BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHỆP HÀ NỘI
PHẠM THỊ TRANG
NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN VÀO ðẬU COVE
(PHASEOLUS VULGARIS. L) THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI, NĂM 2013


HÀ NỘI, NĂM 2013

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

Tác giả Phạm Thị Trang
Tác giả luận văn Phạm Thị Trang

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các bảng vi

Danh mục hình vii

Danh mục biểu đồ viii

Danh mục chữ viết tắt ix

TÓM TẮT 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4


1.7 Các nghiên cứu sử dụng RNAi cho các mục tiêu khác 25

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

2.1 Địa điểm, thời gian, vật liệu nghiên cứu 27

2.1.1 Địa điểm nghiên cứu 27

2.1.2 Thời gian nghiên cứu 27

2.1.3 Vật liệu nghiên cứu 27Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v

2.2 Nội dung nghiên cứu 29

2.2.1 Nghiên cứu nuôi cấy tái sinh in vitro các giống đậu cove 29

2.2.2 Nghiên cứu xác định ảnh hưởng của một số thông số của quy trình
chuyển gen đậu cove 30

2.2.3 Nghiên cứu chuyển cấu trúc vector mang gen amiRNA V-ATPase
vào giống đậu cove GS012 30

2.3 Phương pháp nghiên cứu 30

2.3.1 Phương pháp nuôi cấy mô 30

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 53

1 Kết luận 53

2 Đề nghị 53

TÀI LIỆU THAM KHẢO 54

PHỤ LỤC 58Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

STT Tên bảng Trang

1.1 Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các
gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes) 15

3.1 Ảnh hưởng của việc bóc vỏ hạt đến sự nảy mầm của các giống đậu cove 37

3.2 Ảnh hưởng công thức nhân nhanh tới khả năng tái sinh của đậu cove
sau 3 tuần nuôi cấy 40

3.3 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh kanamycin đến sức sống của mẫu
cấy (sau 3 tuần) 42

3.4 Khả năng biểu hiện gen gus của các giống đậu cove khác nhau 44

3.1 Mẫu hạt đậu cove sử dụng cho nuôi cấy in vitro ( C1: không bóc vỏ,
C2: bóc vỏ). 37

3.2 Sự nảy mầm của các giống đậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi
trường MSB5 39

3.3 Khả năng tái sinh giống GS012 trên các môi trường khác nhau 40

3.4 Ảnh hưởng của nồng độ kháng sinh Kanamycin đến sức sống của
mẫu cấy (sau 3 tuần) 43

3.5 Khả năng biểu hiện gen gus của GS012 (A) và AYOKA (B) 45

3.6 Mẫu sử dụng chuyển gen 49

3.7 Chọn lọc cây chuyển gen theo các phương pháp khác nhau trên 51
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii

DANH MỤC BIỂU ðỒ STT Tên biểu ñồ Trang

3.1 Sự nảy mầm của các giống đậu cove sau 3 ngày nuôi cấy trên môi
trường MSB5. 38


Srna Small RNA - RNA nhỏ
Strep Streptomycin
GA
3
Gibberellic acid
TDZ N-phenyl-N’-1, 2,3-thiadiazol-5-urea [thidiazuron]
BAP 6 -Benzylaminopurine
IAA Indole-3- acetic acid
α – NAA α-Naphthalene acetic acid
IBA Indole-3-butyric-acid
AS Adenine sulphate
2,4D 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid
IPM Integrated Pests Management - Quản lý dịch hại tổng hợp

