ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -1- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
MỞ ĐẦU
Cà phê mới được biết đến khoảng hơn 300 năm nay, muộn hơn rất nhiều so
với nhiều cây lương thực, thực phẩm quan trọng khác. Tuy nhiên, ngày nay cây cà
phê đã trở thành một loại cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, là một mặt hàng
xuất khẩu quan trọng của nhiều quốc gia trên thế giới. Ở một số nước, cà phê là
một loại thức uống không thể thiếu. Cà phê còn là nguyên liệu để sản xuất một số
mặt hàng thực phẩm như sữa, bánh, kẹo sự có mặt của cà phê sẽ làm tăng thêm
hương vị và giá trị dinh dưỡng cho sản phẩm.
Sở dĩ cà phê được sử dụng ngày càng nhiều vì trong hạt cà phê chứa 0,8 – 3%
caffeine, một hoạt chất có tác dụng kích thích thần kinh, giúp tế bào não tăng
cường khả năng làm việc, khả năng tư duy và qua đó thúc đẩy hoạt động của hệ
tuần hoàn, tăng cường phản ứng của cơ bắp,… Ngoài ra, trong hạt cà phê còn chứa
nhiều chất dinh dưỡng cần thiết cho cơ thể con người như đường saccharose,
đường khử, các protein hòa tan,… đặc biệt là các vitamin B1, B2, B6, B12 và PP
có hàm lượng khá cao, đó là những chất cần thiết cho nhu cầu sinh lý của cơ thể
chúng ta. Do đó cà phê giúp nâng cao sinh lực, chống mệt mỏi, giúp con người làm
việc sáng suốt và thoải mái hơn.
Trong những năm gần đây diện tích đất trồng và sản lượng cà phê nước ta tăng
mạnh, ngành chế biến và xuất khẩu cà phê nước ta đang dần hoàn thiện hơn. Tuy
nhiên chất lượng cà phê nước ta còn thấp do phương pháp chế biến còn hạn chế và
còn phải nhập khẩu các dạng chế phẩm enzyme thương mại đắt tiền trong sản xuất
cà phê theo phương pháp ướt. Vì vậy tôi chọn đề tài “Nghiên cứu sử dụng hệ
enzyme cellulase và acid lactic của vi khuẩn B. subtilis, L. plantarum để xử lý lớp
nhớt hạt cà phê”. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ góp phần hoàn thiện qui trình
sản xuất cà phê theo phương pháp ướt, góp phần tăng chất lượng sản phẩm cà phê.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -2- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tìm hiểu về cà phê
Nước 8 – 12
Chất dầu 4 – 18
Đạm 1,8 – 2,5
Proteine 9 – 16
Caffeine 1 (Arabica), 2 (Robusta)
Chlorogenic acid 2
Trigonelline 1
Tannin 2
Caffetanic acid 8 – 9
Caffeic acid 1
Pentosane 5
Tinh bột 5 – 23
Saccharose 5 – 10
Cellulose 10 – 20
Hemicelllulose 20
Lignine 4
Calcium 85 – 100
Phosphur 130 – 165
Sắt 3 – 10
Sodium 4
Manganese 1 – 45
(Nguồn: Lê Quang Hưng, 1999)
Caffeine là một alkaloid chứa đạm, công thức là C
8
H
10
O
2
N
4
(Nguồn: Phạm Trí Thông, 1999)
Ngoài ra, còn có một số các enzyme được tạo ra trong lớp nhầy và trong lớp
thịt bao quanh lớp nhầy như protopectinase, pectinase, pectinesterase và
pectase. Các enzyme này bẻ gãy các phân tử lớn bằng cách cắt đứt các liên kết
polymer, dần dần tạo thành các chuỗi ngắn hơn cho tới khi còn các acid đơn phân tử
và các ester.[4],[7]
Khi trái cà phê được tiến hành xát vỏ, vô số các vi sinh vật như nấm men, nấm
mốc, vi khuẩn,… trong môi trường chung quanh khối hạt đã tìm thấy ở đây một
môi trường vô cùng thuận lợi cho sự phát triển của chúng. Trong quá trình phát
triển, chúng tự sản xuất ra các enzyme và tác động lên lớp nhầy của khối cà phê xát
vỏ. Chính lớp nhầy này sẽ gây ảnh hưởng tới chất lượng cà phê khi chế biến, nếu
không loại bỏ lớp nhầy thì quá trình chế biến hạt cà phê sẽ lâu hơn dẫn đến chất
lượng hạt cũng giảm theo.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -5- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
1.1.2. Các phương pháp chế biến cà phê
Hình 1.3: Qui trình của cà phê từ khi nở hoa cho đến thành phẩm cuối cùng
Phẩm chất và hương vị cà phê phụ thuộc vào một số yếu tố chính sau đây:
Giống, khí hậu, độ phì nhiêu của đất và chế độ bón phân, độ chín khi thu hái, kỹ
thuật chế biến và chế độ bảo quản. Trong kỹ thuật chế biến cà phê nhân, có 2
phương pháp chính:
+ Phương pháp chế biến khô
+ Phương pháp chế biến ướt
Ngoài ra, còn có phương pháp trung gian là nửa khô nửa ướt. Cà phê đem xát
tươi còn lẫn cả vỏ quả đem phơi không qua công đoạn lên men và ngâm rửa.
