BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI



TRẦN THỊ HIỀN
NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA XỬ LÝ EMS ðẾN SINH
TRƯỞNG PHÁT TRIỂN VÀ HÀM LƯỢNG ALKALOID
TỔNG SỐ CỦA CÂY DỪA CẠN (CATHARANTHUS ROSEUS
G.DON) NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013
BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực
và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào.
Tôi xin cam ñoan, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này ñã ñược
cám ơn và các thông tin trích dẫn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc.

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
iii

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành ñược bản luận văn này tôi ñã nhận ñược rất nhiều sự
chia sẻ và giúp ñỡ. Qua ñây tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới:
- PGS. TS. Nguyễn Thị Lý Anh, người ñã tận tình hướng dẫn, tạo ñiều
kiện, giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện ñề tài và hoàn chỉnh luận văn.
- Tập thể các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ sinh học- Khoa
Công nghệ sinh học - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã nhiệt tình giúp
ñỡ tôi trong quá trình thực tập.
- Tập thể cán bộ Viện nghiên cứu Sinh học Nông Nghiệp – Trường ðại
học Nông nghiệp ñã tạo mọi ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành tốt ñề tài tốt
nghiệp.
- Cảm ơn gia ñình, bạn bè, ñồng nghiệp và người thân ñã ñộng viên,
giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập.

Tác giả luận văn


1.3.1 Tác dụng trong dân gian. 11
1.3.2 Tác dụng chống ung thư của alkaloid từ Dừa cạn 11
1.3.3 Ứng dụng các alkaloid của Dừa cạn trong ñiều trị bệnh 13
1.4 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 14
1.4.1 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn trên thế giới 14
1.4.2 Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ở Việt Nam. 17
1.5 ðột biến di truyền và phương pháp xử lý ñột biến bằng EMS 18
1.5.1 ðột biến di truyền 18
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
v

1.5.2 Ethyl methane sulphonate (EMS) – Tác nhân gây ñột biến hóa
học 21
2.6 Các nghiên cứu về xử lý EMS trong công tác chọn giống 22
Chương 2 ðỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU 24
2.1 ðối tượng, vật liệu và ñịa ñiểm nghiên cứu 24
2.2 Nội dung nghiên cứu: Bao gồm 3 nội dung chính 24
2.2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 24
2.2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng sinh trưởng, phát triển và sự
biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử lý EMS in vitro 28
2.3 Phương pháp nghiên cứu 29
2.3.1 Bố trí thí nghiệm 29
3.2.2 Phương pháp tiến hành 30
2.3.3 Cách tính các chỉ tiêu 31
Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34
3.1 Nghiên cứu nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn 34
3.1.1 Ảnh hưởng của chất ñiều tiết sinh trưởng ñến sự phát sinh hình
thái từ mô Dừa cạn in vitro. 34
3.1.2 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và 1,0 mg/l α-NAA ñến sự sinh trưởng

BA : Benzyl adenin
CT : Công thức
CTTD : Chỉ tiêu theo dõi
CTTN : Công thức thí nghiệm
CV (%) : Sai số thí nghiệm
ðC : ðối chứng
ðTST : ðiều tiết sinh trưởng
EMS : Ethyl methane sulphonate
HSN : Hệ số nhân
IBA : Axit β – indol butyric
Ki : Kinetin
LSD
0,05
: ðộ lệch tiêu chuẩn mức ý nghĩa 5%
M : Mẫu
MS : Môi trường Murashige and Skoog
NXB : Nhà xuất bản
TB : Trung bình
α – NAA : Axit α – naphtyl axetic

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
viii

DANH MỤC BẢNG

STT Tên bảng Trang

3.1 Ảnh hưởng của auxin ñến tỷ lệ phát sinh hình thái từ mô Dừa cạn in vitro 35
3.2 Ảnh hưởng của cytokinin ñến tỷ lệ phát sinh hình thái từ mô
Dừa cạn in vitro 37


Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
x

DANH MỤC HÌNH

STT Tên hình Trang

1.1 Cấu trúc phân tử của Vindoline
7
1.2 Cấu trúc phân tử của Catharanthine
8
1.3 Cấu trúc phân tử của Vinblastine
8
1.4 Cấu trúc phân tử của Vincristine
9
1.5 Cấu trúc phân tử của Vindesine
10
1.6 Cấu trúc phân tử của Vinorelbine
10
1.7 Cấu trúc phân tử của Vinflunine
10
3.1 Ảnh hưởng của một số auxin và cytokinin ñến sự phát sinh hình
thái của mô Dừa cạn
39
3.2 Ảnh hưởng của tổ hợp kinetin và 2,4D ñến sự phát sinh hình thái
từ mô Dừa cạn (sau 6 tuần nuôi cấy).
42
3.3 Ảnh hưởng của tổ hợp BA và α-NAA ñến sự phát sinh hình thái
từ mô Dừa cạn

sung EMS
64
3.13 Sắc ký ñồ sắc ký lớp mỏng 6 mẫu Dừa cạn
66
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
xii

TÓM TẮT
Dừa cạn là một trong những cây thuốc quý ñã ñược sử dụng từ lâu ñời. Các
alkaloid chiết xuất từ Dừa cạn là một nhóm chất hữu cơ ñang ñược các nhà nghiên
cứu rất quan tâm bởi vì tác dụng chữa bệnh của nó, ñặc biệt là chữa bệnh ung thư.
Với mục ñích tìm ra quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn ñể làm cơ sở cho các
nghiên cứu về tạo giống ñột biến và chuyển gen nâng cao hàm lượng aklaoid sau
này, ñồng thời theo dõi, ñánh giá sinh trưởng, phát triển và hàm lượng alkaloid tổng
số ñược tích lũy trong cây Dừa cạn ñã ñược xử lý EMS in vitro. Vì vậy chúng tôi tiến
hành ñề tài nghiên cứu: “ Nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng phát
triển và hàm lượng alkaloid tổng số của cây Dừa cạn nuôi cấy in vitro (Catharanthus
roseus. G. Don)”

Nội dung báo cáo gồm 2 phần chính là: Nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn và ảnh
hưởng của xử lý EMS ñến sinh trưởng phát triển và hàm lượng alkaloid tổng số của
cây Dừa cạn in vitro.
Sau khi tiến hành thí nghiệm chúng tôi ñã tìm ra ñược: môi trường phát sinh
hình thái tốt nhất cho nuôi cấy mô lá và mô thân Dừa cạn là: MS+1,0mg/l α-
NAA+2,0mg/l BA; môi trường nhân nhanh tốt nhất là: MS+1,0mg/l α-
NAA+3,0mg/l BA; môi trường tạo rễ tốt nhất là: MS+1,0mg/l IBA; ánh sáng của
ñèn HQNN T8-36W NCM 55 và cường ñộ ánh sáng phù hợp nhất cho cây Dừa cạn

ñích ñẩy lùi căn bệnh này. Bên cạnh thuốc có nguồn gốc vi sinh vật thì thuốc có nguồn
gốc thực vật có vai trò hết sức quan trọng trong việc ñảm bảo nhu cầu chữa bệnh ngày
càng tăng.
Dừa cạn Catharanthus roseus. G. Don thuộc họ trúc ñào Apocynaceae là một
trong những loại cây cảnh phổ biến ñồng thời cũng là một loại thảo dược quý.
Trong dân gian Dừa cạn có thể ñược dùng như một vị thuốc ñể ñiều trị một
số bệnh như: cao huyết áp, tiểu ñường, tiêu hoá kém, ñi tiểu ñỏ, giun sán…
Những năm gần ñây, các alkaloid chiết xuất từ Dừa cạn là một nhóm chất
hữu cơ ñang ñược các nhà nghiên cứu rất quan tâm. Năm 1958, Noble và cộng sự ñã
chiết ñược một alkaloid từ lá Dừa cạn là: vinblastine. Sau ñó 4 năm, Svoboda và cộng
sự cũng tìm thêm một alkaloid nữa là vincristine. ðây là hai trong số các alkaloid ñã
ñược khẳng ñịnh có hiệu quả lâm sàng trên ung thư. Tuy nhiên hàm lượng các
alkaloid này trong Dừa cạn rất nhỏ (khoảng 1 phần vạn trong lá Dừa cạn khô ñối với
vinblastine, còn ñối với vincristine thì ít hơn 10 lần nữa ). Cho nên quá trình tách
chiết hai alkaloid này từ cây Dừa cạn phải trải qua khá nhiều công ñoạn phức tạp vì
vậy giá thành thuốc chữa bệnh ung thư có nguồn gốc từ cây này khá cao.
ðến nay, người ta ñã xác ñịnh ñược trong Catharanthus roseus có hơn 150
alkaloid từ các bộ phận khác nhau và có rất nhiều alkaloid khối lượng phân tử nhỏ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
2