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
1

TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện nhằm nghiên cứu chuyển gen vào đậu cove Phaseolus
vulgaris. L thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Các chủng Agrobacterium
tumefaciens (A. tumefaciens) được sử dụng là LB 303 mang plasmid pBin 19 chứa gen gus
và chủng LBA 4404 mang plasmid pPSI chứa cấu trúc amiRNA (có trình tự 5’-
TCAAACTCTTTGAATTGCCTT-3’) có tiềm năng làm câm gen mã hóa V-ATPase ở 5
loài sâu hại, để tạo cây đậu chuyển gen kháng côn trùng.
Đối tượng nghiên cứu là các giống đậu GS012, AYOKA, BEA01,
CONTENDER. Sau một số thí nghiệm, chúng tôi đã thu được kết quả như sau: Khử
trùng hạt ngâm qua đêm rồi tách vỏ hạt sau đó mới cấy vào môi trường nảy mầm
hạt giúp rút ngắn thời gan này mầm hạt và tăng chất lượng mẫu sử dụng cho chuyển
gen. Khả năng tiếp nạp gen của đậu cove khá khó khăn, sự biểu hiện gus ở đậu cove

triển (FAO:http//faostat.fao.org). Mặc dù có giá trị dinh dưỡng quan trọng, nhưng
năng suất đậu cove ở một số vùng trên thế giới còn thấp chưa tương xứng với năng
suất tiềm năng. Năng suất đậu trung bình ở các nước Tây Á và Bắc Mĩ khoảng
1100-1500kg/ha, Châu Mĩ Latin và Châu Phi khoảng 500-600 kg/ha, trong khi tiềm
năng sản lượng có thể đạt 4000kg/ha (Aragao và Rech, 2001). Một trong những
nguyên nhân làm suy giảm nghiêm trọng năng suất của đậu rau chính là sâu hại.
Đậu rau dễ bị tấn công bởi 200-450 loài sâu hại trong đó các loài sâu gây hại chính
thuộc họ Lepidotera gây giảm năng suất từ 35-100% (Singh và Schartz, 2010).
Bên cạnh các phương pháp phòng chống sâu hại truyền thống như sử dụng
thuốc hóa học, biện pháp canh tác, biện pháp thủ công, IPM… thì việc sử dụng cây
trồng biến đổi gen là biện pháp rất được quan tâm chú ý, đặc biệt việc áp dụng công
nghệ RNAi trong việc ức chế sự sinh trưởng và phát triển của côn trùng khi gây hại
trên cây (Baum và cộng sự, 2007; Mao.Y.B, 2007). Các RNAi chỉ tham gia ức chế
quá trình sau phiên mã (ức chế dịch mã hoặc phân hủy mRNA), không sản sinh các
protein lạ trong cây vốn là vấn đề đang gây tranh cãi về an toàn sinh học của cây trồng
biến đổi gen.
Tuy nhiên, kĩ thuật chuyển gen cho đậu cove vẫn gặp những khó khăn nhất
định. Giống như các giống đậu khác, khó khăn chính trong quy trình chuyển gen sử
dụng vi khuẩn Agrobacterium là tỉ lệ tái sinh thấp trong nuôi cấy mô (Svetlev và
cộng sự, 2003; Zambre và cộng sự, 2005; Colpaert và cộng sự, 2008; Arellano và
cộng sự, 2009). Điều này được giải thích là do chúng không có khả năng hồi phục
vết thương kịp thời và sự phát sinh callus thứ cấp quá mức tại vị trí cắt (Kwapata
và cộng sự, 2010). Hơn thế nữa, khả năng ra rễ của chồi tái sinh in vitro cũng là một thách

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
3

thức do chồi của đậu cove sản sinh một lượng lớn callus làm ngăn cản sự hình thành rễ và hợp
chất phenol tạo ra có thể là nguyên nhân khiến mô chết do quá trình oxi hóa (Arnaldos và
cộng sự, 2001). Trên cơ sở đó chúng tôi đề xuất thực hiện đề tài “Nghiên cứu

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Giới thiệu chung về cây ñậu cove
Đậu cove (Phaseolus vulgaris L.) có nguồn gốc từ Trung Mỹ và được trồng
cách nay hơn 600 năm, là cây hàng năm quan trọng thuộc chi Phaseolus, họ Fabaceae.

