Vào hồi …… giờ, ngày … tháng … năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại thư viện:
1. Thư viện Tạ Quang Bửu - Trường ĐHBK Hà Nội
2. Thư viện Quốc gia

52, số 5, ISSN 0866708X, pp593 - 598. 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
1. Tính cấp thiết của đề tài
Cây đu đủ (Carica papaya Linn) là một loại cây ăn quả được trồng ở
các nước vùng nhiệt đới. Ở Việt Nam, cây đu đủ được trồng hầu hết ở các tỉnh
miền Bắc và miền Nam. Lá đu đủ được chứng minh là có khả năng chống oxy
hóa rất mạnh, có hoạt tính kháng khuẩn tốt. Ngoài ra, lá đu đủ còn có khả
năng kháng viêm, giảm đau. Đã có thông báo dịch chiết nước lá cây đu đủ có
tác dụng ức chế một số dòng tế bào ung thư người như ung thư dạ dày, ung
thư phổi, ung thư máu. Ngoài ra, nước lá cây đu đủ còn có tác dụng điều hòa
miễn dịch. Tuy nhiên, những công bố đều chỉ sơ lược ở dạng dịch chiết và
chưa xác định được thành phần nào là hoạt chất. Vì vậy, việc chứng minh
được thành phần hoạt chất cụ thể của lá đu đủ là một việc làm hết sức cần
thiết, tạo cơ sở khoa học cho việc ứng dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt
Nam làm thuốc điều trị bệnh ung thư. Do đó, tôi đã lựa chọn đề tài: “Nghiên
cứu hoạt tính sinh học của một số hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (Carica
papaya Linn”
2. Mục tiêu của đề tài
- Phân lập và xác định cấu trúc một số hợp chất có hoạt tính sinh học và hợp
chất mới có trong lá đu đủ.
- Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập làm cơ sở khoa học
chứng minh cho việc người dân ở một số nước trên thế giới sử dụng lá đu đủ
chữa trị một số loại bệnh trong đó có bệnh ung thư.
3. Nội dung nghiên cứu

5. Bố cục của luận án
Luận án gồm 113 trang: Đặt vấn đề (3 trang), chương 1: tổng quan (29
trang). Chương 2: vật liệu và phương pháp nghiên cứu (12 trang). Chương 3:
kết quả và thảo luận (56 trang với 6 bảng và 54 hình). Kết luận và kiến nghị
(2 trang). Danh mục các công trình công bố (1 trang). Tài liệu tham khảo (10
trang gồm 20 tài liệu tiếng Việt, 86 tài liệu tiếng Anh). 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Giới thiệu về cây đu đủ
Họ đu đủ (Caricaceae) trên thế giới gồm có 4 chi và 45 loài, phân bố ở
các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Ở nước ta có 1 chi và một loài. Một số
giống đu đủ hiện nay đang được trồng ở Việt Nam bao gồm: giống đu đủ ta,
đu đủ Mêhico, đu đủ So Lo, đu đủ Trung Quốc, đu đủ Thái Lan, đu đủ Đài
Loan. Tại Hà Nội, chỉ có duy nhất giống đu đủ Đài Loan được trồng ở các
huyện: Gia Lâm, Đông Anh, Sóc Sơn, Thạch Thất,…
1.2. Nghiên cứu về thành phần hóa học của lá đu đủ
Trong lá đu đủ có các chất: tannin, alkaloid, saponin, glycosis,
phytosterol, phenol, flavonoid, steroid, terpenoid,…. Alkaloid có khung
piperidin, chủ yếu là carpaine, pseudocarpaine, dehydrocarpaine I,
dehydrocarpaine II, choline, …. Ngoài ra còn có vitamin C, E, nguyên tố
khoáng Ca, K, Mg, Zn, Mn, Fe,
N
C
H
2
C

