông được tinh chế để thu tinh dầu thông, phần
còn lại là Colophan được xà phòng hóa để làm xà phòng, làm keo trong sản xuấ
t giấy
và một số ứng dụng trong công nghiệp điện, làm chất đốt v.v… Ngoài ra, gỗ thông còn
được dùng trong xây dựng, đóng đồ gia dụng. Thông nhựa có thể sống ở những vùng
đồi trọc, đất đai khô cằn, nghèo dinh dưỡng nên được trồng để cải tạo môi trường và
chống xói mòn đất.
Ở Việt nam, thông nhựa được trồng nhiều ở một số tỉnh như Quảng Ninh,
Quảng Bình, Nghệ
An, Hà Tĩnh và Lâm Đồng…Tuy nhiên, trong mấy năm gần đây (từ
2005-2007) rừng thông nhựa bị tấn công bởi nhiều loài sâu bệnh, đặc biệt là sâu róm,
gây thiệt hại rất lớn về kinh tế. Vì vậy, việc tuyển chọn, lai tạo để tìm ra giống thông
nhựa có khả năng chống chịu cao với sâu bệnh, nhất là sâu róm đang là yêu cầu cấp
thiết của sản xuất.
Hiện nay, việc nghiên cứu tạ
o chọn giống thông nhựa kháng sâu bệnh được tiến
hành chủ yếu là phương pháp truyền thống nên tốn rất nhiều thời gian để đưa một
giống mới vào sản xuất.
Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ sinh
học thực vật đã đạt được những thành tựu quan trọng trong việc cải tạo giống cây
trồng. Cụ
thể, ở Canada người ta đã tạo được giống thông có khả năng chống chịu cao
với sâu ăn lá bằng cách bắn gen Bt vào loài Pinus strobus (Lachance và ctv 2007). Tuy
nhiên, để áp dụng kỹ thuật chuyển gene, một bước không thể thiếu được đó là xây

i

i

MỤC LỤC
Trang

 Trang tựa
 Lời cảm ơn .
 Mục lục i
 Danh mục chữ viết tắt v
 Danh mục bảng vi
 Danh mục hình vi
 Danh mục ảnh vii

Mở đầu 1
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Giới thiệu về chi Pinus 3
1.1.1 Phân loại Pinus merkusii 3
1.1.2 Phân bố 4
1.1.3 Đặc đi
ểm sinh học 4
1.1.4 Giá trị kinh tế 5
1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa 6
1.2 Phôi soma và quá trình hình thành phôi soma 7
1.2.1 Sơ lược về phôi soma. 7
1.2.2 Sự phát sinh phôi soma 8

2.2 Nội dung nghiên cứu 25
2.3 Vật liệu nghiên cứu 27
2.4 Phương pháp nghiên cứu 27
2.4.1 Thu quả non và xử lý vô trùng 27
2.4.2 Phương pháp cảm ứng tạo khối tiền phôi 27
2.4.3 Nghiên cứu sự tăng sinh của khối tiền 28
2.4.4 Nghiên cứu sự trưởng thành của phôi 28
iii

iii

2.4.5 Phương pháp quan sát hình thái phôi 28
2.4.6 Phương pháp sinh trắc nghiệm đo lượng hocmon nội sinh 28
2.4.7 Phương pháp đo cường độ hô hấp 30
2.5 Môi trường nuôi cấy 30
2.5.1 Môi trường cảm ứng 30
2.5.2 Môi trường duy trì và tăng sinh khối 31
2.5.3 Môi trường trưởng thành 31
2.6 Bố trí thí nghiệm 31
2.7 Các chỉ tiêu theo dõi và xử lý số liệu 31

Chương 3: Kết quả và thảo luận 34
3.1 Khảo sát ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến quá trình cảm ứ
ng tạo khối tiền
phôi 38
3.2 Cấu trúc hình thái trong quá trình cảm ứng tạo thể phát sinh phôi 38
3.3 Ảnh hưởng của nước dừa đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân nhanh . 39
3.4 Thí nghiệm ảnh hưởng của Glutamin đến các biến đổi hình thái và giai đoạn nhân
nhanh khối sinh phôi 3
3.5 Thí nghiệm Ảnh hưởng của đường maltose và sucrose lên sự tăng sinh khối của
3 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU


• Loài: P.merkusii Jungh. et de Vriese[31]

Hình 1.1: Quả và hạt P.merkusii
(www.educorolla6.blogspot.com)
Hình 1.2: Vùng phân bố P. merkusii
(
www.conifers.or
g
)