Chi Phaseolus gồm 5 loài P. vulgaris, P.acutifolius, P. coccineus, P. lunatus và P.
polyanthus. Trong đó, P. vulgaris là loài đậu quan trọng thứ 2 sau đậu tương G. max
(Dillen và cộng sự, 1997). Trái đậu non chứa khoảng 2,5% đạm, 0,2% chất béo, 7%
chất đường bột và đặc biệt nhiều vitamin A, vitamin C và chất khoáng, trái có thể dùng
ăn tươi, đóng hộp và đông lạnh. Ở các nước Châu Á như: Ấn Độ, Miến Điện, Nepal,
Sri-Lanka, Bangladesh hạt đậu cove khô được sử dụng trong các bữa ăn kiêng. Đậu
cove là một trong những loại hoa màu thích hợp trong hệ thống luân canh với lúa và có
khả năng là nguồn thu nhập khá cao cho các nông hộ. (Trần Thị Ba, 2005).
P. vulgaris là một loài lưỡng bội với 11 cặp nhiễm sắc thể và kích thước bộ
gen trung bình dao động trong khoảng 558 đến 637 Mbp (Bennett và Leitch, 2005)
Phụ thuộc vào từng giống khác nhau mà vỏ đậu có màu sắc khác nhau như xanh,
đen, vàng hoặc tím. Mỗi quả đậu thường chứa từ hai tới bốn hạt và hình dáng cũng
thay đổi từ dạng hình trụ tròn tới dạng dẹt.
1.2. Các nghiên cứu về hệ thống nuôi cấy mô cây ñậu cove
Xây dựng hệ thống tái sinh đậu cove hoàn chỉnh là điều kiện tiên quyết cho
phát triển quy trình chuyển gen vào cây (Elsa Espinosa-Huerta, 2012). Tuy nhiên, quy
trình tái sinh in vitro đậu cove được đánh giá là khó khăn trong thực tế (Chandra and
Pental, 2003; Veltcheva và cộng sự, 2005). Hiệu quả tái sinh của đậu cove rất thấp và
khả năng tái sinh tùy thuộc vào từng giống, từng loại mẫu cấy … Các mẫu đậu cove
thường sử dụng cho chuyển gen bởi Agrobacterium gồm đốt lá mầm (McClean và
cộng sự, 1991), tế bào trần (Leon và cộng sự, 1991), phôi hạt trưởng thành (Aragao và
cộng sự, 1992), đĩa lá và trụ dưới lá mầm (Franklin và cộng sự, 1993), meristem
(Russell và cộng sự, 1993; Brasileiro và cộng sự, 1996), đỉnh chồi từ hạt nảy mầm
(Lewis và Bliss, 1994), trục phôi (Kim và Minamikawa, 1995)… Hầu hết các quy

công cây từ chồi bất định của phôi mầm trong môi trường bổ sung 5,0µM BAP.
Kwapata và cộng sự (2010) giành được những kết quả nhất định với việc tái sinh
thành công đa chồi từ trục phôi trên môi trường MS bổ sung 11,1µM BAP và
0,57µM Indole-3-acetic acid (IAA). Ngược lại, Benedicic và cộng sự (1997) chỉ ra