Khi thu hoạch người ta chỉ hái những quả chín, không hái quả xanh và quả còn
non. Cà phê hái ngày nào nên được chế biến ngay trong ngày hôm đó, số lượng còn
lại không nên ủ thành đống lâu quá 24 giờ. Để có cà phê nhân phục vụ cho xuất
khẩu, tỷ lệ quả chín khi thu hái phải đạt trên 95%. Cà phê là một sản phẩm dùng để
+ Xát vỏ
+ Tách lớp nhầy (lên men)
+ Rửa và phân loại theo tỷ trọng dòng nước
+ Phơi/sấy
+ Tách vỏ trấu, phân loại
Thu nhận và phân loại
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -7- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
- Cà phê sau khi thu hái về được phân loại trước khi vào máy xát tươi để loại
bỏ các tạp chất như đất, đá sắt, cành lá…đồng thời phân loại riêng các quả cà phê
không đạt yêu cầu như: quả xanh, khô, lép, sâu bệnh.
- Phân loại bằng cơ giới trên các bàn rung, các trụ quay,… không hiệu quả
bằng phân loại theo tỷ trọng bằng bể xiphong vì làm theo cách này không những
phân loại được cà phê mà còn rửa sạch quả cà phê trước khi qua máy xát. Cà phê
thu hái về đổ vào bể xiphong dưới tác dụng của tỷ trọng thì trái nào nặng sẽ chìm
xuống dưới, trái nào chín khô nhẹ hơn và cành lá sẽ nổi lên trên.
- Bể được bơm nước tới 4/5 và được cấp nước liên tục theo ống đứng và ống
ngang phía trên chảy ra ngoài, kéo theo các quả cà phê theo nguyên lý bình
xiphong. Nước dư thừa chảy qua 1 miệng xả đặt gần thành bể, kéo theo các tạp chất
nhẹ như rác, cành, lá, quả lép, sâu bệnh,… Các tạp chất nặng như gạch, đất, đá, cát,
sạn,… lắng xuống đáy bể và được xả ra ngoài sau mỗi lần ngừng.
Xát vỏ tươi:
Mục đích: loại bỏ lớp vỏ thịt bên ngoài. Quá trình này phải tiến hành ngay sau
khi thu hoạch 24 giờ.
Quá trình xát vỏ được thực hiện trên máy xát đĩa như hình 1.5. Hạt cà phê sau
khi ra khỏi máy xát tuy đã tróc hết lớp vỏ thịt
nhưng vẫn còn lớp nhớt bao quanh lớp vỏ
trấu. Lớp nhớt này dù phơi khô nhưng sau này
vẫn hút ẩm rất nhanh, gây khó khăn cho việc
được xả ra 1 lần khi hoàn tất quá trình lên men.
