ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Đỗ Thị Như Quỳnh
NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG TIẾP NHẬN GEN GmGLP1 VÀO CÂY
ĐẬU TƯƠNG (Glycine max) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – 2015
ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
Đỗ Thị Như Quỳnh
thân thương nhất - những người đã luôn sát cánh, quan tâm và dành cho tôi tình
cảm chân thành trong suốt thời gian tôi học tập và hoàn thành luận văn này cũng
như đã luôn luôn bên cạnh và ủng hộ tôi trong cuộc sống.
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày tháng năm 2015
Học viên cao học Đỗ Thị Như Quỳnh
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. Đậu tương và tầm quan trọng của cây đậu tương 3
1.1.1. Giới thiệu chung về đặc điểm sinh học của cây đậu tương 3
1.1.2. Vai trò của cây đậu tương đối với đời sống của con người 6
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới và Việt Nam 7
1.2. Cơ chế chống chịu các yếu tố phi sinh học của thực vật 10
1.3. Đặc tính chịu hạn và một số gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu
tương 12
1.3.1. Đặc tính chịu hạn ở cây đậu tương 12
1.3.2. Các gen liên quan đến khả năng chịu hạn ở cây đậu tương 13
1.4. Gen GmGLP1 14
1.5. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 15
1.5.1. Chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 15
1.5.2. Chuyển gen trực tiếp bằng súng bắn gen 18
TÀI LIỆU THAM KHẢO 50
PHỤ LỤC 60
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên Thế giới trong những năm gần đây . 7
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên Thế giới 8
trong những năm gần đây 8
Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây 9
Bảng 4. Trình tự cặp mồi sử dụng trong thí nghiệm 24
Bảng5. Thành phần phản ứng PCR 28
Bảng 6. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR 28
Bảng 7. Thành phần phản ứng cắt giới hạn bằng enzyme Bam HI 30
Bảng8. Kết quả khảo sát tỷ lệ này mầm của 4 giống đậu tương 33
ĐT22, ĐT26, ĐVN9, DT84 33
Bảng 9. Khả năng phát sinh chồi của 4 giống đậu tương nghiên cứu sau 14 ngày
34
Bảng 10. Khả năng sống sót sau chọn lọc và khả năng kéo dài chồi của 4 giống
đậu tương ĐT22, ĐVN9, ĐT26 và DT84 35
Bảng 11. Sự phát sinh rễ tái sinh cây hoàn chỉnh 36
Bảng 12. Cây tái sinh hoàn chỉnh sống sót và phát triển ở môi trường ngoài 36
Bảng 13. Tỷ lệ cây sống sót sau khi phun basta 38
Bảng 14. Thống kê số cây T
0
sinh trưởng và phát triển tốt sau khi phun basta và
đã dương tính với PCR 41
Bảng 15. Phân tích cây T
1
chuyển gen dựa vào tỷ lệ phân ly 3:1 và 15:1 43
Bảng 16. Kết quả phân tích cây chuyển gen T
Hình 7. Phân tích PCR gen cần chuyển – GmGLP1 trên cây đậu tương ĐT22, ĐT26
và DT84 được chuyển gen thế hệ T
0
40
Hình 8. Cây đậu tương chuyển gen dương tính với PCR giống ĐT22 ở thế hệ T
0
. 42
Hình 9. Hạt cây đậu tương chuyển gen giống ĐT22 ở thế hệ T
0
42
Hình 10. Phản ứng của cây chuyển gen ở thế hệ T1 với Basta 43
Hình 11. DNA tổng số cây T
1
sống sót sau khi phun Basta 44
Hình 12. PCR kiểm tra sự có mặt của gen GmGLP1 trong cây T
1
45
Hình 13. Kết quả lai Southern Blot 46
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
ADN Axit deoxyribonucleic
AS Acetosyringone
BAP 6 – benzylaminopurine
Bar Gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase
Bp Base pair
CCM Cocultivation medium – môi trường đồng nuôi cấy
Cs Cộng sự
dNTP Deoxynucleoside triphosphate
ĐT22 Giống đậu tương ĐT22
Đậu tương (Glycine max(L.) Merr ) [1] hay còn gọi là cây đậu nành là cây
công nghiệp ngắn ngày có hiệu quả kinh tế và giá trị dinh dưỡng cao. Đậu tương là
cây trồng lấy hạt, và là cây cho dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới, chỉ đứng hàng
thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do có khả năng thích ứng rộng nên cây đậu
tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ - chiếm
tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á – 18,54% [85]. Ở Việt Nam, diện tích gieo trồng
đậu tương đang được mở rộng, tính đến tháng 11/2013 diện tích gieo trồng đậu
tương khoảng 117,8 triệu ha, sản lượng đạt khoảng 168,3 nghìn tấn [8].
Tuy nhiên, hiện nay cả thế giới đang phải đối mặt với hiện tượng biến đổi
khí hậu, nền nhiệt hằng năm tăng cao dẫn đến tình trạng hạn hán. Mức độ hạn hán
thường khó dự đoán do phụ thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tần suất và sự phân bố
lượng mưa, mức độ nước bay hơi, và khả năng giữ nước của đất [76, 29]. Theo
Boyer (1982) [13], hạn hán là yếu tố phi sinh học có ảnh hưởng lớn nhất đến năng
suất cây trồng trên toàn thế giới, đồng thời hạn hán có khả năng tác động lên nhiều
giai đoạn phát triển khác nhau của cây trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng
[29]. Bởi sự ấm lên của khí hậu toàn cầu, và nhu cầu thực phẩm tăng ngày càng cao
dưới áp lực của gia tăng dân số, tần suất và sự ảnh hưởng của hạn hán càng trở nên
rõ rệt [68, 63, 22]. Trước thực trạng đó, việc nghiên cứu phát triển những giống cây
trồng mới có khả năng thích ứng, chống chịu tốt trong điều kiện hạn hán đang là một
trong những mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học trên thế giới cũng như các nhà
khoa học Việt Nam.
Các nghiên cứu trước đây về cơ chế phân tử chỉ ra rằng tính trạng chịu hạn ở
thực vật được kiểm soát bởi nhiều gen và được chia làm hai nhóm chính là nhóm
các gen điều hòa và nhóm các gen chức năng [38, 61, 11]. Trong nhóm gen chức
năng thì họ gen mã hóa cho germin-like proteins (GLPs) đóng vai trò thiết yếu đối
với tiềm năng chịu hạn ở cây. Ở đậu tương, họ gen GmGLP được biết đến gồm 21
gen [45], GLPs được biết đến với khả năng SOD, POD là các hoạt tính enzyme
chống oxi hóa. Nhờ đó đóng vai trò quan trọng trong việc thể hiện khả năng chống
2
- Rễ đậu tương bao gồm: rễ chính và rễ phụ. Rễ chính có thể ăn sâu 30-
50cm và có thể trên 1m. Trên rễ chính mọc ra nhiều rễ phụ tập trung nhiều ở tầng
đất 7-8cm rộng 30-40cm
2
[1] Trên rễ chính và rễ phụ có nhiều nốt sần.
- Thân cây đậu tương thuộc thân thảo, có hình tròn, trên thân có nhiều lông
nhỏ, thân trung bình có 14-15 lóng. Toàn thân có 1 lớp lông tơ ngắn, mọc dày bao
phủ từ gốc lên đến ngọn, đến cả cuống lá.
- Lá cây đậu tương có 3 loại lá:
* Lá mầm (lá tử diệp): lá mầm mới mọc có màu vàng hay xanh lục,
khi tiếp xúc với ánh sáng thì chuyển sang màu xanh
* Lá nguyên (lá đơn): Lá nguyên xuất hiện sau khi cây mọc từ 2-3
ngày và mọc phía trên lá mầm. Lá đơn mọc đối xứng nhau.
* Lá kép: Mỗi lá kép có 3 lá chét, có khi 4-5 lá chét. Lá chét mọc so
le, lá kép thường có màu xanh tươi khi già biến thành màu vàng nâu.
- Hoa phát sinh ở nách lá, đầu cành và đầu thân. Hoa mọc thành từng chùm,
mỗi chùm có từ 1-10 hoa và mỗi chùm thường có 3-5 hoa. Hoa đậu tương thuộc loại
hoa lưỡng tính trong hoa có nhị và nhụy, mỗi hoa gồm 5 lá đài, 5 cánh hoa, có 10
nhị và 1 nhụy, vì thế cây đậu tương là cây tự thụ phấn, tỷ lệ giao phẩn rất thấp chỉ
chiếm 0,5 – 1%.
- Số quả đậu tương biến động từ 2-20 quả ở mỗi chùm hoa và có thể đạt tới
400 quả trên một cây. Một quả chứa từ 1-5 hạt, nhưng hầu hết ở các giống đậu
4
tương thường thấy chỉ có từ 2-3 hạt. Quả đậu tương thẳng hoặc hơi cong, có chiều
dài từ 2-7cm hoặc hơn. Quả có màu sắc biến động từ vàng đến trắng tới vàng sẫm
hoặc đen.
- Hạt có nhiều hình dạng khác nhau: hình tròn, hình bầu dục, tròn dẹt, Rốn
hạt có màu sắc khác nhau và đặc trưng cho mỗi giống.
Đặc điểm quá trình sinh trưởng và phát triển của cây đậu tương
- Giai đoạn xuất hiện hoa sớm: cây cao từ 30,48 – 35,56 cm. Lá mầm và lá
đơn trong giai đoạn này có thể bị già hóa.