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6

rằng 6-y, y- Dimethylallylamino purine (2iP) có kết quả tốt hơn BAP trong việc
cảm ứng chồi từ đỉnh sinh trưởng.
Để tìm ra những môi trường tối ưu cho việc tái sinh đỉnh sinh trưởng,
Quintero và cộng sự (2010) tiến hành nuôi cấy trục phôi từ hạt thành thục trên môi
trường MS (Murashige và Skoog, 1992) hoặc môi trường B5 (Gamborg và cộng sự,
1968) chứa 10mg/l BA có bổ sung hoặc ko bổ sung adenine hemisulphate (20mg/l).
Kết quả là có sự khác biệt đáng kể trong hiệu quả tái sinh giữa hai môi trường: môi
trường B5 kích thích tạo chồi 98 -100% và tái sinh thành cây hoàn chỉnh 93% còn
ngược lại kết quả cho thấy chỉ có 15-73% mẫu nuôi cấy và 29% chồi in vitro được
tái sinh trên môi trường MS.
Bên cạnh mẫu cấy là mô phôi, thì các mẫu không phải mô phôi cũng được
sử dụng. Hầu hết thí nghiệm được tiến hành với việc nuôi cấy lá mầm và đốt lá
mầm từ hạt nảy mầm in vitro (Zambre và cộng sự, 1998; Ahmed và cộng sự,
2002; Veltcheva và cộng sự, 2005).
McClean và Grafton (1989) tiến hành tái sinh đậu cove từ đốt lá mầm của
cây nảy mầm trên môi trường MS bổ sung 5,0µM BAP. Những nghiên cứu trước đó
chỉ ra rằng chồi phát sinh từ tế bào nhu mô biểu bì dưới của đốt lá. Malik và cộng
sự (1991) tiến hành tái sinh thành công cây từ lá non chứa một phần mỏng cuống lá
của P. vulgaris L. Mohamed và cộng sự (1992) thực hiện quá trình tái sinh chồi
bằng việc nuôi cấy đốt lá mầm trên nền môi trường có bổ sung N-2-chloro-4-
pyridyl- N’- phenylurea (CPPU) hoặc thidiazuron (TDZ) có nồng độ 0,25µM hoặc
1µM. Ahmed và cộng sự (2000) phát triển quy trình tái sinh từ cây con và mô đốt lá

thể phát triển tiếp được (Martin và Sondahl, 1984). Những kết quả tương tự thu
được bởi Saunders và cộng sự (1987). Họ tìm ra 45,2µM hoặc 135,7µM 2,4-D
kích thích sự phát triển của cấu trúc hình cầu nhưng những cấu trúc này không
phát triển được thành phôi soma khi chúng được chuyển sang môi trường MS bổ
sung hoặc không bổ sung 2,4-D. Cũng cho kết quả tương tự, Hoyos (1990) không
thấy được sự khác biệt về số lượng và chất lượng của phôi soma tái sinh trong môi
trường bổ sung 45,2 - 135,7µM 2,4-D và sau đó chuyển sang hoặc môi trường
tương tự hoặc tới môi trường bổ sung IBA. Tác giả đồng thời cũng chỉ ra sự không
khác biệt của callus phát sinh phôi dưới điều kiện ánh sáng hoặc trong tối.
Gần đây, những cố gắng để tái sinh cây thông qua phát sinh phôi soma tập

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8

trung vào giai đoạn tiền nuôi cấy cho cây khởi đầu trong môi trường giàu cytokinin.
Quá trình tái sinh cây giành được sau giai đoạn tiền nuôi cấy của cây cho trên nền
môi trường được bổ sung với CPPU (Mohamed và cộng sự, 1992b). Đây có thể là
một trong những phương pháp để thay đổi thể trạng sinh lý của mô và khởi động
quá trình tái sinh phôi sinh dưỡng.
Kwapata và cộng sự (2010) tiến hành tái sinh phôi sinh dưỡng của mười
giống đậu cove từ trục phôi nhưng sự hình thành cây từ phôi soma là tương đối khó
khăn với hiệu quả tái sinh thấp và thời gian tái sinh kéo dài khi so sánh với việc tái
sinh chồi từ chồi bất định.
Mohamed và cộng sự (1992b) sử dụng đốt lá mầm và mầm sơ cấp tách ra từ
cây đậu cove con 14 ngày tuổi để thử nghiệm tái sinh chồi và kết quả cho thấy số
lượng chồi phát sinh là cao nhất từ mẫu tách ra từ cây con nảy mầm trong điều kiện
tối. Những đáp ứng này tối ưu trên môi trường chứa 5µM BAP trong suốt thời kì
phát triển của cây con và giai đoạn nuôi cấy sau đó. Số lượng chồi/mẫu nuôi cấy
trên môi trường chứa 0,25-1,0µM CPPU hoặc TDZ cao hơn từ 2 tới 5 lần so với
môi trường bổ sung 5µM BAP.