Mục đích của quá trình lên men là làm sạch hết lớp chất nhầy có trên vỏ cà
phê. Việc ủ cà phê được thực hiện trong bể xi măng hay trong các thùng nhựa…đổ
hạt cà phê vừa bóc vỏ vào bể, chế phẩm vi sinh (các vi sinh vật) và 1 lượng nước
nhất định, dàn đều rồi dung bao tải phủ lên trên. Thời gian lên men kéo dài từ
12÷24 giờ tùy theo thời tiết, nếu nhiệt độ môi trường cao thì thời gian lên men sẽ
nhanh hơn. Sau 5÷6 giờ lên men tiến hành đảo trộn để cung cấp đủ oxi cho khối ủ
và nhiệt độ đều khắp khối ủ.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.6. Lên men cà phê trong các bể xi măng
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -9- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Sau khi lên men ta kiểm tra thấy các hạt xát vào nhau không còn trơn mà có
cảm giác nhám, thì quá trình lên men đã đạt, có thể rửa lại khối hạt và đưa đi phơi
sấy.
Rửa:
- Mục đích: loại bỏ lớp chất nhờn đã lên men, tạp chất…. Quá trình rửa có ảnh
hưởng rất quan trọng đến phẩm chất cà phê nhân vì nó tẩy sạch những chất gây ảnh
hưởng đến màu sắc hạt và mùi vị hạt lúc rang.
- Cách tiến hành: cà phê được rửa trong bể ngâm ủ, khuấy trộn, thay nước liên
tục cho đến khi nước hoàn toàn trong vắt.
Phơi sấy:
Cà phê thóc sau khi rửa và để ráo nước, còn chứa 50÷60% nước. Để giảm độ
ẩm xuống còn 12%, ta tiến hành phơi sấy.
Tách vỏ trấu và phân loại:
Sau khi phơi, sấy khô ta bóc lớp vỏ trấu của hạt cà phê trên máy chà vỏ, sau
đó đem phân loại các hạt theo kích thước và màu sắc rồi đem chế biến hoặc bán trên
thị trường.[14],[15],[16],[18]
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Hình 1.9. Cấu trúc thành tế bào thực vật
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -11- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
+ Pectinic acid: là polygalacturonic acid có một phần nhỏ các nhóm carboxyl
được ester hóa bằng methanol.
+ Protopectin: tạo độ cứng cho quả xanh, không tan trong nước. Trong thành
phần có các phân tử pectin, các phân tử cellulose và các ion Ca
2+
, Mg
2+
, các
gốc phosphoric acid, acetic acid và đường. Protopectin khi bị thủy phân bằng acid
thì giải phóng pectin hòa tan. [4],[7]
1.2.1.2. Cellulose
Mỗi năm có khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp nhờ
quá trình quang hợp. Trong số này có 172 tỷ tấn được tạo thành trên đất liền và 60
tỷ tấn được tạo thành ở trong các đại dương. Trong số này có đến 30% là màng tế
bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong
bông và 40÷50% trong gỗ. Ligno-cellulose là thành phần cấu trúc chính của cây gỗ
và cây thân mềm (cỏ, rơm rạ,…) gồm cellulose, hemicellulose và lignin.
- Định nghĩa: Cellulose là polymer thẳng của các đơn vị -D-glucose được nối với
nhau qua liên kết -D-1,4-glucan. Nhờ phương pháp phân tích bằng tia Rơnghen
người ta biết rằng cellulose có cấu tạo dạng sợi. Các sợi này liên kết lại thành những
bó nhỏ gọi là các microfibril (vi sợi) có cấu trúc không đồng nhất, chúng có những
phần đặc (phần kết tinh) và những phần xốp hơn (phần vô định hình).
- Cấu trúc
Các phân tử cellulose kết hợp với nhau bằng lực hút Vanderwall và
liên kết hydro. Chúng tạo nên sợi sơ cấp, sợi sơ cấp kết hợp với nhau tạo thành vi
sợi.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
Sự hiện diện của cellulose đóng vai trò là một vật liệu phổ biến của vách tế
bào thực vật được phát hiện lần đầu tiên bởi Anselm Payen vào năm 1838. Nó tồn
tại ở hầu hết những hình thức nguyên trong sợi cotton và trong tổ hợp với những vật
liệu khác, như lignin và hemicellulose, trong gỗ, lá và thân … Mặc dù, nhìn chung
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -13- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
được xem như vật liệu thực vật nhưng cellulose cũng được sản xuất bởi một số vi
khuẩn.
