B GIO DC V O TO B Y
T
TRNG I HC Y H NI
***.
NGUYN MNH TUN
THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM MASSONS
TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ GAN
Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN
KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA
KHểA 2009- 2013
H Ni- 2013
B GIO DC V O TO B Y T
TRNG I HC Y H NI
1
***.
NGUYN MNH TUN
THựC HàNH Kỹ THUậT NHUộM MASSONS
TRÊN MÔ BệNH HọC BệNH NHÂN XƠ GAN
Và TìM HIểU MộT Số YếU Tố LIÊN QUAN
KHểA LUN TT NGHIP C NHN Y KHOA
KHểA 2009- 2013
Hng dn khoa hc:
ThS. Nguyn Hu Quc
ThS. Hong Trung Kiờn
H Ni- 2013
2
LỜI CẢM ƠN
Em xin chân thành cảm ơn tới Ban Giám Hiệu, Phòng đào tạo Đại Học-
trường Đại Học Y Hà Nội đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện để em được học
tập, rèn luyện và tu dưỡng tại trường.
Với tất cả lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn

gan là một minh chứng,thường gặp nhiều ở độ tuổi 40.Đây là một bệnh mạn
tính kéo dài có tiên lượng xấu và tỷ lệ tử vong cao. Đến nay, trên thế giới
cũng như ở Việt Nam vẫn chưa có thuốc điều trị đặc hiệu (kể cả Tây y và
Đông y). Bệnh gây tổn thương lan tỏa ở các thùy gan với xơ hóa, đảo lộn cấu
trúc bình thường của gan dẫn tới hình thành các u, cục tân tạo với các cấu trúc
không bình thường [9]. Nhiễm vius B, C là nguy cơ chính gây xơ gan. Kết
quả một số nghiên cứu ở Việt Nam cho thấy, tỷ lệ lưu hành virus viêm gan B
tại cộng đồng chiếm khoảng 10- 25% dân số, trong đó tỷ lệ nhiễm virus viêm
gan B ở người khoẻ (8- 25%); tỷ lệ nhiễm virus viêm gan C (0,4- 4,1%)[2].
Một lý do khác gây xơ gan là do rượu, gặp nhiều ở các nước Châu Âu và các
nước có thói quen sử dụng rượu trong đó có Việt Nam.
Ngày nay, tiến bộ trong lĩnh vực khoa học đã giúp chẩn đoán sớm và
điều trị tốt cho bệnh nhân xơ gan nhưng tiên lượng của bệnh xơ gan vẫn rất dè
dặt. Việc đánh giá mức độ viêm gan và xơ hóa của nhu mô gan là thực sự cần
thiết, nhất là những trường hợp xơ gan nặng. Có nhiều kỹ thuật hiện đại giúp
chẩn đoán xơ gan như: siêu âm, CT scanner nhưng sinh thiết gan phục vụ
chẩn đoán giải phẫu bệnh mới là tiêu chẩn vàng để đánh giá tình trạng xơ gan.
Phương pháp nhuộm hai màu thông thường bằng Hematoxylin và Eosin
5
không cho phép quan sát, đánh giá phân biệt bệnh lý của mô liên kết. Năm
1951, phương pháp nhuộm ba màu của nhà giải phẫu bệnh P. Masson được
mô tả như là một bước ngoặt đột phá giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩn
đoán bệnh học về mô liên kết. Phương pháp giúp phân biệt rõ được các thành
phần dựa trên sự tương phản màu sắc của mô: nhân, các hồng cầu, sợi huyết,
bào tương và đặc biệt là các sợi collagen.
Các đề tài nghiên cứu trong nước ứng dụng kỹ thuật nhuộm ba màu để
chẩn đoán, phân biệt bệnh lý về mô liên kết còn ít. Mặt khác, chưa có đề tài
nào nghiên cứu một cách toàn diện và cung cấp các thông tin đầy đủ về kỹ
thuật nhuộm ba màu, cũng như ưu, khuyết điểm, các yếu tố ảnh hưởng đến kĩ
thuật nhuộm ba màu và cách khắc phục. Trên cơ sở đó, chúng tôi tiến hành

Xơ gan là bệnh mạn tính gây thương tổn nặng lan toả ở các thuỳ gan.
Đặc điểm thương tổn là mô xơ phát triển mạnh, đồng thời cấu trúc các tiểu
thuỳ và mạch máu của gan bị đảo lộn một cách không hồi phục được [1].
Hình thái học của xơ gan là kết quả của 3 quá trình đồng thời hoặc
nối tiếp:
- Tổn thương hoại tử của các tế bào nhu mô gan.
- Sự tăng sinh của mô xơ.
- Sự tạo thành những hòn, cục tái tạo và những tiểu thuỳ giả.
8
Hình 1.3: Hình thái bề mặt gan xơ
1.3. Vài nét về mô liên kết
Trong số các loại mô cơ bản thì mô liên kết là loại mô phổ biến nhất.
Mô liên kết có mặt ở hầu hết các bộ phận trong cơ thể, xen giữa các mô khác,
giúp chúng gắn bó với nhau [7].
Mô liên kết có nguồn gốc từ lá thai giữa, tức là trung mô. Trong cơ thể
có nhiều loại mô liên kết. Mỗi loại mô liên kết được tạo thành bởi:
 Thành phần gian bào: gồm phần lỏng gọi là dịch mô, phần đặc hơn
có đặc tính của một hệ keo gọi là chất căn bản.
 Các sợi liên kết vùi trong chất căn bản.
 Các tế bào liên kết nằm rải rác trong thành phần gian bào.
Mô liên kết là loại mô giàu thành phần gian bào (được coi như môi
trường bên trong cơ thể). Căn cứ vào sự khác nhau chủ yếu của chất căn bản
người ta phân mô liên kết thành ba loại lớn:
 Mô liên kết chính thức: có mật độ mềm và có mặt ở mọi nơi trong cơ thể.
 Mô sụn: chất căn bản nhiễm cartilagen (chất sụn) có mật độ rắn vừa phải.
 Mô xương: chất căn bản nhiễm ossein và muối canxi vì vậy mật độ rắn.
1.4. Sợi collagen
9
Sợi collagen là một trong ba loại sợi vùi trong chất căn bản liên kết
gồm: sợi collagen, sợi võng và sợi chun. Sợi collagen có mặt ở hầu hết các

các thành phần khác nhau của mô liên kết. Thuật ngữ nhuộm ba màu là tên
thường dùng của kỹ thuật nhuộm chọn lọc cho cơ, sợi collagen, sợi huyết
và hồng cầu.
C.L Pierre Masson (1880-1959)
là một nhà giải phẫu bệnh người
Canada nổi tiếng của thế kỉ 20. Ông
được biết đến như nhà nghiên cứu về u
não và hệ thống thần kinh và những kỹ
thuật mô học như phương pháp nhuộm ba
màu đã trở thành chuẩn trong tất cả các
phòng xét nghiệm bệnh học [13], [14].
Hình 1.4: C.L Pierre Masson
Phương pháp nhuộm mang tên ông được mô tả lần đầu năm 1951 với
nguyên tắc nhuộm: nhuộm phối hợp ba loại phẩm nhuộm, một phẩm nhuộm
nhân bởi Hematoxylin (tốt nhất là Hematoxylin ferric); nhuộm bào tương và
các thành phần khác bằng hỗn hợp phẩm nhuộm acid (Fuchsin acid và
Ponceau S) và nhuộm sợi collagen bằng một phẩm nhuộm acid khác đặc hiệu
là Blue aniline.
1.5.2. Cơ chế nhuộm
11
Các mô xốp được nhuộm màu của các phân tử cực nhỏ của thuốc
nhuộm. Đầu tiên mô được nhuộm màu bởi thuốc nhuộm acid. Sau đó, khi
được nhuộm với các acid Phosphomolybdic, các thành phần ít thấm giữ lại
màu đỏ, trong khi đó màu đỏ bị kéo ra khỏi mô có bản chất collagen. Đồng
thời, gây ra một liên kết với collagen giúp gắn màu xanh của Blue aniline.
1.5.3. Hóa chất dùng trong phương pháp nhuộm ba màu Masson
1.5.3.1. Hematoxylin
Hematoxylin: là một phẩm nhuộm tự nhiên, chiết xuất bằng ete từ lõi
cây Haematoxylon campechianum mọc trong vùng nhiệt đới Campeche ở
Mexico [8].

2
O
7
S
2
Hình 1.7: Cấu trúc Ponceau de xylindine
13
1.5.3.4. Acid Phosphomolybdic
Acid Phosphomolybdic, còn được gọi là acid molybdophosphoric
dodeca hoặc PMA là một thành phần của phương pháp nhuộm ba màu của
Masson. Nó là một hợp chất màu vàng- xanh, dễ tan trong nước và các dung
môi hữu cơ cực như ethanol.
Công thức: 12MoO
3
·H
3
PO
4
Hình 1.8: Cấu trúc acid Phosphomolybdic
1.5.3.5. Blue aniline
Công thức: C
37
H
27
N
3
Na
2
O
9

Acid acetic là một acid yếu, thuộc nhóm acid 8 monoprotic. Nó tạo ra
gốc liên kết là acetat (CH
3
COO
−
). Dung dịch 1,0 M có pH là 2,4.
1.5.3.7. Light green
Công thức: C
37
H
34
N
2
Na
2
O
9
S
3
.
Hình 1.11: Cấu trúc Light green
15
1.6. Pha hóa chất
1.6.1. Dung dịch Hematoxylin Ferric
Dung dich A:
- Hematoxylin 1g
- Ethyl alchohol 95% 100ml
Dung dịch B:
- Nước cất 95ml
- FeCl

* Bnh phm
Hai yêu cầu cơ bản trớc tiên của lấy bệnh phẩm là: phải lấy trúng và lấy
đủ. Những yêu cầu này dễ thực hiện đối với tử thiết hoặc bệnh phẩm phẫu
thuật hơn là với những sinh thiết bằng dụng cụ, nhất là khi tổn thơng ở sâu
hoặc trong các tạng [4], [8].
Bnh phm sau khi c ly s c c nh ngay. Mt bnh phm
c c nh tt phi m bo nhng nguyờn tc sau:
1. Bnh phm phi c c nh ngay sau khi ly.
2. Khụng c lm dp nỏt bnh phm.
3. Bnh phm khụng ct quỏ dy.
4. lng dung dch c nh cn thit.
5. Thi gian c nh dung dch thớch hp.
6. Khụng bnh phm dớnh vo thnh l.
Cỏc mu bnh phm dựng trong k thut mụ hc thng c ct dy
t 3 - 5 mm v c chuyn bng mỏy.
*Chuyn bnh phm
- p dng cho cỏc mnh sinh thit v cỏc mnh mụ nh [4], [5], [8].
Thi gian c nh ti thiu l 3 gi.
1) Ra nh trong nc chy.
2) Cn 80
o
- 10 phỳt.
3) Cn 95
o
x 3 ln x 15 - 20 phỳt.
4) Cn 100
o
x 3 ln x 15 phỳt/ ln.
5) Cn 100
o

cắt thích hợp là 45
o
. Chất lượng của mảnh cắt còn phụ thuộc vào nhiệt độ dàn
tiêu bản (nóng không quá 50
o
C) [5], [8].
Như vậy một tiêu bản cắt được coi là đạt yêu cầu nếu:
- Mỏng đều.
- Không xước, gấp hoặc rách.
- Còn nguyên khuôn paraffin quanh bệnh phẩm.
18
- Vị trí của mảnh cắt đặt ở 2/3 của lam từ dưới lên (1/3 của lam từ trên
xuống để ghi mã số bệnh nhân, phía 2/3 dùng để dán nhãn sau khi nhuộm) lúc
này bệnh phẩm nằm ở chính giữa lam kính.
1.8. Tiến hành quy trình nhuộm
1.8.1. Quy trình nhuộm
• Lấy tiêu bản ra khỏi tủ ấm, tẩy paraffin lần lượt bằng Xylen I, II, III.
Sau đó chuyển tiêu bản qua cồn có nồng độ khác nhau từ cồn 100
0
đến cồn
95
0
và rửa nước nhẹ trong 5 phút.
• Cố định lại trong Bouin 1h, nhiệt độ 50
o
C.
• Nhuộm nhân trong Hematoxylin ferric 2 phút.
• Rửa nước chảy 2- 5 phút.
• Nhuộm bào tương bằng hỗn hợp Fuchsin acid và Ponceau S trong 5
phút.

2.3.2. Cỡ mẫu
40 trường hợp đã được chẩn đoán xác định là xơ gan.
2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Thiết kế nghiên cứu
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu theo phương pháp mô tả cắt ngang có
phân tích.
2.4.2. Phương pháp lấy mẫu
21
Các bloc chúng tôi nghiên cứu đều đã được cố định bằng formol 10%.
Mỗi mẫu của bệnh nhân sẽ được cắt làm 6 tiêu bản, chia thành 3 nhóm,
mỗi nhóm 2 tiêu bản bao gồm:
● 2 tiêu bản trong đó: 1 tiêu bản sau khi tẩy sạch paraffin và rửa nước
sẽ được cố định bằng dung dịch Bouin ở nhiệt độ 50
o
C trong 1 giờ và 1 tiêu
bản không cố định qua Bouin, các bước khác trong quy trình nhuộm hoàn
toàn giống nhau.
● 2 tiêu bản trong đó: 1 tiêu bản được nhuộm bởi dung dịch xanh blue
aniline và 1 tiêu bản được nhuộm bởi dung dịch Light green, các bước khác
trong quy trình nhuộm hoàn toàn giống nhau.
● 2 tiêu bản trong đó: 1 tiêu bản được biệt hóa bằng acid acetic 1% và 1
tiêu bản không biệt hóa bằng acid acetic 1%, các bước khác trong quy trình
nhuộm hoàn toàn giống nhau.
2.4.3. Phương tiện nghiên cứu
Nghiên cứu tiến hành trên 40 mẫu bệnh phẩm xơ gan của bệnh nhân
được lấy tại Bộ môn Giải phẫu bệnh, trường Đại học Y Hà Nội và Khoa Giải
phẫu bệnh bệnh viện Hữu nghị Việt Đức.
• TiÕn hµnh chuyÓn b»ng m¸y chuyÓn STP 20.
• §óc bloc b»ng m¸y ®óc AP 280.
• TiÕn hµnh c¾t vµ d¸n m¶nh: độ dày miếng cắt dày 3 µm. Sau đó

23
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá kết quả thực hành kỹ thuật
Bảng 3.1: Kết quả thực hành tháng thứ nhất
Nội dung Số lượng tiêu bản Tỷ lệ %
Đẹp 10 23,8
Đạt 20 47,6
Chưa đạt 12 28,6
Tổng 42 100
Nhận xét:
- Kết quả bảng 3.1 cho thấy: tháng thứ nhất số lượng tiêu bản đẹp ít, chỉ
chiếm 23,8%. Tỷ lệ tiêu bản chưa đạt nhiều, lên tới 28,6%.
- Tỷ lệ tiêu bản đạt yêu cầu là 47,6%.
Bảng 3.2: Kết quả thực hành tháng thứ hai
Nội dung Số lượng tiêu bản Tỷ lệ %
Đẹp 20 37,0
Đạt 25 46,3
Chưa đạt 9 16,7
Tổng 54 100
Nhận xét:
- Kết quả bảng 3.2 cho thấy: số lượng tiêu bản đẹp chiếm tỷ lệ cao
(37,0%). Tiêu bản chưa đạt chiếm tỷ lệ thấp nhất (16,7%).
24
Bảng 3.3: Kết quả thực hành tháng thứ ba
Nội dung Số lượng tiêu bản Tỷ lệ %
Đẹp 30 45,5
Đạt 29 43,9
Chưa đạt 7 10,6
Tổng 66 100