5 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
1.1.2 Phân bố:
Pinus merkusii là một trong rất ít loài thông nhiệt đới trên thế giới có thể chịu được
khí hậu nóng ẩm, đất đai khô cằn và khí hậu gần biển. Trên thế giới, cây phân bố
nhiều ở khu vực Đông Nam Á như Thái Lan, Lào, Myamar, Việt Nam, Philipine,
Campuchia…Ở Việt Nam thông nhựa phân bố nhiều ở các tỉnh miền trung và một số ở
các tỉnh đông bắc bộ: Thanh Hóa, Quảng Ninh, Hà Tĩnh, Nghệ An, Quảng Bình,
Quả
ng Trị, Lâm Đồng (Đà Lạt)… [2], [31]
1.1.3 Đặc điểm sinh học:
Pinus merkusii là cây gỗ lớn, cao trung bình 20 - 25 m, đường kính 60 - 70 cm có
khi tới 1m, thân cây thẳng và tròn, gốc không có
bạnh vè, vỏ dày màu nâu đỏ nhạt, nứt dọc sâu, tán
lá rộng hình tháp góc phân cành từ 25 - 80
o
, cành
cứng và giòn, hai lá kim mọc ra từ một bẹ, bẹ dài

cây và khác cây (Lâm Công Định, 1977; Lê Đình Khả và Hồ Viết Sắc, 1980).
1.1.4 Giá trị kinh tế:
Pinus merkusii là cây có giá trị công nghiệp toàn diện, cung cấp nhựa và gỗ. Gỗ
có vân đẹp, mùi thơm, sợ
i dài, có nhiều đặc tính cơ lý tốt, gỗ bền, chống chịu được mối
mọt, không chỉ được dùng làm đồ mộc, xây dựng, nguyên liệu giấy mà nó còn được
làm cả tà vẹt và đóng đồ thủ công mỹ nghệ (Lâm Công Định,1977). Nhựa thông được
ứng dụng rộng rãi cho nhiều ngành công nghiệp. Thành phần nhựa thông chứa 19-
24,1% dầu terpentin; 73,2-77,5% colophan, còn lại là nước và chất tạp (Lâm Công
Định, 1977). Colophan là sản phẩm được dùng trong nhiều ngành công nghiệp xây
dựng và sản xuất sơn, cho công nghiệp kỹ thuật điện và công nghiệp luyện kim. Còn
dầu terpentin được dùng trong các ngành công nghiệp sản xuất sơn và công nghiệp xây
dựng, chế biến các sản phẩm tẩy rửa và hoá chất (Lê Đình Khả và ctv, 1995; Hà Huy
Thịnh, 1999). Thông nhựa còn là cây được trồng để chống xói mòn, phủ xanh đất trống
đồi trọc vì có khả năng chịu hạn và sống trong điều kiện thổ nhưỡng khô cằn, khắc
nghiệt. Vì thế thông nhựa được phát triển còn nhằm mục đích cải tạo môi trường ở
những vùng đất khô cằn, nghèo dinh dưỡng. [1][31][32]

7 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
1.1.5 Con đường sinh sản ở thông nhựa
Chu kì sống của thông nhựa là chu kì
sống của thực vật lưỡng đơn bội có 5 đặc
tính chung:
(1) Tính dị bào tử hay (hay bào tử chuyên
biệt cho tính đực và tính cái)
(2) Thể giao tử đực và cái đa bào
(3) Sự duy trì thể giao tử cái bên trong bào


1.2 Phôi soma và quá trình phát sinh phôi soma
1.2.1 Sơ lược về phôi soma
Phôi soma, phôi dinh dưỡng, phôi vô tính hay phôi thể hệ đều là cùng một khái
niệm để mô tả một cấu trúc l
ưỡng cực bất định bao gồm cực chồi và cực rễ, mà dưới
những điều kiện thích hợp thì có thể phát triển thành một cơ thể có chức năng hoàn
chỉnh. Phôi soma chứa chất dinh dưỡng tương tự phôi hữu tính, có mầm chóp rễ và
chồi đỉnh nên có thể nảy mầm trực tiếp thành cây không qua giai đoạn phát sinh chồi,
rễ [6]
Hình 1.5: Các giai đoạn phát triển của phôi thực vật hạt kín và hạt trần
9 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
1.2.2 Sự phát sinh phôi soma
Phát sinh phôi soma là một quá trình trong đó các tế bào soma dưới các điều
kiện cảm ứng sẽ phát sinh các tế bào phôi thông qua một loạt các thay đổi về hình thái
và sinh hóa. Sự phát sinh phôi soma khác với sự phát sinh phôi hợp tử là có thể kiểm
soát các điều kiện nuôi cấy khác nhau.
Phát sinh phôi soma có các thuận lợi chính so với quá trình phát sinh phôi hữu tính là
kiểm soát được quá trình phát sinh phôi, điều khiển được môi trường nuôi phôi, dễ
dàng thu đượ
c một số lượng lớn phôi.
Không giống với những cơ thể sinh vật khác, ở thực vật, tính toàn thế của tế bào không
chỉ có ở các tế bào của phôi hợp tử mà các tế bào soma cũng có mang tính toàn thế. Sự
linh hoạt của chương trình biệt hóa giúp cho các tế bào đã biệt hóa vẫn hoàn toàn có
thể trở về giai đoạn sinh phôi dưới những điều kiện nhất định. Sự lặp l
ại toàn bộ
chương trình phát sinh cơ thể thông qua việc khởi đầu sự tạo phôi đòi hỏi sự tái chương