có tác dụng chữa bệnh. Một số alkaloid ñiển hình có thể kể ñến như: Vindoline và
Catharanthine ñược sử dụng trong ñiều trị bí tiểu, hạ lượng ñường trong máu và là
hai tiền chất ñể bán tổng hợp lên vinblastine và vincristine; Ajmalicine là chất có
biệt tính dược học mạnh dùng trong ñiều trị bệnh cao huyết áp, dùng làm thuốc
giảm ñau và ñiều trị các bệnh về thần kinh; Serpentine dùng ñiều trị bệnh cao huyết
áp và an thần.… (Cao Thị Thanh Loan, 2007).
Trong khi nhu cầu về alkaloid Dừa cạn rất lớn và giá của chúng rất cao,
nhưng hàm lượng alkaloid trong nguyên liệu thô thu nhận từ cây Dừa cạn trong tự
nhiên lại rất thấp, nhiều nơi trên thế giới không có ñiều kiện tự nhiên phù hợp ñể Dừa

mang mắt ngủ Dừa cạn in vitro.
- Xác ñịnh ñược môi trường tối ưu cho tạo rễ cây Dừa cạn in vitro.
- ðánh giá khả năng sinh trưởng và sự biến dị của các dòng Dừa cạn sau xử
lý EMS in vitro
- ðánh giá ñược hàm lượng alkaloid tổng số của Dừa cạn in vitro và cây Dừa
cạn in vitro ñã ñược xử lý EMS.
2.2. Ý nghĩa thực tiễn và khoa học của ñề tài
Xây dựng ñược quy trình nuôi cấy in vitro cây Dừa cạn và xác ñịnh ñược ảnh
hưởng của các nồng ñộ EMS xử lý ñến sinh trưởng phát triển và hàm lượng
alkaloid của cây Dừa cạn. Từ ñó, xác ñịnh ñược nồng ñộ xử lý EMS thích hợp tạo
tiền ñề cho công tác chọn tạo giống cây Dừa cạn bằng phương pháp xử lý ñột biến
bằng hóa chất EMS.
Kết quả nghiên cứu của ñề tài chính là cơ sở ñể tiếp tục nghiên cứu tạo dòng
ñột biến, nguồn nguyên liệu cho việc chọn tạo giống Dừa cạn mới. ðồng thời kết
quả cũng là tư liệu giảng dạy có giá trị cho lĩnh vực công nghệ sinh học và chọn tạo
giống cây trồng. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
4

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây Dừa cạn
1.1.1. Tên gọi
Tên khoa học: Catharanthus roseus (L) G. Don; Vinca rosea L; Lochnera rosea
Reich.
Tên khác: Dừa cạn, Bông dừa, Hoa hải ñằng, Trường xuân hoa, Phjắc pót
ñông (Tày), Dương giác, Madagascar periwinkle
Họ: Trúc ñào (Apocynaceae).

