Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
LÊ THÀNH CÔNG
PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN VÀ NGHIÊN CỨU
KHẢ NĂNG PHÂN HỦY PHENOL CỦA MỘT SỐ
CHỦNG VI KHUẨN TẠO MÀNG SINH HỌC
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS. Nghiêm Ngọc Minh
THÁI NGUYÊN - 2014
giúp đỡ và chỉ bảo tận tình tôi trong quá trình hoàn thành luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo Khoa Khoa học sự sống - Trường
Đại học Khoa học, đặc biệt là PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh - Trưởng Khoa
Khoa học sự sống đã tạo điều kiện, giới thiệu, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học
tập và nghiên cứu tại trường.
Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè và người
thân đã luôn động viên, khích lệ và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Với tất cả những tình cảm và lòng biết ơn chân thành sâu sắc, tôi xin cảm ơn
tất cả những sự giúp đỡ quý báu đó.
Thái Nguyên, tháng 5 năm 2014
Học Viên
Lê Thành Công
iii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN i
LỜI CẢM ƠN ii
MỤC LỤC iii
DANH MỤC CÁC BẢNG vi
DANH MỤC CÁC HÌNH vii
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT ix
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Cấu trúc, tính chất vật lý, hóa học của phenol 3
1.1.1. Cấu trúc phenol 3
1.1.2. Tính chất vật lý 3
1.1.3. Tính chất hóa học 3
phenol 25
2.2.4. Đánh giá và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 26
2.2.5. Phân loại và định tên một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học 27
2.2.6. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng
sinh học do các chủng vi khuẩn tạo thành 30
2.2.7. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của màng sinh học đa chủng tạo
thành ở điều kiện tối ƣu 31
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33
3.1. Thu thập mẫu và phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol 33
v
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
3.1.1. Thu thập mẫu 33
3.1.2. Phân lập một số chủng có khả năng phân huỷ phenol 33
3.1.3. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng tốt 36
3.1.4. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc và tế bào của các chủng nghiên cứu 37
3.2. Phân loại và định tên 3 chủng tạo biofilm tốt 38
3.2.1. Tách chiết DNA tổng số 38
3.2.2. Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR 39
3.3. Nghiên cứu một số điều kiện hoá lý ảnh hƣởng tới khả năng tạo màng sinh
học 41
3.3.1. Ảnh hƣởng của pH 41
3.3.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 42
3.3.3. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 43
3.3.4. Ảnh hƣởng của nguồn nitor 44
3.4. Đánh giá khả năng phân huỷ phenol của biofilm đa chủng tạo thành ở điều
kiện tối ƣu 45
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 49
PHỤ LỤC 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
Hình 3.4. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của các chủng vi khuẩn 36
Hình 3.5. Khả năng tạo biofilm của 8 chủng vi khuẩn 36
Hình 3.6. Khả năng tạo màng của 8 chủng vi khuẩn 37
Hình 3.7. Hình ảnh điện di DNA tổng số 3 chủng vi khuẩn 39
Hình 3.8. Hình ảnh điện di sản phẩm nhân đoạn gen 16S rRNA của các chủng vi khuẩn 39
Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại của 3 chủng ĐGP2, ĐGP4 và ĐGP8 40
Hình 3.10. Ảnh hƣởng của pH lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 42
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nhiệt độ lên khả năng tạo biofilm của các chủng vi khuẩn 43
Hình 3.12. Ảnh hƣởng của nguồn carbon lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn 44
Hình 3.13. Ảnh hƣởng của nguồn nitor lên khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi
khuẩn 45
Hình 3.14. Khả năng sinh trƣởng và phát triển của màngsinh học do các chủng vi khuẩn
tạo thành ở các nồng độ phenol khác nhau 46
viii
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Hình 3.15. Hiệu suất phân hủy 150 ppm phenol của màng sinh học đa chủng của mẫu đối
chứng và mẫu thí nghiệm sau 7 ngày xử lý 47
ix
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
BẢNG CHỮ VIẾT TẮT
DNA : Deoxyribonucleic acid
EPS : Extracellular Polymeric Substances (hợp chất ngoại bào)
h : hour (giờ)
ô nhiễm đó, phenol là một hợp chất hữu cơ khó phân hủy, độc hại, ảnh hƣởng
nghiêm trọng tới môi trƣờng và sức khỏe con ngƣời. Chính vì vậy, việc loại bỏ
nguồn ô nhiễm phenol ra khỏi môi trƣờng là việc làm cấp thiết.
Hiện nay, việc xử lý các hợp chất hữu cơ độc hại nói chung và phenol nói
riêng theo phƣơng pháp phân huỷ sinh học đang là một hƣớng đi mới đầy triển vọng
và thu hút đƣợc sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới và trong nƣớc.
Bản chất của phƣơng ph
. Một trong các phƣơng
pháp phân huỷ sinh học đƣợc ứng dụng hiện nay là công nghệ màng sinh học
(biofilm) do các vi sinh vật tạo ra. Bản chất của biofilm là một tập hợp các vi sinh
vật gắn trên một bề mặt của vật thể rắn hoặc bề mặt phân cắt giữa các chất lỏng tạo
thành lớp màng polysaccharide ngoại bào bao phủ để bảo vệ các tế bào vi sinh vật
trong đó. Biofilm giúp các vi sinh vật có khả năng liên kết chặt chẽ với nhau, tạo
thành một cấu trúc bền vững khó bị phá hủy bởi các tác nhân bên ngoài nhƣ sự thay
đổi pH, nhiệt độ, nồng độ muối hay tốc độ dòng chảy. Chính vì mật độ các vi sinh
vật trong biofilm cao, nên nó hỗ trợ các quá trình trao đổi chất để từ đó phân hủy
các chất ô nhiễm tốt hơn. Do vậy, để góp phần xử lý các nguồn ô nhiễm phenol,
2
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập, tuyển chọn và nghiên cứu khả
năng phân huỷ phenol của một số chủng vi khuẩn tạo màng sinh học”.
Mục tiêu của đề tài:
Phân lập, tuyển chọn đƣợc các chủng vi khuẩn vừa có khả năng phân huỷ
phenol cao, vừa tạo màng sinh học tốt từ các mẫu nghiên cứu lấy từ kho xăng dầu
Đức Giang- Gia Lâm- Hà Nội. Đánh giá khả năng phân huỷ và tạo màng sinh học
của các chủng vi khuẩn nghiên cứu trên.
Nội dung của đề tài:
1. Phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng phân huỷ phenol.
2. Tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng tạo màng sinh học.
Phenol có một nhóm –OH liên kết với vòng benzene. Đặc biệt hơn, trong
phân tử phenol có hiệu ứng liên hợp mạnh do có oxygen của nhóm –OH cũng ảnh
hƣởng đến tính chất vật lý và tính chất hoá học của phenol [4].
1.1.2. Tính chất vật lý
Phenol là chất rắn, tinh thể không màu, có mùi đặc trƣng, nóng chảy ở 43
o
C,
nhiệt độ sôi 182
o
C, để lâu ngoài không khí, phenol bị oxi hoá một phần, tạo nên hợp
chất có màu hồng và bị chảy rữa do hấp thụ hơi nƣớc. Phenol ít tan trong nƣớc lạnh,
tan trong môt số hợp chất hữu cơ (nhƣ ethanol, este, chloroform), tan vô hạn ở
66
o
C. Phenol rất độc, gây bỏng nặng khi rơi vào da [4].
1.1.3. Tính chất hóa học
Tính acid
4
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Do hiệu ứng cộng hƣởng xảy ra trong phân tử nên phenol có tính acid. Vì
vậy, phenol có thể tác dụng với base mạnh để tạo thành muối và nƣớc.
C
6
H
5
OH + NaOH C
6
H
5
H
5
ONa + H
2
O C
2
H
5
OH + NaOH
C
6
H
5
Na + H
2
O Không phản ứng
Phenol cũng tạo este nhƣ rƣợu, nhƣng nếu rƣợu có thể tác dụng trực tiếp với
acid thì phenol chỉ có thể tác dụng với clorua acid hoặc anhidric acid mới tạo đƣợc
este.