Cellulose là nền tảng bộ xương của thành tế bào thực vật. Ngoài ra người ta
còn thấy chúng có nhiều ở tế bào một số loài vi sinh vật (cellulose ở vi sinh vật
thuộc loại vô định hình, việc phân hủy thường dễ thực hiện). Cellulose không
có trong tế bào động vật. [4],[7]
1.2.1.3. Pectinase
- Định nghĩa
Enzyme pectinase là enzyme xúc tác sự phân hủy của các polymer pectin. Sự
phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín. Những enzyme này
có một vai trò hết sức quan trọng trong quá trình bảo quản trái cây và rau quả.
Enzyme pectinase cũng được ứng dụng nhiều trong chế biến thực phẩm, đặc biệt
là khả năng làm trong nước quả.
- Ứng dụng
Pectinase được tạo ra trong suốt quá trình chín tự nhiên của một số quả (cùng
với cellulase), chúng giúp làm mềm thành tế bào của quả.
- Phân loại và cơ chế tác dụng của các loại enzyme pectinase
Các pectinase được chia thành hai nhóm chủ yếu:
+ Pectimetylylesteraza (Pectinhydrolaza): xúc tác sự thủy phân liên kết este
trong phân tử pectin hoặc axit pectinic khi toàn bộ nhóm metoxyl bị tách ra khỏi cơ
chất thì sản phẩm là methanol và các axit polygalacturonic. Sự thủy phân chỉ xảy ra
ở liên kết este liền kề với nhóm cacboxyl tự do.
+ Polygalacturonaza (Polygalacturonic - glucanohydrolaza): xúc tác sự thủy
Penicillium expanam, Penicillium cilrrimim,…
+ Nấm men: Saccharomyces fragilis
+ Vi khuẩn: Bacillus polymyxa, Flavobacterium pectinovorum, Klebsiella
aerogenes,…
Ngoài ra, pectinase cũng được tiết ra bởi một số mầm bệnh cây trồng như:
Nấm Monilinia fructigena, vi khuẩn gây thối rữa Enwinia carotovora. [5],[6]
1.2.1.4. Cellulase
- Định nghĩa: Cellulase là một phức hệ hydrolase gồm từ cellulase C
1
đến
cellulase Cx và glucosidase. Chúng sẽ phân hủy lần lượt cellulose để cuối
cùng tạo ra sản phẩm đường glucose.
- Tính chất
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -15- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất ở nhiệt độ nằm trong khoảng
40÷60
o
C, pH nằm trong khoảng 4÷7. Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm
phản ứng của nó như glucose, cellobiose. Hg ức chế hoàn toàn cellulase, trong
khi các ion như Mn
2+
, Ag
+
, Cu
2+
và Zn
2+
chỉ ức chế nhẹ. Hoạt tính của chế phẩm
nào đó đặc trưng của môi trường có vi sinh vật phát triển.
+ Giai đoạn thứ hai: cellulose (đã biến đổi sau giai đoạn 1) bị thủy phân dưới
tác dụng xúc tác của hệ enzyme thủy phân C
x
tạo thành đường cellobiose. Enzyme
C
x
còn được gọi là enzyme β – 1,4 – glucanase. Chữ x có nghĩa cho ta biết đây là
loại enzyme có nhiều thành phần khác nhau. Người ta thường chia thành hai loại:
Exo – β – 1,4 – glucanase: xúc tác việc tách ra một cách liên tiếp các đơn vị
glucose từ đầu không khử của chuỗi cellulose.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -16- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Endo – β – 1,4 – glucanase: phân cắt liên kết β – 1,4 – glucozit ở bất kì vị trí
nào bên trong chuỗi cellulose.
+ Giai đoạn cuối cùng: dưới tác dụng của enzyme cellobiose (β -
Glucozidase), đường cellobiose bị thủy phân thành glucose.
- Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme cellulase
Hệ vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp cellulase khá phong phú,
thuộc 3 nhóm: nấm sợi, xạ khuẩn và vi khuẩn. Trong công nghiệp sản xuất cellulase
hiện nay, người ta chủ yếu nuôi cấy nấm sợi và xạ khuẩn, còn vi khuẩn ít được sử
dụng.