phân bố rộng rãi trên nhiều nước nhiệt ñới kể cả Việt Nam. Ở các nước Phương
Tây, cây này thường ñược biết dưới tên gọi Madagaska periwinkle hoặc Vinca
rosea L. (Trần Bạch Dương và cộng sự , 2008)
1.1.4. ðặc ñiểm thực vật học
-Thân: Dừa cạn là cây thân thảo sống lâu năm, cao 40-60 cm, phân nhiều cành,
cây có bộ rễ phát triển, thân gỗ ở phía gốc, mềm ở phần trên. Mọc thành bụi dày.
- Lá: Lá mọc ñối, có hình ovan hay thuôn dài, ñầu lá hơi nhọn, cuống lá hẹp
nhọn, dài 4-6cm, rộng 2-3 cm, hai mặt nhẵn, mặt trên sẫm bóng, mặt dưới nhạt.
- Rễ thường chỉ có một rễ cái và chùm rễ phụ ở dưới ñất. Rễ cái ñâm thẳng xuống
ñất, có thể ñạt chiều dài từ 35 - 40cm, rễ phụ mọc thành chùm thưa ngắn, phát trển theo
chiều ngang, vùng vỏ rễ là nơi tích lũy chủ yếu các alkaloid.
- Hoa: Hoa có màu từ trắng tới hồng sẫm với phần tâm có màu ñỏ, ống tràng
dài 2,5-3cm và tràng hoa ñường kính 2-5cm, có mùi thơm. Hoa mọc riêng lẻ ở kẽ lá
gần ngọn.
- Quả: Quả là 1 cặp quả ñại, dài 2-4cm, rộng 2-3mm, mọc thẳng ñứng, hơi ngả
sang hai bên, trên vỏ có vạch dọc, ñầu quả hơi tù, trong quả chứa 12-20 hạt.
- Hạt: Hạt nhỏ màu nâu nhạt, hình trứng.
1.1.5. Trồng trọt và thu hoạch
Dừa cạn là loại cây ưa sáng, ưa ẩm và có khả năng chịu ñược hạn. Trong
ñiều kiện trồng trọt, khi ñược cung cấp ñầy ñủ ñiều kiện cần thiết, cây sinh trưởng
phát triển mạnh, khối lượng chất xanh thu ñược có thể cao gấp ñôi cây mọc từ thiên
nhiên. Cây mọc từ hạt trong tự nhiên vào khoảng 40%, nếu ñược xử lý có thể tăng
lên 90%. (H.Sutarno & Rudjiman, 1999)
Cây trồng từ hạt ra hoa sau 4-5 tháng. Trong thời kì sinh trưởng mạnh, nếu bị
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
6

cắt, cây tái sinh chồi khỏe. Vào năm 1970, Viện Dược Liệu ñã tiến hành nghiên cứu
kỹ thuật trồng Dừa cạn trên quy mô sản xuất. Cây ñược nhân giống bằng hạt, mỗi
hecta cần gieo 500-700gr hạt trong vườn ươm. Thời vụ gieo hạt vào tháng 9-10

bào và các phương pháp phân tích bằng sắc ký lỏng cao áp mà số lượng các chất
ñược phát hiện ra ngày càng nhiều hơn.
Xét về mặt cấu trúc, các alkaloid chứa trong loài Cantharanthus tồn tại dưới
hai dạng monomer và dimmer. Theo I.S. Johnson và cộng sự thì có thể sắp xếp các
alkaloid này vào 3 nhóm lớn:
1. Các alkaloid monomer (như Vindoline, Catharanthine….)
2. Nhóm các alkaloid dimer indole – dihydroindole (loại vinblastine)
3. Các alkaloid dimer loại không phải vinblastine
1.2.1.1. Vindoline
Vindoline (C
25
H
32
N
2
O
6
) ñược Kamat và cộng sự phân lập từ năm 1958,
Gorman và cộng sự xác ñinh cấu trúc năm 1962, ñược nghiên cứu là có tác dụng hạ
ñường huyết. (Trần Nguyên Hữu và cộng sự, 2003). Các nghiên cứu tiếp theo cho
thấy Vindoline là một dihyroindol có thể dùng làm nguyên liệu ñể sinh tổng hợp và
tổng hợp hóa học tạo các dimer alkaloid.
Vindoline có nhiều trong lá Dừa cạn khoảng 3 tháng tuổi
Là tinh thể có ñiểm chảy 150-155
o
C [a]
26
D = -18
o
/CHCl

/CHCl
3
UV
max
226, 284, 292nm

Hình 1.2. Cấu trúc phân tử của Catharanthine

1.2.2.3. Vinblastine và vincristine
Phần ñược nhiều nhà khoa học quan tâm hơn cả là nhóm 20 alkaloid cấu trúc
ñôi phân tử có khả năng chống ung thư, ñáng chú ý là vinblastine và vincristine.
Các alkaloid này ñược cấu tạo từ hai phần: Một vòng indole và một vòng
dihydroindole. Vì vậy chúng ñược gọi là các alkaloid ñôi phân tử hay “bis-indole
alkaloid”. (Trần Nguyên Hữu và cộng sự, 2003).

Hình 1.3. Cấu trúc phân tử của Vinblastine

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
9Hình 1.4. Cấu trúc phân tử của Vincristine

• Sinh tổng hợp vinblastine và vincristine (Pahwa, D., 2008)
Vinblastine ñược cấu tạo bởi hai alkaloid ñơn phân tử là catharanthine (indole)
và vindoline (dihyroindole), cả hai chất này ñều có dạng tự do trong cây. Vincristine
có cấu trúc tương tự như vinblastine nhưng thay cho nhóm N-methyl ở vòng indole ở
phần vindoline là nhóm N- formyl. Hàm lượng hai alkaloid này trong cây là rất nhỏ
(vincristine chỉ ñạt khoảng 0.0002% khối lượng trong dược liệu khô).
Mặc dù nhu cầu thực tế ñòi hỏi lượng vincristine nhiều hơn lượng vinblastine

vinblastine ñược coi là một chất trung gian trọng ñiểm, hấp dẫn trong tổng hợp các
alkaloid dimeric khác. Từ anhydro vinblastine, bằng nhiều cách khác nhau, các nhà
nghiên cứu ñã tổng hợp nên nhiều loại thuốc chống ung thư nổi tiếng hiện nay như
vinblastine, vindesine, vinorelbine và vinflunine. (Tatsuya, S. et al., 2006).
Một số alkaloid có hoạt tính khác như leurosine (20’- epi vinblastine),
ajmalicine (Raubasine), lochnerine, serpentine và tetrahydroalstronine.
1.3. Tác dụng dược lý của cây Dừa cạn
1.3.1. Tác dụng trong dân gian.
Trong dân gian, người ta thường sử dụng nước sắc Cantharanthus roseus
với tác dụng lợi tiểu, hạ ñường huyết, chữa bệnh lỵ, bệnh xuất huyết hoặc chữa vết
thương hở. Ở Châu Âu, Bắc Phi và Trung Phi, nước sắc của Dừa cạn ñược sử dụng
làm thuốc lợi tiểu, giảm xung huyết phổi, chữa bệnh viêm họng. Ở Mỹ, Dừa cạn
ñược dùng dưới dạng thuốc ñắp ñể cầm máu. Người Ấn ðộ sử dụng cây này trong
trường hợp bị côn trùng cắn. Ngoài ra Dừa cạn còn ñược dùng làm thuốc chống
viêm mắt ở Caribe và thuốc chữa ho ở Trung Quốc (Baldwin A.S.et al., 1997).
Hiện nay, Dừa cạn ñã và ñang ñược nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên
cứu tìm hiểu. Nhiều thử nghiệm lâm sàng ñã và ñang ñược thực hiện nhằm chứng
minh các tác dụng chống ung thư của các alkaloid từ Dừa cạn.
1.3.2. Tác dụng chống ung thư của alkaloid từ Dừa cạn
ðầu những năm 1950, Noble tại phòng thí nghiệm Collipv- ðại học Western
Ontario – Canada ñã nghiên cứu lá Dừa cạn với mục ñích tìm hiểu tác dụng của cây
này ñến lượng ñường huyết trong cơ thể. Thay vì các hoạt tính trên, ông nhận thấy
trong lá Dừa cạn có những chất tác dụng mạnh ñến tế bào bạch cầu và tủy xương.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………
12

Từ ñó, theo hướng nghiên cứu các chất gây ñộc tế bào hoặc ức chế phân bào bạch
cầu ác tính, cùng với các nhà khoa học khác là Beer và Cutts, Noble ñã chiết ra
ñược chất có hoạt tính chống ung thư ñặt tên là Vincaleukoblastine vào năm 1958,
sau ñó ñổi tên thành vinblastine. (Johnson và cộng sự, 1959).