C
6
H
5
OH + CH
3
COCI CH
3
COOC
6
H
3
tạo kết tủa
trắng [4].
Chính vì những đặc tính vật lý và hoá học nhƣ vậy mà phenol đƣợc ứng dụng
nhiều trong các ngành công nghiệp nhƣ:
- Công nghiệp chất dẻo: Điều chế nhựa phenol formaldehyde.
- Công nghiệp tơ hoá học: Tổng hợp ra tơ polyamide.
- Nông dƣợc: Điều chế ra thuốc trừ sâu, thuốc diệt cỏ dại và kích thích tố
thực vật.
- Điều chế một số sản phẩm nhuộm, thuốc nổ (acid picric).
- Dùng trực tiếp làm chất sát trùng, tẩy uế, diệt nấm mốc…
1.2. Tổng quan về tình hình ô nhiễm phenol trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Trên thế giới
Có nhiều nghiên cứu cho thấy sự có mặt của phenol trong các mẫu nƣớc lấy
tại sông hồ với nồng độ cao. Ở cộng hoà Serbia, nồng độ phenol gần Kraljevo là 0,7
µg/l, Raska là 7,2 µg/l. Ở Sông Hoàng Hà Trung Quốc, nồng độ này là 4µg/l. Nồng
độ phenol trong nƣớc bề mặt tại Hà Lan là 2,6-6,5 µg/l. Nƣớc sông ô nhiễm, nƣớc
thải từ các nhà máy chế biến xăng dầu có nồng độ phenol trên 40mg/l. Ở Hoa Kỳ,
trong nƣớc sinh hoạt cũng thấy sự có mặt của phenol trong nƣớc sinh hoạt với nồng
độ 1µg/l [9]. Trong nƣớc tự nhiên, nồng độ phenol trong khoảng 0,01-2 µg/l. Nồng
độ phenol trong không khí thấp hơn, khoảng 1ng/m
3
. Nồng độ phenol ở gần các nhà
máy chế biến gỗ là rất cao, có thể đạt đến giá trị 9,7 đến 10,7 µg/m
3
[7].
1.2.2. Ở Việt Nam
Ở nƣớc ta, nguồn cơ bản phát sinh ô nhiễm phenol chính là chất thải từ các
cơ sở sản xuất có sử dụng phenol nhƣ nguyên liệu hay dung môi của quá trình sản
xuất. Các nhà máy sản xuất dƣợc phẩm có các mặt hàng thuốc giảm đau nhƣ
Bảng 1.1. Bảng giá trị giới hạn cho phép của tổng nồng độ phenol
Đối tƣợng
Hàm lượng phenol tổng số (mg/l)
7
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Nƣớc bề
mặt
Nƣớc sinh hoạt
0,001
Nƣớc dùng cho nông nghiệp
và nuôi trồng thủy sản
0,002
Nƣớc ngầm
0,001
Nƣớc thải
Đổ vào các khu vực dùng
làm nguồn nƣớc cấp cho
sinh hoạt
≤ 1,0
Dùng làm nguồn nƣớc tƣới
tiêu, bơi lội, nuôi trồng thủy
sản
≤ 2,0
Không đƣợc phép đổ ra môi
trƣờng
≥ 5,0
1.3.2. Ảnh hưởng tới sức khỏe con người
Phenol sau khi xâm nhập vào tế bào, trải qua sự biến đổi tích cực, chủ yếu là
sự tham gia của enzyme oxy hoá ở Cytochrome P
độ gây hại 50% quần thể trong điều kiện thực nghiệm quan sát rõ ràng) đối với giáp
xác và cá vào khoảng 3-7 mg/l. Sự tồn tại kéo dài của phenol trong miệng và dƣới
da động vật có thể gây hại đến phổi, gan, thận, tim và đƣờng sinh dục. Liều thấp
nhất có thể gây tử vong bằng đƣờng tiêu hóa là khoảng 4,8 g và trong thời gian
không quá 19 phút. Những triệu chứng do hít lâu hơi phenol trong khoảng 30-60
ppm có thể gây tổn thƣơng phổi, giảm cân, nhức đầu, chóng mặt, tê liệt chân tay và
nặng hơn là tê liệt toàn thân … [8].