được ra rễ trong môi trường MSB5 bổ sung 1mg/l GA
3
+ 1mg/l IBA.
1.2.2. Tái sinh in vitro thông qua phát sinh callus
Dillen và cộng sự (2000) cho rằng tái sinh gián tiếp thông qua cảm ứng hình
thành callus phù hợp cho chuyển gen đậu cove bằng vi khuẩn Agrobacterium hơn
tái sinh trực tiếp chồi từ meristem. Tuy nhiên cho tới nay, chỉ có bốn báo cáo được
công bố về việc tái sinh chồi P. vulgaris từ callus. Phát sinh hình thái chồi từ callus
với đối tượng đậu cove được báo cáo lần đầu tiên bởi Mohamed và cộng sự (1993).
Trong nghiên cứu này, callus được cảm ứng từ cuống nhỏ trên môi trường B5 hoặc
MS bổ sung với 2,3 hoặc 4,5µM TDZ riêng biệt hoặc kết hợp với những nồng độ
khác nhau của IAA. Những biểu hiện sớm của quá trình tái sinh chồi hình thành
trên môi trường B5 chứa 4,4µM BA. Sự biểu hiện ổn định của sự phát triển chiều
cao và sự trưởng thành sớm được xác định thông qua dòng R2 từ cây tái sinh. Tuy
nhiên, quy trình này chỉ thành công với hai giống Tara và Xan-159. Zambre và cộng
sự (1998) cũng đã công bố quy trình tái sinh in vitro từ callus cảm ứng từ lá mầm
của giống Xan-159 trong đó 39% mẫu sản sinh ra mô phân sinh màu xanh thu được
trên môi trường MSB5 bổ sung 0,45µM TDZ và 0,29µM IAA nhưng số lượng của
chồi tái sinh không được đưa ra. Arellano và cộng sự (2009) đã phát triển một quy
trình tái sinh in vitro cho giống P. vulgaris Negro Jamapa trong đó sử dụng đường
hướng phát sinh cơ quan gián tiếp. Trong thí nghiệm này, mô phân sinh đỉnh chồi
và đốt lá mầm được sử dụng cho cảm ứng callus trên môi trường chứa 1,5µM 2,4-D
và môi trường chứa 22,2µM BAP được sử dụng cho tái sinh chồi.
Mahamune và cộng sự (2011) xây dựng quy trình tái sinh phù hợp cho đậu
cove từ những mẫu nuôi cấy mô khác nhau như nách lá, chồi, đốt, lóng và rễ thông
qua cảm ứng callus trên môi trường chứa 6,7µM BAP và 2,9µM IAA. Tuy nhiên,
sự hình thành chồi từ callus không được báo cáo.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10


Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
11

Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens đã được kiểm tra
đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen chuyển đặc
biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp là loại mô được
biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi khuẩn A. tumefaciens sử
dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp, marker được sử dụng để chọn
lọc thể biến nạp, loại vector sử dụng và kiểu gen của thực vật.
1.3.2. Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid
Trong thế giới động-thực vật đều tồn tại các thể plasmid. Đó là các vòng
DNA tự do sinh sản độc lập. Ở vi khuẩn và động-thực vật, plasmid liên quan tới yếu
tố giới tính của tế bào, đến khả năng chống chịu các loại kháng sinh,… Đặc điểm
quan trọng của plasmid là chúng có thể liên kết vào nhiễm sắc thể nhưng cũng có
thể tồn tại bên ngoài nhiễm sắc thể một cách độc lập.