H
C = O
O
N
C
H
2
C
C H
2
C
C
H C H
3
H
H(C H
2
)
7
O
C = O
N
C
C
C H
2
C H
2
C
H H

50
= 2,8 μg/ml. Chất chiết bằng
nước từ các phần khác nhau của đu đủ có tác dụng ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc
ức chế nhiều loại tế bào ung thư như: dạ dày, phổi, tuyến tụy, gan, máu,
lymphoma, bệnh bạch cầu, Dịch chiết lá đu đủ bằng nước (nồng độ 0,625-20
µg/ml) có tác dụng ức chế nhiều dòng tế bào ung thư khác nhau. Tác giả đã
chứng minh dịch chiết từ lá đu đủ còn có tác dụng hỗ trợ hệ miễn dịch để tấn
công vào các tế bào ung thư. Bằng cách thúc đẩy sự gia tăng các sản phẩm
cytokine dạng Th1 như là IL-12p40, IL-12p70, INF-γ và TNF-α, các cytokine
này có khả năng chống lại khối u. Sau đó tác giả sử dụng màng lọc để tách
thành 2 phần có trọng lượng phân tử khác nhau. Các chất có hoạt tính ức chế
tế bào ung thư và điều hòa miễn dịch được xác định là nằm ở phần có trọng
lượng phân tử nhỏ hơn 1000.
Chất chiết lá đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa. Các giống đu đủ khác
nhau có tổng hàm lượng phenol khác nhau và hoạt tính chống oxy hóa cũng
khác nhau. Điều đó chứng tỏ rằng các chất phenol gây ra hoạt tính chống oxy
hoá. Các bộ phận khác nhau của cây đu đủ có hoạt tính chống oxy hóa giảm
dần theo thứ tự: lá non → quả xanh → quả chín → hạt. Tuy nhiên, các hoạt
chất có tác dụng chống oxy hóa còn chưa được phân lập.
Dịch chiết lá đu đủ có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn và nấm. Cao
lá đu đủ có tác dụng kháng khuẩn đối với Typhimurium mentagrophytes, T.
rubrum và Staphylococcus aureus. Ngoài ra, dịch chiết lá đu đủ còn có khả
năng kháng viêm, kháng virut sốt xuất huyết,…. 5 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Mẫu thực vật

6 - Cuối cùng, sử dụng 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB
đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong
10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader để đọc kết quả về hàm lượng
màu của chất nhuộm SRB qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515 nm.
- Ellipticine luôn được sử dụng như là chất đối chứng dương.
- DMSO10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Chất thử nào có IC50 <
20 g/ml (với chất chiết thô, hoặc với phân đoạn hóa học) hoặc IC50  4
g/ml (với hoạt chất tinh khiết) sẽ được xem là có hoạt tính gây độc tế bào
và có khả năng ức chế sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme caspase 3 / 7: Được thực
hiện dựa trên bộ kit Apo-ONE® Homogeneous Caspase-3/7 Assay (Promega)
theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.2.3. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng loại bỏ gốc tự
do DPPH
Nguyên tắc: 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là gốc tự do được dùng để
sàng lọc tác dụng chống oxy hóa của các chất nghiên cứu. Hoạt tính chống
oxy hóa thể hiện qua việc làm giảm màu DPPH của chất thử, được xác định
bằng phép đo độ hấp thụ ở bước sóng 517 nm trên máy quang phổ.
2.2.2.4. Phương pháp xác định hoạt tính chống oxy hoá in vitro bằng thử
nghiệm malonyl dialdehyd (MDA test)
Xác định khả năng ức chế peroxy hoá lipid thông qua việc xác định
hàm lượng MDA theo phương pháp của Stroev E A, Makarova V G (1989),
Viện Dược liệu - Bộ Y Tế (2006). Khi cho phản ứng với axit thiobarbituric,
một phân tử MDA phản ứng với hai phân tử axit thiobarbituric tạo phức màu
hồng hấp thu cực đại ở bước sóng 532 nm. Phản ứng thực hiện ở môi trường
pH 2 - 3, ở nhiệt độ 90 - 100
0

sử dụng làm đối chứng. Mẫu được ủ trong thời gian 48h ở 37
o
C, 5% CO
2
.
Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO
2
, thêm vào mỗi giếng 50µl MTT
1mg/ml. Sau khi ủ đĩa tế bào ở 37
o
C trong 4h, loại bỏ môi trường và thêm
vào mỗi giếng 100 µl DMSO. Đĩa tế bào được đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ
trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả
về hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 490nm. 8 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân lập cặn chiết phân đoạn CH
2
Cl
2