Những ảnh hƣởng của phenol lên sức khoẻ của ngƣời và động vật đƣợc thể
hiện ở bảng 1.2.
Bảng 1.2. Ảnh hƣởng của phenol đến sức khoẻ của con ngƣời và động vật
Nồng độ trong nƣớc
(ppm)
Thời gian nguy hiểm
(ngày)
Ảnh hƣởng
Những ảnh hưởng đến con người
5000
1
Tử vong
100
Mức độ rủi ro thấp
Những ảnh hưởng đến động vật
20.000
1
Cơ bắp run, tử vong
24.000
9
Giảm trọng lƣợng cơ thể
thai nhi
Than hoạt tính dạng hạt (GAC) đƣợc sử dụng rộng rãi nhƣ một loại vật liệu
lọc. Có thể sử dụng GAC trong bể lọc riêng biệt, đặt sau bể lọc cát thông thƣờng, để
loại bỏ các chất hữu cơ còn lại trong nƣớc sau bể lọc cát. Thời gian sử dụng của cột
10
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
lọc GAC phụ thuộc vào loại và lƣợng chất ô nhiễm trong nƣớc. Thông thƣờng, để
xử lý các sản phẩm phụ của clo thì 6-12 tháng, để xử lý thuốc trừ sâu, các chất hữu
cơ tổng hợp từ 1-2 năm và để xử lý mùi và vị từ 2-5 năm.
1.4.3. Biện pháp hóa học
* Xử lý bằng các tác nhân oxy hóa mạnh
Sử dụng các tác nhân oxy hóa mạnh nhƣ H
2
O
2
, ozone, chlorine, hệ Fenton để
oxy hóa phenol trong nƣớc thải tạo thành những hợp chất hữu cơ ít ô nhiễm hoặc
chuyển hóa để thành CO
2
và H
2
O. Việc ứng dụng xúc tác quang cũng đã bƣớc đầu
đƣợc nghiên cứu để xử lý phenol, tuy nhiên các nghiên cứu chủ yếu thực hiện trong
phòng thí nghiệm, trên một số dạng của hợp chất xúc tác quang và chƣa đƣợc triển
khai áp dụng trong thực tế.
Các phƣơng pháp kể trên mặc dù có hiệu quả trong việc loại bỏ phenol, tuy
nhiên, không triệt để vì sau khi qua các vật liệu lọc vẫn còn tồn dƣ của phenol và
mất khá nhiều thời gian xử lý.
1.4.4. Biện pháp sinh học
. Phân hủy
điều kiện tối ƣu cho sự phát triển của chúng trên nguồn cơ chất phenol để từ đó kích
thích hoạt động sống của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng phân huỷ phenol
ở vùng ô nhiễm. Để tăng cƣờng quá trình phân huỷ sinh học cần phải bổ sung
nguồn dinh dƣỡng nhƣ carbon, nitor, phosphore theo tỷ lệ nhất định là 100 : 5 : 1.
12
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
Ngoài ra, các yếu tố môi trƣờng nhƣ nhiệt độ, pH … cũng cần phải đƣợc điều chỉnh
thích hợp cho quá trình phân huỷ ở mức độ ổn định và đạt hiệu quả cao nhất [22].
Đôi khi ngƣời ta cũng kết hợp cả hai biện pháp trên để có đƣợc hiệu quả tốt
nhất. Có nghĩa là vừa bổ sung các chủng vi sinh vật sau khi đƣợc làm giàu trên
nguồn cơ chất, đồng thời cũng tạo điều kiện tối ƣu (nhiệt độ, pH, độ ẩm, nguồn dinh
dƣỡng) cho tập đoàn vi sinh vật có khả năng phân hủy phenol hoạt động [22]. Mặt
khác, tùy vào đặc thù môi trƣờng, nồng độ phenol ô nhiễm mà chúng ta phải kết
hợp với các phƣơng pháp vật lý, hóa học để nâng cao quá trình phân hủy sinh học
phenol.
