B GIO DC V O TO B Y
T
TRNG I HC Y H NI
***.
NGUYN MNH TUN
THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM
MASSON S
TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ
GAN
Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN
KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA
KHểA 2009- 2013
H Ni- 2013
B GIO DC V O TO B Y T
TRNG I HC Y H NI
***.
NGUYN MNH TUN
THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM
MASSON S
TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ
GAN
Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN
KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA
KHểA 2009- 2013
Hng dn khoa hc:ThS. Nguyn Hu
Quc
ThS. Hong Trung Kiờn
H Ni- 2013
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại Học-
trường Đại Học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được học

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Giải phẫu, mô học và tế bào học bình thường của gan 3
1.1.1. Giải phẫu gan 3
1.1.2. Mô học gan bình thường 3
1.2. Bệnh xơ gan 4
1.3. Vài nét về mô liên kết 5
1.4. Sợi collagen 5
1.4.1. Collagen type 1 6
1.4.2. Collagen type 2 6
1.4.3. Collagen type 3 6
1.4.4. Collagen type 4 6
1.4.5. Collagen type 5 và 6 6
1.5. Phương pháp nhuộm ba màu của Masson 7
1.5.1. Lịch sử phương pháp nhuộm ba màu của Masson 7
1.5.2. Cơ chế nhuộm 7
1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson 8
1.6. Pha hóa chất 12
1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric 12
1.6.2. Dung dịch Fuchsin – Ponceau 12
1.6.3. Dung dịch acid Phosphomolybdic 1% 12
- Nước cất 12
100ml 12
- Acid Phosphomolybdic 12
1g 12
1.6.4. Dung dịch Blue aniline 12
- Blue aniline 12
2,5g 12
- Acid aceJc 12
2,5ml 12
- Nước cất 12

CHƯƠNG 3 20
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 20
3.1. Đánh giá kết quả thực hành kỹ thuật 20
3.2. Các yếu tố liên quan ảnh hưởng tới kết quả thực hành 22
CHƯƠNG 4 32
BÀN LUẬN 32
4.1. Kết quả thực hành 32
4.2. Các yếu tố liên quan 34
KẾT LUẬN 37
Từ kết quả quá trình nghiên cứu, chúng tôi rút ra một số kết luận sau
đây: 37
KIẾN NGHỊ 38
Từ kết quả nghiên cứu, chúng tôi xin được đưa ra một vài kiến nghị với
hy vọng sẽ nâng cao được phần nào chất lượng của một tiêu bản nhuộm
Masson trong Labo Giải phẫu bệnh phục vụ cho công tác chẩn đoán mức
độ xơ gan: 38
1. Đối với phương pháp nhuộm Masson để có được một tiêu bản đẹp thì
yếu tố kỹ thuật của người kỹ thuật viên là yếu tố rất quan trọng. Các yếu
tố kỹ thuật bao gồm các bước liên hoàn: chuyển, đúc, cắt, nhuộm 39
2. Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi thấy rằng tiêu bản nên được cố
định bằng Bouin trước khi thực hiện nhuộm Masson. Nếu bệnh phẩm đã
được cố định từ trước bằng formol 10% thì mảnh cắt nên được cố định
lại bằng Bouin với thời gian là 1giờ ở nhiệt độ 56oC. Như thế, tiêu bản sẽ
rõ ràng hơn độ tương phản của các thành phần 39
Ngoài ra, chúng tôi nhận thấy có thể thay thế Light green cho Blue
aniline. Mặc dù Light green nhuộm màu collagen kém tương phản và
kém rõ nét hơn Blue aniline nhưng vẫn có thể chấp nhận được nếu như
Labo không có Blue aniline 39
TÀI LIỆU THAM KHẢO
DANH MỤC BẢNG

Xã hội càng phát triển, bệnh lý về mô liên kết gặp ngày càng nhiều. Xơ
gan là một minh chứng, thường gặp nhiều ở độ tuổi 40. Đây là một bệnh mạn
tính kéo dài có tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao. Đến nay, trên thế giới
cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và
Đông y). Bệnh gây tổn thương lan tỏa ở các thùy gan với xơ hóa, đảo lộn cấu
trúc bình thường của gan dẫn tới hình thành các u, cục tân tạo với các cấu trúc
không bình thường [9]. Nhiễm vius B, C là nguy cơ chính gây xơ gan. Kết
quả một số nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, tỷ lệ lưu hành virus viêm gan B
tại cộng đồng chiếm khoảng 10- 25% dân số, trong đó tỷ lệ nhiễm virus viêm
gan B ở người khoẻ (8- 25%); tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C (0,4- 4,1%) [2].
Một lý do khác gây xơ gan là do rượu, gặp nhiều ở các nước Châu Âu và các
nước có thói quen sử dụng rượu trong đó có Việt Nam.
Ngày nay, tiến bộ trong lĩnh vực khoa học đã giúp chẩn đoán sớm và
điều trị tốt cho bệnh nhân xơ gan nhưng tiên lượng của bệnh xơ gan vẫn rất dè
dặt. Việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ hóa của nhu mô gan là thực sự cần
thiết, nhất là những trường hợp xơ gan nặng. Có nhiều kỹ thuật hiện đại giúp
chẩn đoán xơ gan như: siêu âm, CT scanner nhưng sinh thiết gan phục vụ
chẩn đoán giải phẫu bệnh mới là tiêu chẩn vàng để đánh giá tình trạng xơ gan.
Phương pháp nhuộm hai màu thông thường bằng Hematoxylin và Eosin
1
không cho phép quan sát, đánh giá phân biệt bệnh lý của mô liên kết. Năm
1951, phương pháp nhuộm ba màu của nhà giải phẫu bệnh P. Masson được
mô tả như là một bước ngoặt đột phá giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩn
đoán bệnh học về mô liên kết. Phương pháp giúp phân biệt rõ được các thành
phần dựa trên sự tương phản màu sắc của mô: nhân, các hồng cầu, sợi huyết,
bào tương và đặc biệt là các sợi collagen.
Các đề tài nghiên cứu trong nước ứng dụng kỹ thuật nhuộm ba màu để
chẩn đoán, phân biệt bệnh lý về mô liên kết còn ít. Mặt khác, chưa có đề tài
nào nghiên cứu một cách toàn diện và cung cấp các thông tin đầy đủ về kỹ
thuật nhuộm ba màu, cũng như ưu, khuyết điểm, các yếu tố ảnh hưởng đến kĩ

1.2. Bệnh xơ gan
Xơ gan là bệnh mạn tính gây thương tổn nặng lan toả ở các thuỳ gan.
Đặc điểm thương tổn là mô xơ phát triển mạnh, đồng thời cấu trúc các tiểu
thuỳ và mạch máu của gan bị đảo lộn một cách không hồi phục được [1].
Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặc
nối tiếp:
- Tổn thương hoại tử của các tế bào nhu mô gan.
- Sự tăng sinh của mô xơ.
- Sự tạo thành những hòn, cục tái tạo và những tiểu thuỳ giả.
4
Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ
1.3. Vài nét về mô liên kết
Trong số các loại mô cơ bản thì mô liên kết là loại mô phổ biến nhất.
Mô liên kết có mặt ở hầu hết các bộ phận trong cơ thể, xen giữa các mô khác,
giúp chúng gắn bó với nhau [7].
Mô liên kết có nguồn gốc từ lá thai giữa, tức là trung mô. Trong cơ thể
có nhiều loại mô liên kết. Mỗi loại mô liên kết được tạo thành bởi:
- Thành phần gian bào: gồm phần lỏng gọi là dịch mô, phần đặc hơn
có đặc tính của một hệ keo gọi là chất căn bản.
- Các sợi liên kết vùi trong chất căn bản.
- Các tế bào liên kết nằm rải rác trong thành phần gian bào.
Mô liên kết là loại mô giàu thành phần gian bào (được coi như môi
trường bên trong cơ thể). Căn cứ vào sự khác nhau chủ yếu của chất căn bản
người ta phân mô liên kết thành ba loại lớn:
- Mô liên kết chính thức: có mật độ mềm và có mặt ở mọi nơi trong cơ thể.
- Mô sụn: chất căn bản nhiễm cartilagen (chất sụn) có mật độ rắn vừa phải.
- Mô xương: chất căn bản nhiễm ossein và muối canxi vì vậy mật độ rắn.
1.4. Sợi collagen
5
Sợi collagen là một trong ba loại sợi vùi trong chất căn bản liên kết

Nhuộm ba màu là một trong những phương pháp nhuộm để phân biệt
các thành phần khác nhau của mô liên kết. Thuật ngữ nhuộm ba màu là tên
thường dùng của kỹ thuật nhuộm chọn lọc cho cơ, sợi collagen, sợi huyết
và hồng cầu.
C.L Pierre Masson (1880-1959)
là một nhà giải phẫu bệnh người
Canada nổi tiếng của thế kỉ 20. Ông
được biết đến như nhà nghiên cứu về u
não và hệ thống thần kinh và những kỹ
thuật mô học như phương pháp nhuộm ba
màu đã trở thành chuẩn trong tất cả các
phòng xét nghiệm bệnh học [13], [14].
Hình 1.4: C.L Pierre Masson
Phương pháp nhuộm mang tên ông được mô tả lần đầu năm 1951 với
nguyên tắc nhuộm: nhuộm phối hợp ba loại phẩm nhuộm, một phẩm nhuộm
nhân bởi Hematoxylin (tốt nhất là Hematoxylin ferric); nhuộm bào tương và
các thành phần khác bằng hỗn hợp phẩm nhuộm acid (Fuchsin acid và
Ponceau S) và nhuộm sợi collagen bằng một phẩm nhuộm acid khác đặc hiệu
là Blue aniline.
1.5.2. Cơ chế nhuộm
7
Các mô xốp được nhuộm màu của các phân tử cực nhỏ của thuốc
nhuộm. Đầu tiên mô được nhuộm màu bởi thuốc nhuộm acid. Sau đó, khi
được nhuộm với các acid Phosphomolybdic, các thành phần ít thấm giữ lại
màu đỏ, trong khi đó màu đỏ bị kéo ra khỏi mô có bản chất collagen. Đồng
thời, gây ra một liên kết với collagen giúp gắn màu xanh của Blue aniline.
1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson
1.5.3.1. Hematoxylin
Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi
cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở

N
2
O
7
S
2
Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine
9
1.5.3.4. Acid Phosphomolybdic
Acid Phosphomolybdic, còn được gọi là acid molybdophosphoric
dodeca hoặc PMA là một thành phần của phương pháp nhuộm ba màu của
Masson. Nó là một hợp chất màu vàng- xanh, dễ tan trong nước và các dung
môi hữu cơ cực như ethanol.
Công thức: 12MoO
3
·H
3
PO
4
Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic
1.5.3.5. Blue aniline
Công thức: C
37
H
27
N
3
Na
2
O

Hình 1.10: Cấu trúc acid acetic
Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid 8 monoprotic. Nó tạo ra
gốc liên kết là acetat (CH
3
COO
−
). Dung dịch 1,0 M có pH là 2,4.
1.5.3.7. Light green
Công thức: C
37
H
34
N
2
Na
2
O
9
S
3
.
Hình 1.11: Cấu trúc Light green
11
1.6. Pha hóa chất
1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric
Dung dich A:
- Hematoxylin 1g
- Ethyl alchohol 95% 100ml
Dung dịch B:
- Nước cất 95ml

1.7. Tin hnh
* Bnh phm
Hai yêu cầu cơ bản trớc tiên của lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng và lấy
đủ. Những yêu cầu này dễ thực hiện đối với tử thiết hoặc bệnh phẩm phẫu
thuật hơn là với những sinh thiết bằng dụng cụ, nhất là khi tổn thơng ở sâu
hoặc trong các tạng [4], [8].
Bnh phm sau khi c ly s c c nh ngay. Mt bnh phm
c c nh tt phi m bo nhng nguyờn tc sau:
1. Bnh phm phi c c nh ngay sau khi ly.
2. Khụng c lm dp nỏt bnh phm.
3. Bnh phm khụng ct quỏ dy.
4. lng dung dch c nh cn thit.
5. Thi gian c nh dung dch thớch hp.
6. Khụng bnh phm dớnh vo thnh l.
Cỏc mu bnh phm dựng trong k thut mụ hc thng c ct dy
t 3 - 5 mm v c chuyn bng mỏy.
*Chuyn bnh phm
- p dng cho cỏc mnh sinh thit v cỏc mnh mụ nh [4], [5], [8].
Thi gian c nh ti thiu l 3 gi.
1) Ra nh trong nc chy.
2) Cn 80
o
- 10 phỳt.
3) Cn 95
o
x 3 ln x 15 - 20 phỳt.
4) Cn 100
o
x 3 ln x 15 phỳt/ ln.
5) Cn 100

đảm bảo đủ độ cứng mới cắt mảnh được. Độ nghiêng của lưỡi dao đặt và máy
cắt thích hợp là 45
o
. Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàn
tiêu bản (nóng không quá 50
o
C) [5], [8].
Như vậy một tiêu bản cắt được coi là đạt yêu cầu nếu:
- Mỏng đều.
- Không xước, gấp hoặc rách.
- Còn nguyên khuôn paraffin quanh bệnh phẩm.
14
- Vị trí của mảnh cắt đặt ở 2/3 của lam từ dưới lên (1/3 của lam từ trên
xuống để ghi mã số bệnh nhân, phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm) lúc
này bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính.
1.8. Tiến hành quy trình nhuộm
1.8.1. Quy trình nhuộm
• Lấy tiêu bản ra khỏi tủ ấm, tẩy paraffin lần lượt bằng Xylen I, II, III.
Sau đó chuyển tiêu bản qua cồn có nồng độ khác nhau từ cồn 100
0
đến cồn
95
0
và rửa nước nhẹ trong 5 phút.
• Cố định lại trong Bouin 1h, nhiệt độ 50
o
C.
• Nhuộm nhân trong Hematoxylin ferric 2 phút.
• Rửa nước chảy 2- 5 phút.
• Nhuộm bào tương bằng hỗn hợp Fuchsin acid và Ponceau S trong 5