+ Nấm sợi: Chủ yếu là nấm mốc và nấm quả thể, đa số có khả năng sinh tổng
hợp các loại enzyme ngoại bào (được nấm tiết ra ngoài môi trường nuôi cấy).
Aspergillus fumigatus, Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Aspergillus
oryzae, Aspergillus sydovii, Aspergillus terrus
Trichoderma koningi, Trichoderma lignorum, Trichoderma roseum,
Trichoderma reesei
Penicillium spp
hydroxypropanoic. Trong cấu tạo của chúng có một cacbon bất đối xứng nên chúng
có hai đồng phân quang học: D-acid lactic và L-acid lactic. Hai đồng phân quang
học này có tính chất hóa lý giống nhau, chỉ khác khả năng làm quay mặt phẳng
phân cực ánh sáng, một sang trái và một sang phải. Do đó tính chất sinh học của
chúng hoàn toàn khác nhau.
Tính chất:
DL - acid lactic là dịch lỏng, dạng tinh thể, tan trong nước, trong cồn, không
tan trong CHCl3, nhiệt độ nóng chảy 16,8ºC, nhiệt độ sôi 122ºC.
Acid lactic có khối lượng phân tử là 98,9, là chất hữu cơ không màu, mùi
nhẹ. Acid lactic là một chất có độ hút ẩm cao là chất lỏng sánh đặc có sẵn trên thị
trường ở nhiều dạng khác nhau về chất lượng và phụ thuộc vào độ tinh sạch có
nhiều tiêu chuẩn khác nhau: Acid lactic kỹ thuật, thực phẩm, dược phẩm và acid
lactic plastic,
Ở dạng đồng phân D-acid lactic và L-acid lactic lần lượt có nhiệt độ nóng
chảy và nhiệt độ sôi là 28ºC và 103ºC.
- Ứng dụng của acid lactic: Ngày nay acid lactic được sử dụng khá phổ biến
trong nhiều lĩnh vực như trong thực phẩm, y học, nông nghiệp… Như: sản xuất các
sản phẩm sữa chua và các sản phẩm rau quả muối chua, các sản phẩm men tiêu
hóa… Lượng acid lactic do các vi khuẩn tổng hợp có thể giúp các phản ướng thủy
phân lớp nhớt của hạt cà phê diễn ra nhanh hơn đồng thời cải thiện hương vị cho hạt
cà phê. [8]
1.2.2. Hiện trạng sử dụng các chế phẩm vi sinh trong quá trình lên men cà phê
theo phương pháp ướt ở nước ta
Trong những năm gần đây việc sử dụng các chế phẩm vi sinh trong quá trình
lên men cà phê theo phương pháp ướt ở nước ta ngày càng phổ biến hơn và phát
triển mạnh trong những năm tới. Do nó được đánh giá là có nhiều ưu điểm và cho ra
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -18- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
các sản phẩm cà phê có chất lượng và hương vị tốt hơn. Một số chế phẩm vi sinh đã
+ Thời gian lên men hạt cà phê tối ưu là 16 giờ.
+ Tỉ lệ chế phẩm sử dụng là 0,16% thì hiệu suất trích ly của hạt sau lên men
đạt tối đa, lượng chất hòa tan thu được cao nhất.
+ pH khối hạt khi lên men giảm dần theo thời gian và cũng giảm theo sự gia
tăng của hàm lượng chế phẩm.
+ Trọng lượng khối ủ giảm dần theo sự gia tăng của hàm lượng chế phẩm.
Theo thời gian lên men thì trọng lượng khối ủ giảm dần, về sau lại tăng nhẹ.
+ Nhiệt độ khối ủ đạt cao nhất sau khi lên men 8 giờ.
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -19- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
1.3. Chế phẩm vi sinh Bacillus subtilis và Lactobacillus plantarum trong sản
xuất cà phê lên men theo phương pháp ướt
1.3.1. Giới thiệu về chế phẩm
Chế phẩm được sản xuất nhờ phối hợp 4 chủng vi sinh vật:
- Hai chủng nấm mốc Aspergillus niger và Mục trắng
- Hai chủng vi khuẩn Bacillus subticlic và Lactobacillus plantarum
Trong đó có 3 chủng vi sinh vật: Aspergillus niger, Ph. chrysosporium và
Bacillus subticlic có khả năng phân hủy lớp nhớt bên ngoài hạt cà phê nhờ chúng có
hệ enzyme pectinase và hệ enzyme cellulose. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum có
khả năng lên men lactic giúp tăng hương vị cà phê sau lên men.