Hình 1.1. Ti-Plasmid ()
Ti-plasmid được tìm thấy trong tất cả các dòng A. tumefaciens gây độc, có
kích thước khoảng 200-250 kb. Chúng được duy trì ổn định trong Agrobacterium ở
nhiệt độ dưới 30
o
C. Bằng phương pháp lai ADN-ADN và lập bản đồ chuỗi kép di
hợp (heteroduplex mapping), người ta đã xác định được Ti-plasmid có 4 vùng tương
đồng. Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-ADN (transferred DNA) và vùng

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12

gây độc (virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên

là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các
đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
13

1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
như: hydroxy-acetosiryngone Dưới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens
nhận biết rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá
trình này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và RB, LB. Cũng chính các hợp chất
này, với vai trò cảm ứng, giúp cho các gen vùng vir hoạt động và tăng cường biểu hiện.
Khi Agrobacterium tiếp xúc với các tế bào thực vật bị tổn thương, hoặc
acetosyringone tinh khiết đã làm cho vùng vir của Ti-plasmid phiên mã, sản phẩm
của gen virA (có thể liên kết với màng) sẽ nhận diện và tương tác với acetosyringone
và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế bào này làm hoạt hóa sản phẩm của gen
virC. Sau đó protein virC đã biến đổi hoạt hóa làm cho các gen vir B, C, D và E
không hoạt động và làm tăng cường sự phiên mã của gen vir C.
Sự cảm ứng gen vir xảy ra nhờ sự xuất hiện các điểm đứt sợi đơn trong các
trình tự biên 25bp nằm ở mép của T-ADN và sự xuất hiện phân tử sợi đơn mạch
thẳng tương ứng với T-ADN. Các sản phẩm của operon vir D có hoạt tính
endonuclease. Bằng một cơ chế tương tự sự tiếp hợp của vi khuẩn, T-ADN được
chuyển sang tế bào thực vật và xen một cách ổn định vào ADN nhân.
1.3.5. Các vector biến nạp thực vật không gây ung thư dựa trên Ti-plasmid
Nhiều vector biến nạp dựa trên Ti-plasmid đã được phát triển. Các vector này
không chứa bất kỳ trình tự ung thư nào và vì vậy tế bào thực vật có thể sinh trưởng
bình thường sau khi chuyển ADN vào nhân của nó. Các vector không gây ung thư
hiện đang sử dụng có thể được chia làm hai loại là cis và trans, dựa vào việc có hay
không các vùng T-ADN nằm ở mép các trình tự lặp lại trực tiếp 25 bp trên cùng đơn
vị tái bản (replicon) như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán. Trước đây,

(neomycin phosphotransferase), gen lux (luciferase), gen cat (chloramphenicol
acetyltransferase), gen nos (nopaline synthase).
Gen npt II: Gen nptII là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme neomycin
phosphotransferase (npt II), là một enzyme vi sinh vật có trọng lượng phân tử
khoảng 25kD, xúc tác cho phản ứng phosphoryl hóa một số kháng sinh gốc
aminoglycoside như neomycin, kanamycin và G148. Trong phản ứng này, nhóm γ
phosphate của ATP được gắn vào phân tử chất kháng sinh làm nó trở nên bất hoạt
do ngăn trở sự liên kết của kháng sinh với ribosome.

Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
15

Bảng 1.1. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes)
và các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes)
A. Một số gen chỉ thị chọn lọc
Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng ñể chọn lọc
npt II Neomycin phosphotransferase Kanamycin
hyg Hygromycin phosphotransferase Hygromycin
gent Gentamycin acetyltransferase Gentamycin
aat Streptomycin phosphotransferase Streptomycin
bleo Enzyme kháng bleomycin Bleomycin
bar Phosphinothricin acetyltransferase Phosphinothricin
bxn Bromoxynil nitrilase Bromoxynil
B. Một số gen chỉ thị sàng lọc
Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng ñể phát hiện
gus A β-glucuronidase X-gluc
lacZ β-galactosidase X-Gal
luc Luciferase đom đóm Lumis Phos
lux Luciferase khuẩn Lumi Phos
cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu