ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM THẾ ANH XÂY DỰNG HỆ THỐNG NUÔI CẤY RỄ TÓC VÀ ỨNG
DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT
ARTEMISININ Ở CÂY THANH HAO (ARTEMISIA
ANNUA. LINN)
Chuyên ngành: Sinh lý Thực vật
Mã số: 6042302 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC


giúp đỡ tôi trong ba năm học vừa qua.
Cảm ơn cô Bùi Thị Tường Thu, bạn Lê Thị Hiền, bạn Trần Trọng Tuấn,
cùng các anh chị, các bạn Phòng Công nghệ phôi soma - Viện Sinh học Nhiệt
đới đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện đề tài này.
Cảm ơn các đồng nghiệp và bạn bè đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến, chia sẽ và
động viên trong suốt thời gian làm luận văn cũng như trong công việc và cuộc
sống. Phạm Thế Anh
i Mục
lục Phạm Thế Anh SLTVK17
MỤC LỤC
Mục lục i
Danh mục chữ viết tắt vi
Danh mục bảng vii
Danh mục biểu đồ viii
Danh mục hình ix
Danh mục ảnh x
Lời mở đầu 1
1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét 3
1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua 3
1.1.1.1. Hệ thống phân loại. 3
1.1.1.2. Đặc điểm phân bố 3
1.1.1.3. Đặc điểm sinh thái 4
1.1.1.3.1. Điều kiện sống 4

1.3.3.5.3. Phân loại bioreactor 25
1.3.3.5.4. Ứng dụng bioreactor trong công nghệ nuôi cấy rễ
chuyển gen và sản xuất hợp chất thứ cấp. 26
1.4. Sắc ký lỏng cao áp HPLC 27
1.4.1. Nguyên tắc 27
1.4.2. Thiết bị 28
iii
Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17
2. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. VẬT LIỆU 29
2.1.1. Nguồn mẫu ban đầu 29
2.1.2. Môi trường nuôi cấy 29
2.1.3. Dụng cụ thiết bị 29
2.2. PHƯƠNG PHÁP 29
2.2.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 29
2.2.1.1. Gieo hạt in vitro 29
2.2.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 29
2.2.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 31
2.2.1.3.1. Tách chiết DNA thực vật 31
2.2.1.3.2. Tách chiết plasmid DNA của Agrobacterium rhizogenes
ATCC 11325 31
2.2.1.3.3. Phân tích PCR kiểm tra quá trình chuyển gen 32
2.2.1.4. Phân tích CĐHSTTV của rễ chuyển gen bằng phương pháp
sinh trắc nghiệm 33
2.2.1.5. Định tính artemisinin trong rễ tóc bằng phương pháp TLC 36
2.2.1.5.1. Nguyên tắc 36
2.2.1.5.2. Cách tiến hành 37

2.2.3.5.1. Chu kỳ ngập chìm trong nuôi cấy bioreactor 43
2.2.3.5.2. Ảnh hưởng của YE và chitosan đến sự tích tụ artemisinin 43
2.2.4. Định lượng artemisinin bằng phương pháp HPLC với bộ phản ứng
sau cột và đầu dò UV 43
2.2.4.1. Chuẩn bị mẫu 43
2.2.4.2. Định lượng artemisinin 44
2.3. XỬ LÝ THỐNG KÊ 45 3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Chuyển gen tạo rễ tóc vào mô lá Thanh hao 46
3.1.1. Gieo hạt in vitro 46
3.1.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 47
v
Mục lục Phạm Thế Anh SLTVK17
3.1.3. Kiểm tra kết quả chuyển gen 50
3.1.4. Đo hoạt tính CĐHSTTV 52
3.1.5. Định tính artemisinin 54
3.2. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng 55
3.3. Nuôi cấy rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm thời 62
4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN 71
4.2. ĐỀ NGHỊ 72
TÀI LIỆU THAM KHẢO 73
PHỤ LỤC

vi Danh mục

Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46
Biểu đồ 3.2. Hoạt tính Auxin, ABA, Cytokinin và Giberelin tổng ở rễ đối
chứng và rễ tóc chuyển gen 52
Biểu đồ 3.3. Ảnh hưởng của môi trường đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 56
Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng của đạm nitrate đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 57
Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
đến khả năng tích tụ artemisinin
(nuôi cấy lỏng) 58
Biểu đồ 3.6. Ảnh hưởng của photphat

đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 59
Biểu đồ 3.7. Ảnh hưởng của BA

đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 60
Biểu đồ 3.8. Ảnh hưởng của GA
3đến tích tụ artemisinin (nuôi cấy lỏng) 61
Biểu đồ 3.9. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến

đến tích tụ artemisinin (nuôi
cấy lỏng) 62

PO
4
nuôi cấy thí nghiệm 40
Bảng 2.6. Bảng bố trí các hàm lượng BA nuôi cấy thí nghiệm 40
Bảng 2.7. Bảng bố trí các hàm lượng GA
3
nuôi cấy thí nghiệm 41
Bảng 3.1. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong gieo hạt in vitro 46
Bảng 3.2. Hoạt tính các chất điều hòa sinh trưởng thực vật tổng cộng ở rễ tóc
chuyển gen và rễ đối chứng 52
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng khoáng đến tích tụ
artemisinin 55
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của đạm nitrat đến tích tụ artemisinin 56
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ NH
4
+
/NO
3
đến tích tụ artemisinin 57
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của photphat đến tích tụ artemisinin 58
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của BA đến tích tụ artemisinin 59
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của GA
3
đến tích tụ artemisinin 60
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của môi trường cải tiến đến tích tụ artemisinin 61
Bảng 3.10. Động thái sinh trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm
thời 62
Bảng 3.11. Biến động của pH môi trường nuôi cấy đến tích tụ artemisinin 64
Bảng 3.12. Biến động của chu kỳ chiếu sáng đến tích tụ artemisinin 65
Bảng 3.13. Biến động của nhiệt độ đến tích tụ artemisinin 66
Phạm Thế Anh SLTVK17
DANH MỤC ẢNH

Trang
Ảnh 1. Hệ thống máy HPLC (Waters, Mỹ) 28
Ảnh 3.1. Gieo hạt in vitro 47
Ảnh 3.2. Chuyển gen cảm ứng tạo rễ tóc 48
Ảnh 3.3. Hình thành rễ thứ cấp từ rễ bất định ban đầu 48
Ảnh 3.4. Quá trình hình thành rễ tóc từ mẫu mô lá được chuyển gen 49
Ảnh 3.5. Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rolA trên rễ tóc chuyển
gen 50
Ảnh 3.6. Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rolB trên rễ tóc chuyển
gen 51
Ảnh 3.7. Kết quả phân tích PCR kiểm tra gen rol trên rễ tóc chuyển gen 51
Ảnh 3.8. Rễ tóc tăng trưởng trên môi trường thạch MS không bổ sung
CĐHSTTV 53
Ảnh 3.9. Phát hiện artemisinin bằng TLC 54
Ảnh 3.10. Tăng trưởng rễ tóc trên môi trường B5, MS và LV 55
Ảnh 3.11. Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường MS và môi trường cải tiến MSI 61
Ảnh 3.12. Động thái tăng trưởng của rễ tóc trong bioreactor ngập chìm tạm
thời 63
Ảnh 3.13. Sinh trưởng của rễ tóc trên môi trường MS, MSI và MSII 67
Ảnh 3.14. Chu kỳ nổi và ngập môi trường 69
1 Lời mở
dầu Phạm Thế Anh SLTVK17

dầu Phạm Thế Anh SLTVK17
Nhằm mục tiêu giải quyết phần nào tình trạng thiếu thuốc chữa trị sốt rét
hiện nay,chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xây dựng hệ thống nuôi
cấy rễ tóc và ứng dụng trong nghiên cứu sản xuất artemisinin ở cây Thanh
hao (Artemisia annua. Linn)”
Đề tài gồm những nội dung chính sau:
ü Thiết lập qui trình chuyển gen tạo rễ tóc ở cây Thanh hao
ü Nuôi cấy rễ tóc trên môi trường lỏng
ü Nuôi cấy rễ tóc trên bioreactor ngập chìm tạm thời
ü Tách chiết hợp chất thứ cấp và sử dụng phương pháp TLC
và HPLC để định tính và định lượng hàm lượng artemisinin
trong rễ tóc.
Đề tài này được thực hiện tại phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về
Công nghệ tế bào thực vật thuộc Viện sinh học Nhiệt đới. 3 Chương 1. Tổng
quanPhạm Thế Anh SLTVK17
1.1. Tổng quan về cây Thanh hao Artemisia annua L và bệnh sốt rét
1.1.1. Cây Thanh hao Artemisia annua
1.1.1.1. Hệ thống phân loại
Theo Mabberley (1997), hệ thống phân loại của cây Thanh hao như sau:
Giới: Plantae
Ngành: Magnoliophyta

Ø Khí hậu: Thanh hao có biên độ sinh thái rộng, sinh trưởng được ở các
vùng ôn đới ẩm và cả ở vùng nhiệt đới gió mùa nóng ẩm Việt Nam. Tuy nhiên,
vùng phân bố tự nhiên của Thanh hao hoa vàng ở miền Bắc Việt Nam bị ảnh
hưởng nhiều bởi gió mùa đông bắc từ cuối thu đến xuân.
Ø Ánh sáng: Thanh hao hoa vàng là loại cây ưa sáng và ẩm. Trong tự
nhiên, có thể thấy cây hơi chịu bóng khi mọc lẫn với một số cây cỏ và cây bụi ở
vùng đồi và chân núi đá vôi. Theo “Trung dược thông báo” tập 11, số 7, 1986
chế độ chiếu sáng ảnh hưởng trực tiếp đến hàm lượng artemisinin trong lá; độ
che bóng càng cao thì hàm lượng hoạt chất này càng giảm.
Ø Yêu cầu đất: phạm vi thích ứng rộng, đất giàu dinh dưỡng, thoát nước,
tưới tiêu thuận tiện, pH đất = 5,0 – 6,5.
1.1.1.3.2. Vòng đời
Hàng năm, từ giữa tháng 2 đến đầu tháng 3, khi nhiệt độ không khí ấm dần
lên (16 – 18
o
C), hạt Thanh hao trong tự nhiên bắt đầu nẩy mầm. Trong thời
gian từ khoảng 2 – 2,5 tháng đầu, cây con sinh trưởng chậm; trung bình chỉ cao
8 – 10,2 cm/tháng. Lúc này, cây chưa có hoạt chất.
Khi cây được 3,5 – 4 tháng tuổi là thời kỳ sinh trưởng mạnh, bắt đầu phân
cành và có chiều cao đạt trên 1 m, tăng trung bình 15,3 – 17,7 cm/tháng; hàm
5 Chương 1. Tổng
quanPhạm Thế Anh SLTVK17
lượng hoạt chất trong lá tăng rất nhanh, cho đến khi bắt đầu có hoa được xem là
cực điểm.
Đến cuối tháng 7 hoặc đầu tháng 8 cây sinh trưởng chậm lại; số lá xanh trên
cây giảm đi, do các lá phía gốc già và rụng.
Hoa Thanh hao hoa vàng nở từ dưới lên trên và từ ngoài vào trong. Quả già

Phạm Thế Anh SLTVK17
artemisiaceton, linalol, limonen oxyd, camphor 23,75%, artemisialcol, 4 –
terpineol, 2 – methylen – 5 – isopropenylcyclohexanol, geranyl acetat, b -
cubeben, a - cubebon - b - caryophylen 6,29%, b - farnesen, D - cadinen
(Nguyễn Xuân Dũng và cs, 1990).
Theo Harman J. Woerdenbag và cộng sự (1994), lá thanh hao hoa vàng cho
các hàm lượng cao nhất về artemisinin (0,86%), acid artemisinic (0,16%) và
artennuin B (0,08%) vào thời điểm cây được 5 tháng tuổi. Sau đó, hàm lượng
các chất này đều giảm đi. Tinh dầu đạt hàm lượng tối đa (1%) trước khi cây ra
hoa. Lúc này, tinh dầu chứa monoterpen 55% và sesquiterpen 45%.
1.1.2. Tổng quan Bệnh sốt rét và liệu pháp chữa trị
1.1.2.1. Sơ lược về bệnh sốt rét
Bệnh sốt rét đã trở thành vấn đề toàn cầu, là căn bệnh thường thấy ở 105
quốc gia, phổ biến ở nhiều vùng thuộc châu Á, châu Phi, Trung Mỹ và Nam
Mỹ. Hàng năm, có 300 – 500 triệu người trên khắp thế giới bị nhiễm bệnh và
hơn một triệu người chết vì căn bệnh này. Tình trạng mắc bệnh và tử vong, đặc
biệt là ở trẻ em và thai phụ do sốt rét đang ở báo động mạnh. Du khách và dân
nhập cư mang bệnh sốt rét là một trong những nguyên nhân khiến bệnh sốt rét
lan truyền khắp thế giới.
Mỗi ngày tại châu Phi có đến 3.000 trẻ em tử vong vì sốt rét (thống kê năm
2003), nghĩa là cứ mỗi 30 giây lại có một em chết vì căn bệnh này. Hai loại
muỗi A. gambiae và A. funesus được xem là “vô địch” trong lĩnh vực truyền
bệnh cho người tại đây. Bệnh gây thiệt hại khoảng 12 tỷ USD / năm cho châu
Phi, chiếm đến 40% ngân sách phục vụ sức khỏe cộng đồng.
Việt Nam cũng nằm trong khu vực sốt rét nặng của thế giới. Khoảng 60
năm trước, mỗi năm nước ta có gần 1 triệu người mắc bệnh, chiếm 5% dân số
(Morin, 1926), tỉ lệ tử vong đến 20%. Chương trình thanh toán sốt rét được tiến
hành từ năm 1960 nhưng hiện vẫn có khoảng 45 triệu dân ta sống trong vùng
lưu hành sốt rét. Các vùng này chiếm 3/4 diện tích cả nước gồm vùng rừng núi
phía Bắc, ven dọc Trường Sơn, cao nguyên miền Trung, khu vực Đông Nam,