Từ 101,90 gam cặn chiết CH
2
Cl
2
, tiến hành sắc ký cột silica gel với hệ

10 F10 10,0700
11 F11 20,5137
12 F12 4,2901
13 F13 27,6800
3.2. Phân lập các hợp chất từ một số phân đoạn
Từ phân đoạn F5, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi
CH
2
Cl
2
/MeOH gradient, thu được 6 phân đoạn nhỏ kí hiệu F5.1-F5.6 Phân
đoạn F5.2 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH thu được
chất sạch CP1 (139,6 mg).

9 Từ phân đoạn F8, sau khi tinh chế bằng cột silica gel với hệ dung môi
Hx/EtOAc gradient thu được 5 phân đoạn nhỏ kí hiệu F8.1-F8.5 Phân đoạn
F8.3 được tinh chế bằng cột sephadex với dung môi MeOH và cột silica gel
hệ dung môi Hx/EtOAc xuất hiện tinh thể. Lọc rửa bằng Hx/CH
2
Cl
2
thu được
chất sạch CP2 (6,7 mg).
Từ phân đoạn F9.I, sau khi chạy cột silica gel với hệ dung môi
CH
2
Cl

Hx/CH
2
Cl
2
thu được chất sạch CP5 (210,1 mg). Dịch cái tiếp tục được tinh
chế bằng sắc kí cột silica gel với hệ dung môi CH
2
Cl
2
/EtOAc/NH
4
OH và sắc
ký cột sephadex với dung môi MeOH thu được chất sạch CP6 (18,7 mg).
3.3. Xác định cấu trúc của các hợp chất đã được phân lập
3.3.1. Hợp chất CP1
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 145 – 146
0
C
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 3,58 (1H, t, J = 4,5 Hz, OH), 3,94 (6H,
s, 2 x OCH
3
), 4,83 (2H, d, J = 4,5 Hz, CH
2
-2), 6,21 (1H, s, OH), 7,18 (1H, s,
H-2’ + H-6’).
13
C-NMR (125 MHz, CDCl

5'
6'

Hình 3.1: Cấu trúc hóa học của hợp chất danielone (hình 3.3 của luận văn)
3.3.2. Hợp chất CP2
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 135 - 137
0
C. ESI-MS: m/z 274
[M+Na]
+
. HR-ESI-MS (+) m/z: 274,1411.
1
H-NMR (500 MHz, CD
3
OD): δ (ppm): 1,37 (6H, m, CH
2
-4’+ CH
2
-5’+ CH
2
-
6’); 1,06 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH
2
-7’); 1,69 (2H, quint, J= 7,5 Hz, CH
2
-3’);
2,28 (2H, t, J= 7,5 Hz, CH
2
-8’); 2,30 (3H, s, CH
3

Hình 3.5: Phổ COSY của hợp chất CP2 (hình 3.9 của luận văn) Hình 3.6: Phổ HMBC của hợp chất CP2 (hình 3.10 của luận văn)

12
Hình 3.7: Phổ HSQC của hợp chất CP2 (hình 3.11 của luận văn)
Phân tích dữ liệu phổ
1
H-NMR,
13
C-NMR, COSY, HSQC, HMBC
chúng tôi xác định được chất CP2 là axit 9
’
-(3-methyl-pyrrol-2-yl)-9
’
-
oxononanoic. Đây là một hợp chất mới được đặt tên là carpainone. Trên
thế giới và ở Việt Nam chưa có công bố về hợp chất này trong lá đu đủ cũng
như ở các loại thực vật khác.
N
H
COOH
O
1'
2'
3'

C OO H
OCH
3
OH
1
2
4
5
6
313 Hình 3.9: Cấu trúc hóa học của hợp chất axit pluchoic (hình 3.15 của luận
văn)
3.3.4. Hợp chất CP4
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 100 - 104
0
C
[α]
25
D
+288 (c=0,25 g/100ml trong MeOH)
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 0,97 (3H, s, CH
3

OH
O
OH
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

Hình 3.10: Cấu trúc hóa học của hợp chất Apocynol A (hình 3.19 của luận
văn)
3.3.5. Hợp chất CP5
Chất rắn màu trắng, nhiệt độ nóng chảy 118 – 120
0
C.
ESI-MS: m/z 479 [M+H]
+
, 240 [M/2+H]
+
1
H-NMR (500 MHz, CDCl
3
): δ (ppm) 1,05 (3H, d, J = 7,0 Hz, CH
3
-2), 1,19

H
H
( C H
2
)
7
C
O
O
N
H
H
3
C (C H
2
)
7
C H
3
H
O
C = O
2
3
4
5
6
2 '
3 '
4 '

2
),
24,9 (CH
2
), 25,1 (CH
2
), 25,4 (CH
2
), 26,7 (CH
2
), 27,8 (CH
2
), 28,0 (CH
2
), 28,1
(CH
2
), 28,4 (CH
2
), 28,5 (CH
2
), 28,8 (CH
2
), 29,1 (CH
2
), 29,5 (CH
2
), 30,6
(CH
2

7
C
O
O
N
H
H
3
C ( C H
2
)
7
H
H
O
C = O
2
3
4
5
6
2 '
3 '
4 '
5 '
6 '

Hình 3.12: Cấu trúc hóa học của hợp chất pseudocarpaine (hình 3.28 của
luận văn)
Kết luận: Từ cặn chiết CH


16 3.5. Đánh giá tác dụng gây độc tế bào ung thư biểu mô KB của các phân
đoạn phân lập từ cặn chiết CH
2
Cl
2
từ lá đu đủ
Sau khi phân lập cặn CH
2
Cl
2
bằng sắc ký cột silica gel thu được 13
phân đoạn F1- F13. Các phân đoạn F1- F13 được đem thử hoạt tính gây độc
tế bào ung thư biểu mô KB, kết quả như sau:

Hình 3.14: Kết quả gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư biểu mô KB của
các phân đoạn cặn chiết CH
2
Cl
2
từ lá đu đủ (Hình 3.33 của luận văn)
Kết quả trên cho thấy: Các phân đoạn F8, F9, F10, F11 có thể hiện hoạt
tính gây độc tế bào ung thư biểu mô KB với IC
50
từ 15,41 đến 6,86 g/ml.
Đặc biệt 2 phân đoạn F10, F11 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ung thư biểu
mô KB rất mạnh (IC

từ 1,13 đến
3,49 µg/ml.
3.7. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của một số hợp chất
lên tế bào ung thư phổi LU-1
Xác định khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của 2 hợp chất
(carpaine và pseudocarpaine) tách chiết được từ lá đu đủ trên dòng tế bào ung
thư phổi LU-1. Kết quả cụ thể như sau:
3.7.1. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất
carpaine lên tế bào ung thư phổi LU-1
Hợp chất carpaine tách chiết được từ lá đu đủ được đánh giá khả năng
kích hoạt enzyme caspase 3/7 trên dòng tế bào ung thư phổi LU-1. Hình 3.16: Kết quả kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất carpaine lên
tế bào ung thư phổi LU-1(hình 3.50 của luận văn)

18
Hợp chất carpaine thể hiện khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 ở
nồng độ thử cao nhất (20 µg/ml) là 386,5 RFU. Chất đối chứng dương
tamoxifen hoạt động ổn định trong thí nghiệm với hoạt tính caspase ở nồng
độ 20 µg/ml là 3100 RFU.
Thông qua thí nghiệm xác định độ độc của hoạt chất lên dòng tế bào
nuôi cấy bằng phương pháp nhuộm SRB, kết quả tỉ lệ tế bào sống sót so với
đối chứng của hoạt chất ở nồng độ thử nghiệm nằm trong khoảng 84,67 đến
90,44% cho thấy hợp chất carpaine không gây chết tế bào trên diện rộng
nhưng cũng đã có tác động nhất định lên tế bào.
3.7.2. Đánh giá khả năng kích hoạt enzyme caspase 3/7 của hợp chất

50
> 128 µg/ml, lớn
hơn nồng độ cao nhất của phép thử. Chất tham khảo là resveratrol có EC
50
là
8,3 µg/ml. Kết quả này chứng tỏ, cả 6 hợp chất tách chiết được từ lá đu đủ
chưa thể hiện hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ thử nghiệm.
3.8.2. Kết quả chống oxy hóa in vitro bằng thử nghiệm MDA của các hợp
chất phân lập từ lá đu đủ
Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá
đu đủ bằng phương pháp thử nghiệm MDA.

20
Hình 3.19: Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa bằng phép thử MDA của các
hợp chất chiết tách từ lá đu đủ (hình 3.53 của luận văn)
Bằng thử nghiệm MDA để kiểm tra khả năng chống oxy hóa in vitro
của các hợp chất: danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A, carpaine,
pseudocarpaine chúng tôi nhận thấy chỉ có duy nhất hợp chất pseudocarpaine
ở nồng độ thử nghiệm cao nhất 100 µg/ml cũng chỉ có hoạt tính chống oxi
hoá khoảng 33,59%, cho thấy có hoạt tính yếu. Các hợp chất còn lại bao gồm:
danilone, carpainone, axit pluchoic, apocynol A và carpaine đều không thể
hiện hoạt tính chống oxi hóa trên thử nghiệm MDA ở các nồng độ nghiên
cứu.
3.8.3. Kết quả chống oxy hóa in vitro trên tế bào gan chuột của các hợp
chất phân lập từ lá đu đủ
Xác định khả năng chống oxy hóa của 6 hợp chất tách chiết được từ lá
đu đủ trên tế bào gan chuột.


>128 >128
Apocynol A >128 >128 >128 >128 >128

>128 >128
Carpaine >128 >128 >128 >128 >128

>128 >128
Pseudocarpaine 80 >128 >128 >128 >128

>128 >128
Ampicilin 1,0 1,05 1,02 - 1,2 - -
Stretomycin - - - 1,25 - 12 -
Amphotericin B - - - - - - 0,8
Kí hiệu:
1: Staphylococcus aureus, 2: Bacillus subtilis, 3: Lactobacillus
fermentum, 4: Salmonella enterica, 5: Escherichia coli, 6: Pseudomonas
aeruginosa, 7: Candida albican,(-): không thử
Qua số liệu ở bảng 3.2 thấy rằng, có 5 trong tổng số 6 hợp chất thử
nghiệm đều không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn gram dương, gram
âm và nấm ở nồng độ chất thử cao nhất là 128 µg/ml.

22 Riêng hợp chất pseudocarpaine chỉ thể hiện hoạt tính kháng vi khuẩn
gram dương Staphylococcus aureus rất yếu với IC
50
là 80 µg/ml. Còn đối với
các chủng vi khuẩn và nấm còn lại đều có IC

(0,5
µg/ml)
1,04
(0,25
µg/ml)
1,01
(0,125
µg/ml)

Kết quả trên cho thấy các hoạt chất nghiên cứu không thể hiện hoạt tính
kích thích tế bào lympho. Concavalin A có cho thấy khả năng kích thích tế
bào lympho tăng sinh. Do vậy, chúng tôi không xác định được giá trị SD
50

của tất cả các mẫu nghiên cứu.