phấn
Thụ tinh in vitro
Sơ đồ1.1: Nhữn
g
con đườn
g
kiểm soát s
ự

p
hát triển
p
hôi ở th
ự
c v
ậ
t b
ậ
c cao
[
7
]

10 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Việc cảm ứng phát sinh phôi in vitro từ mô tế bào soma là một tiến trình phát triển thay
thế xảy ra khi phản ứng với việc thêm nồng độ cao của auxin hoặc các chất có chức
năng tương tự auxin như 2,4-D vào môi trường nuôi cấy. Khả năng đặc biệt này của

HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
phát sinh phôi, tại sao và làm thế nào để đạt được khả năng đó, cũng như đâu là điểm
nhấn kích hoạt quá trình phát triển của phôi [7][28]
1.2.3 Sơ lược quá trình nghiên cứu tạo phôi soma:
Mặc dù sự tạo phôi vô tính bất định (apomictic adventive embryogeny) xuất
hiện ở một số loài thực vật hạt kín trong tự nhiên, các thí nghiệm cảm ứng hiện tượng
này cũng được ti
ến hành trong nuôi cấy tế bào thực vật in vitro và được mô tả bằng
thuật ngữ “somatic embryogenesis” . Phát sinh phôi soma là một quá trình hình thành
phôi vô tính in vitro (Krishnaraj và Vasil, 1995). Những mô tả đầu tiên về sự hình
thành phôi vô tính trong nuôi cấy tế bào được Steward và cộng sự (1958) và Reinert
(1959) đưa ra khi nuôi cấy tế bào Cà rốt. Cho đến nay quá trình hình thành phôi vô tính
đã được tiến hành thành công trên những cây một lá mầm thuộc các họ sau: Alliaceae,
Araceae, Asparagaceae, Dioscoreaceae, Gramineae, Henerocallidaeae, Iridaceae,
Liliaceae, Musaceae, Orchidaeae, Zingiberaceae [6]

1.3 Tiềm năng phát sinh phôi soma
Khả năng phát sinh phôi soma được biểu hiện tr
ước hết là ở mức kiểu gen
(Kielly và Bowley, 1992; Moltrasio và cộng sự, 2004). Điều này có thể được chứng
minh dễ dàng bằng cách chuyển khả năng phát sinh phôi từ kiểu gen có khả năng phát
sinh phôi sang kiểu gen ngăn cản sự phát sinh phôi thông qua quá trình lai giống hữu
tính (Bowley và cộng sự, 1993; Kielly và Bowley, 1992; Moltrasio và cộng sự, 2004).
Mặc dù các điều kiện kích thích sự phát sinh phôi đã được thiết lập cho nhiều loài,
nhưng vẫn còn một số lượng lớn các loài ch
ưa thể tạo phôi soma. Thậm chí ngay trong
cùng một loài, có kiểu gen dễ tạo phôi nhưng cũng có kiểu gen ngăn cản sự tạo phôi.
Tuy nhiên, cần phải nhấn mạnh rằng trong nhiều trường hợp, sự ngăn cản tạo phôi có
thể được giải quyết bằng cách tối ưu hóa các điều kiện sinh trưởng của cây hoặc bằng
cách chọn lựa mẫu cấy thích hợp (Krishna Raj và Vasil, 1995). Vì vậy, việc xác định