Năm 1979, Trung Quốc đã tiến hành một cuộc thử nghiệm lâm sàng dùng
artemisinin trên 2.099 bệnh nhân sốt rét. Một kết quả không tưởng là tất cả đều
hết bệnh. Ngoài ra, artemisinin dùng trên 143 bệnh nhân sốt rét với ký sinh
trùng đã nhờn thuốc chloroquine và 141 bệnh sốt rét màng não cũng cho kết
quả khả quan. Nhiều thử nghiệm lâm sàng tiếp theo ở Trung Quốc, Đông Nam
Á đều cho các kết quả tương tự.
Ở Việt Nam, trong một thử nghiệm năm 1993 trên 638 bệnh nhân, dùng
8 Chương 1. Tổng
quanPhạm Thế Anh SLTVK17
thuốc uống artemisinin cho thấy: trong vòng 24 tiếng, 98% ký sinh trùng sốt rét
biến mất. Nhóm bệnh nhân dùng thuốc trong 5 ngày chỉ có 10% là ký sinh
trùng xuất hiện lại. Artemisinin chống được cả P.falciparum và P.vivax. Trong
một thử nghiệm khác năm 1999, kết quả tốt nhất là dùng artemisinin và sau đó
dùng quinine trong 3 - 5 ngày sau.
Artemisinin là hoạt chất chính của cây Thanh hao hoa vàng. Khi cây ra nụ,
lá Thanh hao được thu hoạch có màu vàng nâu hoặc nâu sẫm, giòn dễ vụn nát,
mùi thơm hắc đặc biệt, vị đắng. Đây là lúc lá có hàm lượng artemisinin cao
nhất, 1,6% trong lá khô ( lá xanh chỉ có 0,6% artemisinin). Lá Thanh hao được
tán nhuyễn, xay thành bột để chiết xuất hoạt chất artemisinin.
Ngày nay, artemisinin được coi là phòng tuyến hữu hiệu cuối cùng trong
kho vũ khí chống ký sinh trùng sốt rét
1.2. Sinh tổng hợp artemisinin
Wang và cộng sự (2004) nghiên cứu về sự ảnh hưởng của gen fpf1
(flowering promoting factor1) ở thời điểm Thanh hao ra hoa, mối liên hệ giữa
việc nở hoa và quá trình tổng hợp artemisinin nhận thấy sự ra hoa không là yếu
tố cần thiết cho sự gia tăng hàm lượng artemisinin; thời điểm thu hoạch tốt nhất
là lúc cây ở cuối giai đoạn sinh trưởng và có sự tạo chồi.

reductase
HMGS: HMG-CoA synthase; IDS isopentenyl diphosphate synthase
MCS: 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase
MDD: mevalonate diphosphate decarboxylase
MK: mevalonate kinase
MPK: mevalonate-5-phosphate kinase
SES: sesquiterpene synthase
Mới đây, hai gen mã hóa cho deoxy–D-xylulose-5-phosphate synthase
(DXPS) và deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase (DXPR) được
tách từ rễ cây Thanh hao chuyển gen đã chứng minh được rằng con đường sinh
tổng hợp terpenoid diễn ra trong thể hạt (Krushkal và cs. 2003; Souret và cs.
2002). Do đó, con đường mevalonate không phải là con đường duy nhất để
tổng hợp artemisinin trong cây Thanh hao. Akhila và cộng sự (1987) đề nghị
con đường sinh tổng hợp artemisinin hoàn chỉnh bắt đầu từ mevalonic acid và
IPP. Tiếp theo là sự tổng hợp farnesyl pyrophosphate (FPP), germacrane
skeleton, dihydrocostunolide, cadinanolide, arteannuin B, và artemisinin. Hàm
lượng của artemisinic acid gấp 8 – 10 lần so với artemisinin ở cây Thanh hao.
Vì thế, có giả thuyết cho rằng acid artemisinic là tiền chất cho sự sinh tổng hợp
artemisinin B và artemisinin. Sangwan và cộng sự (1993) cho rằng có sự biến
đổi acid artemisinic thành artemisinin B và artemisinin cả ở cây tự nhiên và
trong tế bào nuôi cấy.
Bertea và cộng sự (2005) đã nhận biết được chất trung gian và các enzyme
liên quan đến sự tổng hợp artemisinin ở Thanh hao. Một số enzyme liên quan
đến sự tổng hợp artemisinin như 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A
reductase (HMGR), farnesyl diphosphate synthase (FPPS), and sesquiterpene
synthase (SES).
11 Chương 1. Tổng
quan
việc nuôi cấy rễ tóc chuyển gen, bao gồm mối liên quan giữ tốc độ phát triển
nhanh (trong môi trường không có CĐHSTTV), sự bền vững về mặt di truyền
12 Chương 1. Tổng
quanPhạm Thế Anh SLTVK17
và sinh hoá học, khả năng sinh tổng hợp chất chuyển hoá tới sự phát sinh cơ
quan (Shanks và Morgan, 1999; Sevon và Okman-Caldentey, 2002). Thêm vào
đó, gần đây sự phát triển hệ thống bioreactor mở ra nhiều triển vọng trong việc
nuôi cấy rễ chuyển gen ở qui mô công nghiệp (Guillon và cs., 2006). Hơn nữa,
những quan tâm về hệ thống nuôi trồng rễ chuyển gen đến từ các công ty tư
nhân (ROOTec bioactives GmbH, Basel, Thụy Sĩ), có thể dễ dàng chuyển giao
kiến thức từ các phòng thí nghiệm nghiên cứu sang công nghiệp dược phẩm .
Các báo cáo tổng kết gần đây phát triển các nghiên cứu về rễ chuyển gen,
bao gồm các phương pháp chuyển gen từ thực vật, sản xuất các hợp chất có
hoạt tính sinh học và gia tăng hàm lượng các chất thứ cấp mong muốn. Ngoài
ra còn đề cập đến các kiểu bioreactor cho nuôi cấy rễ tóc chuyển gen và quy
trình nuôi cấy qui mô lớn.
1.3.1.2. Nguồn gốc và quy trình chuyển gen tạo rễ tóc
Agrobacterium rhizogenes là một loài rất gần với Agrobacterium
tumefaciens. Chúng gây ra bệnh trên tầng lông hút của rễ cây song tử diệp. A.
rhizogenes cũng có một plasmid có khả năng tạo rễ, được gọi là “Ri plasmid”.
Phần T-DNA của Ri plasmid sẽ được chuyển vào nhân tế bào thực vật, khi sự
chuyển nạp gen xảy ra, giống như sự chuyển nạp gen của Ti plasmid T-DNA.
Rễ nhánh bất định, có khối u sần sùi được tạo ra ở vùng bị nhiễm. Người ta
hiện biết tương đối ít về T-DNA của Ri plasmid. Trong nhiều dòng A.
rhizogenes, sản xuất opine agropine, T-DNA được tách ra thành 2 phần: TL và
TR. Các gen tổng hợp agropine và auxin định vị trên đoạn sau cùng. Điều này
khác với octopine Ti plasmid, chúng có gen tổng hợp auxin trên đoạn TL. Điều

biến T-DNA) và trong tế bào thực vật (vi khuẩn xâm nhiễm, chuyển T-DNA,
xâm nhập nhân tế bào, và gắn chèn T-DNA) được in đậm, cùng với các gen
và protein làm trung gian giữa các bước (theo Gelvin, 2000).