Cà phê nhân sau khi thu hái về và bóc vỏ tiến hành đem xử lý bằng chế phẩm,
khối hạt cà phê được cho vào bể xi măng, bổ sung chế phẩm vào trộn đều rồi tiến
hành lên men trong khoảng thời gian 12 giờ đến 20 giờ. Trong quá trình lên men
tiến hành đảo trộn, sau đó đem đi rửa và xem hiệu quả xử lý rồi tiến hành chế biến
công đoạn tiếp theo.
1.3.2. Vi khuẩn Bacillus subtilis
1.3.2.1. Đặc điểm của vi khuẩn Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được Cohn phát hiện năm 1872. (Ban đầu Bacillus subtilis tên
Vibrio (1835), sau đó đã được đổi tên Bacillus subtilis vào năm 1872), nó phân bố
Bacillus cereus Bacillus coagulans
Bacillus globigii Bacillus licheniformis
B. subtilis là trực khuẩn Gram dương, hiếu khí hoặc kị khí không bắt buộc, là
sinh vật có nhân điển hình có thể kết thành chuỗi dài ngắn khác nhau và tế bào có
thể đứng riêng rẽ, tế bào có kích thước 3-5x0,6-0,9 μm, sinh bào tử, bào tử chịu
nhiệt khá cao. Ở điều kiện 100
0
C, bào tử của B. subtilis chịu được 180 phút, có tính
ổn định cao với nhiệt độ thấp và sự khô cạn, tác động của hóa chất, tia bức xạ
(Kerovuo et al., 2000).
Bacillus là vi khuẩn gam dương tính và catalase dương tính, sử dụng khí oxy
làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Qua kính hiển
vi Bacillus đơn lẻ có hình dạng giống những chiếc que, phần lớn những chiếc que
này có bào tử trong hình oval có khuynh hướng phình ra ở một đầu. Thường thì
người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có hình dạng
bất định và đang phát triển lan rộng
Chủng này có khả năng sinh tổng hợp nhiều loại enzyme ngoại bào:
protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase và dextranase, protease kiềm
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -21- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
có giá trị cao, đặc biệt có khả năng sinh tổng hợp roboflavin (tiền vitamin B2). Vì
vậy B.subtillis được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp. [5],[9],[10].
1.3.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của Bacillus subtilis
- Nhiệt độ: Hoạt động của vi khuẩn tối ưu nhất xảy ra tại nhiệt độ 37-40
0
C, tại
vùng nhiệt độ này lượng amylase sản sinh ra là lớn nhất. Ở nhiệt độ 40
0
C-50
sinh trưởng của vi sinh vật.Trong môi trường nuôi cấy có đủ các yếu tố dinh dưỡng
cần thiết cho sự phát triển và tích lũy enzyme của vi sinh vật.
Điều kiện nuôi cấy được tiến hành đối với vi khuẩn ở nhiệt độ từ 25-45°C, tốt
hơn giữa 30-40°C, trong điều kiện hiếu khí bằng cách lắc, khuấy. Độ pH trung bình
tốt nhất của môi trường phụ thuộc vào chủng vi sinh vật được nuôi cấy.[5],[9],[10]
1.3.3. Vi khuẩn Lactobacillus plantarum
1.3.3.1. Đặc điểm của vi khuẩn Lactobacillus plantarum
Từ lâu acid lactic (CH
3
CHOHCOH) đã được con người sử dụng để bảo quản
và chế biến thực phẩm. Acid này lần đầu tiên được phát hiện ra từ sữa bò lên men
chua bởi nhà hoá học Thụy Điển Carl Scheele năm 1780 và được gọi là “acid sữa”.
Năm 1857 Louis Pasteur lần đầu tiên đã chứng minh được rằng việc làm chua sữa
bò là kết quả của một nhóm VSV đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic. Năm 1878, Joseph
Lister lần đầu tiên phân lập được một loại vi khuẩn lactic đặt tên là Bacterium lactic
(hiện nay gọi là Streptococcus lactic). Từ đó đến nay nhiều loài vi khuẩn lactic khác
nhau đã được phân lập và nghiên cứu trong đó phải kể đến vi khuẩn Lactobacillus
plantarum.
Theo phân loại khoa học thì vi khuẩn Lactobacillus plantarum thuộc:
Ngành : Firmicutes
Nhóm : Trực khuẩn
Bộ : Lactobacillales
Họ : Lactobacillaceae
Chi : Lactobacillus
Loài : L.plantarum
Hầu hết các chủng vi khuẩn lactic thường ít gặp trong đất và trong nước ,
chúng thường phát triển trên những môi trường có chứa nhiều hợp chất hữu cơ phức
tạp như trong sữa và các sản phẩm từ sữa, rau quả muối chua, trên bề mặt thực vật
và xác thực vật đang bị phân giải, trên bề mặt các loại rau quả, trái cây,trong ruột và
các niêm dịch ở người và động vật…[5],[8],[9].
1.3.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của Lactobacillus
plantarum
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP -24- GVHD: PGS.TS. Trần Thị Xô
Để vi khuẩn Lactobacillus plantarum có thể sinh trưởng và phát triến tốt thì
môi trường nuôi cấy chủng cần phải được quan tâm đến các yếu tố sau:
• Nguồn dinh dưỡng cacbon: Lactobacillus plantarum sử dụng nguồn
năng lượng chính từ các nguồn đường mono- và disaccharide như glucose, lactose,
saccarose, maltose và các acid hữu cơ như acid citric, malic, pyruvic, fumaric,…làm
nguồn năng lượng và trao đổi cấu trúc. Khi không có mặt nguồn cơ chất như trên, vi
khuẩn sẽ sử dụng nguồn năng lượng và vật liệu tế bào là các acid amin (acid
glutamic, arginin, tirozin,…) và giải phóng CO
2
. Chúng không sử dụng được nguồn
cacbon là polysaccharide.
• Nguồn dinh dưỡng nitơ: phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng
hợp được các hợp chất chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự sinh trưởng và phát
triển chúng phải sử dụng các nguồn nitơ có sẵn trong môi trường.
Các nguồn nitơ hữu cơ mà vi khuẩn lactic có thể sử dụng như: cao thịt, cao
nấm men, trypton, dịch thủy phân casein từ sữa, pepton,… Hiện nay cao nấm men
là nguồn nitơ được sử dụng nhiều nhất và có hiệu quả nhất.
Còn đối với nitơ vô cơ thì nguồn nitơ vô cơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh vật
chính là muối amon. Đôi khi có lòai không sử dụng được muối này thì nguyên nhân
không phải do bản chất của NH
4
+
mà do sau khi đồng hóa gốc amon , môi trường sẽ
tích lũy các gốc anion vô cơ như SO
4
2+
hoặc Mn
2+
.
• Nguồn Oxy: vi khuẩn lactic không có hệ enzyme cytochrom tham gia
vào hô hấp, nhưng chúng lại thực hiện được hô hấp nhờ hoạt tính của một số hợp
chất có mặt của hệ flavoproteit. Lactobacillus plantarum thường sinh trưởng tốt
trong điều kiện kị khí.
• Nhiệt độ: vi khuẩn Lactobacillus plantarum là loài ưa ấm nên thích
hợp phát triển trên nền nhiệt 30ºC, từ 45ºC trở đi vi khuẩn Lactobacillus plantarum
ngừng hoạt động.
• pH môi trường: các chủng vi khuẩn lactic chịu được pH thấp khác
nhau, pH thích hợp cho Lactobacillus plantarum phát triển giới hạn trong khoảng
5,5 ± 6,6. [5],[8],[9].
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1.Vật liệu và dụng cụ, máy móc
2.1.1. Vật liệu
Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis và chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum
được phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, trường ĐH Bách Khoa Đà
Nẵng cung cấp.
Cà phê tươi sau khi thu hái được sử dụng để nghiên cứu, các loại cà phê này
được trồng ở tỉnh Đắk Lắk.
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ dùng trong thí nghiệm
2.1.2.1 Thiết bị
SVTH: Dương Văn Tuân Lớp :
10SHLT
Copyright: Tài liệu đại học ©