1.4.1.2 Thiết lập chương trình phát sinh phôi:
Có 2 cơ chế dẫn đến sự đa dạng trong các chương trình phát sinh phôi: sự phân
chia không cân xứng của các tế bào phân cực và sự quyết định chương trình sinh phôi
phụ
thuộc vào vị trí mặt phẳng phân chia tế bào (Laux, Jurgens, 1997).
13 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Mặt phẳng phân chia đóng vai trò quan trọng trong suốt quá trình hình thành phôi bởi
khi phân chia tế bào bao gồm phân chia tế bào chất và các phân tử điều hòa. Kết quả
của việc phân chia bất đối xứng là các tế bào con sinh ra được thừa hưởng những thành
phần quyết định khác nhau từ tế bào chất, do đó mang những chương trình phát triển
khác nhau. Một số yếu tố cần cho quá trình phiên mã được mã hóa bởi gen SHORT-
ROOT (SHR) c
ần cho sự phân chia bất đối xứng chịu trách nhiệm trong việc hình
thành mô nền. Do vậy, yếu tố này được cho là có tham gia vào con đường truyền tín
hiệu bằng khuếch tán vòng (Helariutta và ctv.,2000). Giai đoạn phát triển tiếp theo của
tế bào được quyết định bởi các sự kiện được thiết lập từ trước, sau đó được truyền sang
các thế hệ tế bào tiếp theo. Tuy nhiên, trừ giai đoạn đầu hình thành biểu bì, sự phát
triển mô phôi được quyết định bởi vị trí của tế bào hơn là việc truyền đạt thông tin
cứng nhắc như trên (Dawe, Freeling, 1991). Nói một cách chung nhất, sự thiết lập
chương trình tế bào trong sự phát triển phôi liên quan đến họat động của các protein
điều hòa, kết quả của sự biểu hiện các gen tại vị trí đó (Lindsey, Topping, 1993).
Mặc dù có sự liên lạc giữa các tế bào nhưng cơ chế phân tử của nó vẫn chưa được hiểu
rõ, tuy nhiên, theo Mayer và Jurgens (1998) thì sự trao đổi thông tin đó nhờ hai cơ chế:
tín hiệu được truyền qua bề mặt tế bào thông qua receptor của serine threonine kinase
có các vùng lặp lại giàu leucin và cơ chế trao đổi phân tử tín hiệu thông qua cầu liên
bào (Mayer, Jurgens, 1998).
Phân tích về dòng vô tính chỉ ra rằng các tế bào mầm được chuyên biệt bởi tín hiệu về

− Sự phát triển của cây trên môi trường không có chất đ
iều hòa tăng trưởng.[5][6]
1.4.2.1 Các bước tạo phôi vô tính:
1.4.2.1.1 Nuôi cấy tạo phôi:
Các tế bào dinh dưỡng thực vật có chứa đầy đủ các thông tin di truyền cần thiết
để tạo nên một cơ thể thực vật có chức năng hoàn chỉnh. Việc cảm ứng quá trình phát
sinh phôi trước hết phải tác động để kết thúc sự biểu hiện gen hiện tại và thay nó bằng
chương trình biểu hiện gen phát sinh phôi. Một cơ chế
có thể ngừng biểu hiện gen là
methyl hóa DNA, có thể tiến hành bằng auxin (LoSchiavo và ctv, 1989).
Người ta cho rằng các chất điều hòa sinh trưởng và stress đóng vai trò trung tâm trong
điều hòa truyền tín hiệu, dẫn đến tái thiết lập chương trình biểu hiện gen. Điều này dẫn
đến kết quả là cảm ứng một loạt các phản ứng phân chia tế bào, dẫn đến tăng trưởng
15 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
khối mô sẹo (callus) không tổ chức hoặc tăng trưởng có cực, từ đó đưa đến phát sinh
phôi (Dudits và ctv,1995). Việc khởi động con đường phát sinh phôi chỉ giới hạn ở một
vài loại tế bào nhất định của mô sơ cấp hoặc các tế bào có khả năng họat hóa các gen
liên quan đến phát sinh phôi.
Hai cơ chế quan trọng trong phát sinh các tế bào phôi in vitro là : sự phân chia tế bào
bất đối xứng và sự kéo dài tế bào (de Jong và ctv, 1993b; Emons, 1994). Phân chia tế
bào b
ất đối xứng được thúc đẩy bởi các chất điều hòa sinh trưởng thay đổi cực tế bào
bằng các can thiệp vào sự chênh lệch pH (gradient pH) hoặc điện trường xung quanh tế
bào (Smith, Krikorian, 1990). Khả năng kiểm soát sự phát triển tế bào chịu ảnh hưởng
bởi polysaccharides vách tế bào và các enzyme thủy giải (de Jong và ctv, 1993a;
Emons, 1994; Fry,1995) [4]


chế khối tiền phôi (PEM) phát triển thành phôi vô tính (de Vries và ctv.,1988; Nomura,
Komamine 1985; Filonova và ctv.,2000a). Mức độ hấp thụ auxin tùy thuộc theo loài.
Môi trường để duy trì và tăng sinh khối tiền phôi (PEM) tương tự như trong môi
trường cảm ứng nó. Có thể nuôi cấy trên môi trường bán rắn, tuy nhiên, nuôi cấy huyền
phù cho tốc độ tăng sinh cao và các tế bào phát triển đồng đều hơn. Ở một số loài, phôi
có thể cấy chuyền sau thời gian dài trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng mà
vẫn mang đầy đủ tiềm năng phát triển thành phôi. Tuy nhiên, sai biệt về gen tăng lên
v
ới việc kéo dài thời gian cấy chuyền, làm suy giảm khả năng phát triển của phôi [6]
1.4.2.1.3 Giai đoạn tiền trưởng thành của phôi:
Sự chuyển tiếp từ khối tiền phôi (PEM) sang phôi có vai trò rất quan trọng, là
một sự kết nối giữa sự tăng sinh của khối tiền phôi (PEM) và sự phát triển có tổ chức
của phôi. Không nên xử lý cho phôi vô tính trưởng thành trước khi nó đạt đến một giai
đoạn phát triển thích hợp.
1.4.2.1.4 S
ự phát triển của phôi:
Suốt giai đọan trưởng thành, phôi vô tính trải qua các biến đổi về hình thái và
sinh hóa. Các bộ phận dự trữ như lá mầm, tăng trưởng mạnh mẽ cùng với việc tích lũy
các vật chất dự trữ . Các phôi vô tính tích lũy sản phẩm dự trữ có đặc điểm tương tự
17 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
như phôi hữu tính. Sản phẩm dự trữ cũng hướng đến một số bào quan dưới mức tế bào
(Merkele và ctv., 1995). Tuy nhiên, lượng các chất dự trữ cũng như thời điểm tích lũy
các chất dự trữ có sự khác biệt giữa phôi vô tính và hữu tính (Merkele và ctv.,1995;
Yeung, 1995). Sự tổng hợp và tích lũy các chất dự trữ và protein có nhiều trong giai
đoạn phôi muộn (late embrogenesis abundant). Ở m
ột số loài, môi trường nuôi phôi
cần được bổ sung ABA để kích thích sự trưởng thành. Abscisis (ABA) còn có tác dụng

không bào lớn và tiến tới giai đoạn kế tiếp khối tiền phôi (PEM) II

Sơ đồ 1.2: Mô tả con đường phát triển của sự phát sinh phôi vô tính P.abies[16]

Bằng thử nghiệm đánh dấu đọan đứt (dUTP mediated deoxynucleotidyl
transferase), người ta có thể phát hiện ở một trong các tế bào giàu không bào của cụm
khối tiền phôi (PEM) II vài tín hiệu đầu tiên của sự thoái hóa nhân trong suốt con
đường phát sinh phôi vô tính (Filonova và ctv, 2000b). Kích thước của khối tiền phôi
(PEM) II tăng dần lên do chúng phân chia tế bào. Cả tế bào giàu tế bào chất và tế bào
nhiều không bào trong khi vẫn giữ
được tính phân cực của chúng. Sau đó, tính phân
cực mất dần di do sự gia tăng hoạt động tăng sinh. Quá trình này tiếp tục cho đến khi
cấu trúc khối tiền phôi (PEM) III được hình thành, theo sau là sự biệt hóa các phôi của
khối tiền phôi (PEM) III. Một điều ngẫu nhiên xảy ra cùng với sự tạo phôi, khối tiền
phôi (PEM) III thoái hóa dần (chương trình tự chết của tế bào).
Loại bỏ các chất điều hòa sinh trưởng ra khỏi môi trường nuôi c
ấy làm gia tăng đáng
kể sự phát sinh phôi và giảm sự chết tế bào theo chương trình của khối tiền phôi (PEM)
(Filonova và ctv., 2000b). Trong phân tích kiểm soát thời gian ở các tế bào, người ta
thấy rằng phôi bắt đầu phát triển trong môi trường không bổ sung chất điều hòa sinh
trưởng.
19 HV.Bùi Quang Kiệt Luận Văn Thạc Sĩ
Để phôi phát triển và trưởng thành, việc nuôi cấy được bổ sung ABA Đáp ứng với
ABA, cụm phôi có màu đục, đi kèm là sự loại bỏ dây treo thông qua chương trình chết
tế bào (Filonova và ctv.,2000b). Sau đó, phôi bắt đầu kéo dài. Sự kiểm soát khi phôi
trưởng thành toàn diện giống như phôi hữu tính.[15]