* Vai trò của vi sinh vật trong xử lý nước ô nhiễm phenol
Quá trình chuyển hóa đƣợc thực hiện bởi hoạt động của các enzyme do các
chủng vi sinh vật khác nhau tiết ra. Mỗi loại enzyme chỉ đặc trƣng cho mỗi loại
phản ứng, do đó để xử lý phenol đƣợc triệt để, phải kết hợp nhiều chủng vi sinh vật
khác nhau. Nhiều loài vi khuẩn và nấm men có khả năng khoáng hoá phenol dƣới
điều kiện hiếu khí hoặc kỵ khí [21].
Bảng 1.3. Các vi sinh vật có khả năng phân huỷ sinh học phenol
Vi khuẩn
Nấm
Acinetobacter calcoaceticus
Acinetobacter johnsonii
Acinetobacter sp.
Alcaligens sp.
ứng thông qua con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho (Hình 1.2) [20], [29].
Hình 1.2. Con đƣờng mở vòng ở vị trí ortho bởi
Rhodotorula rubura và Acinetobacter calcoaceticus
14
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu
A: Phenol, B: Catechol, C: 2-hydroxymuconic semialdehyde, D: 2-hydroxymuconate, E: 2-oxo-4-enoadipate,
F: 2-oxo-penta-4-enoate, G: Pyruvate, H: Acetaldehyde, I: Acetyl Co A, E1: Monooxygenase phenol
hydroxylase, E2: Catechol-2,3-dioxygenase, E3: Hydrolase, E4: Dehydrogenase, E5: Isomerase, E6:
Decarboxylase, E7: Hydrotase, E8: Aldose.
Phân hủy kỵ khí phenol
Các vi sinh vật phân hủy kỵ khí phenol trong điều kiện kỵ khí đã đƣợc
nghiên cứu với vi khuẩn khử nitor Thauera aromatic. Sự phân hủy kỵ khí bắt đầu từ
quá trình carboxyl hóa phenol, trải qua các bƣớc: (1) Quá trình phosphoryl hóa
phenol: một nhóm phosphate (từ một phosphoryl nào đó), đƣợc gắn vào phân tử
phenol dƣới xúc tác của phosphate phenyl synthase hay kinase (enzyme phosphoryl
hóa) tạo thành phosphate phenyl. (2) Carboxyl hóa phosphate phenyl dƣới xúc tác
của phenyl phosphate carboxylase hình thành 4-hydroxybenzoate [23], [24].
Các quá trình chuyển hóa hoặc phân hủy của 4-hydroxybenzoate tiếp tục
trong hai bƣớc để tạo benzoyl Co-enzyme A. Phân hủy kỵ khí phenol của chủng
Pseudomonas sp. đƣợc Lack và Fuchs (1994) mô tả trong hình 1.3.
Hình 1.3. Con đƣờng phân hủy sinh học kỵ khí phenol bởi Pseudomonas sp.
A: Phenol, B: Phenyl phosphate, C: 4-hydroxybenzoate, D: 4-hydroxylbenzoyl-CoA, E: Benzoyl-CoA, E1:
Phenyl phosphate sythase, E2: Phenyl phosphate carboxylase, E3: 4-hydroxybenzoate-CoA ligase, E4: 4-
hydroxybenzoyl-CoA.
Benzoyl-Co A dƣới xúc tác của Benzoyl-Co enzyme A tạo thành
cyclohexadience-1-carboxyl-CoA.Quá trình chuyển hóa này đƣợc tiếp tục để tạo
thành 3 phân tử acetyl Co A và một phân tử carbon dioxide [25].
vận chuyển qua màng tế bào và dễ dàng phân hủy sinh học tốt hơn [10].
Các yếu tố môi trƣờng tại nơi mà vi sinh vật đƣợc phân lập ảnh hƣởng rất lớn
đến sự phát triển của chúng. Do vậy, trong quá trình xử lý làm sạch môi trƣờng, vấn
đề này đóng vai trò quan trọng và quyết định hiệu quả của việc xử lý. Quá trình
phân hủy sinh học phenol cũng nhƣ các hợp chất hydrocacbon thơm đa nhân bởi
Copyright: Tài liệu đại học ©