(ii): Giai đoạn sinh sản: chia ra làm 7 giai đoạn nhỏ:
- Bắt đầu nở hoa: ít nhất 1 hoa nở ra từ một trong các đốt phát triển từ thân
chính của cây.
- Nở hoa hoàn toàn: xuất hiện một hoa đã nở từ 1 trong 2 đốt ở phần ngọn
cây. Một trong hai đốt này có 1 lá đã phát triển hoàn toàn. Chiều cao cây đạt 50%
chiều cao của cây trưởng thành, và đạt 50% tổng số đốt ở cây trưởng thành. Rễ phụ
hướng sâu vào lòng đất, sự cố định nitơ tăng lên nhanh chóng.
- Hình thành quả đậu:một quả phát triển từ 4 đốt trên cùng dài khoảng 0,15
cm. Nhiệt độ, độ ẩm ảnh hưởng lên tổng số quả được hình thành, số lượng hạt được
tạo thành trên mỗi quả và kích thước của hạt.
- Hình thành quả: giai đoạn diễn ra sự phát triển nhanh của quả, sự phát triển
của hạt bắt đầu diễn ra. Khối lượng khô của quả tăng nhanh từ giai đoạn hình thành
quả tới giai đoạn hình thành hạt. Có một quả đậu dài 1,9 cm phát triển từ 4 đốt trên
cùng. Quá trình hình thành hoa diễn ra ở đỉnh thân chính. Đây là giai đoạn quan
trọng đối với năng suất tạo hạt. Bất kỳ điều kiện bất lợi nào cũng làm giảm năng
suất cây.
- Hình thành hạt:hạt có kích thước 0,31 cm trong quả phát triển từ 4 đốt trên
cùng của thân chính. Vào giữa giai đoạn này, cây đạt được chiều cao tối đa, số
lượng đốt tối đa và diện tích bề mặt lá tối đa. Sự cố định nitơ đạt đỉnh và bắt đầu
giảm. Hạt vẫn tiếp tục tích lũy hàm lượng khô. Cuối giai đoạn này, sự tích lũy dinh
6
dưỡng trong các lá cây đạt đỉnh và bắt đầu quá trình dịch chuyển sinh dưỡng đến
hạt. Khả năng phục hồi của cây với điều kiện bất lợi là rất thấp.
- Hình thành hạt hoàn toàn: khối lượng hạt trong giai đoạn này đạt đỉnh. Tốc
độ sinh trưởng diễn ra nhanh nhưng bị chậm lại ở giữa giai đoạn này, và đạt đỉnh ở
giai đoạn bắt đầu trưởng thành. Trong giai đoạn này, hạt phát triển chiếm hết không
gian trong khoang hạt. Sự hóa vàng của lá bắt đầu diễn ra. Sự sinh trưởng của rễ
nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá cao (N: 6,2% ; P
2
O
5
: 0,7% ;
K
2
O: 2,4%) và cũng được dùng sản xuất thức ăn cho gia súc [1].
Tiếp đến, cây đậu tương đóng vai trò trong việc cải tạo đất. Đậu tương là cây
luân canh cải tạo đất tốt. Trong hệ thống luân canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ
cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với cây trồng vụ sau, góp phần tăng năng
suất cả hệ thống cây trồng đồng thời giảm chi phí cho việc bón nitơ. Thân, lá đậu
tương có thể dùng để bón ruộng thay phân hữu cơ bởi hàm lượng nitơ trong thân
chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [1].
1.1.3. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Với những giá trị kinh tế và sử dụng của cây đậu tương, nên cây đậu tương
được xem là một trong những loại cây trồng chiến lược trên toàn thế giới, đứng ở
vị trí thứ 4 chỉ sau cây lúa, cây ngô và cây lúa mì. Do có khả năng thích nghi rộng
với các điều kiện môi trường khác nhau nên cây đậu tương được trồng rộng rãi trên
toàn thế giới, nhưng điều kiện khí hậu khác nhau ở các châu lục do đó, cây đậu
tương được trồng nhiều nhất ở Châu Mỹ chiếm tỷ lệ 76,96%, tiếp đến là Châu Á
chiếm tỷ lệ 18,54%[85]. Theo thống kê của tổ chức Lương thực và Nông nghiệp
Liên hiệp Quốc, diện tích gieo trồng đậu tương trên thế giới tăng khoảng 11,6 triệu
ha trong vòng 4 năm trở lại đây (diện tích gieo trồng năm 2009 là 99,34 triệu ha đến
năm 2013 diện tích gieo trồng tăng lên 111,27 triệu ha) (bảng 1) [27].
Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới trong những năm gần đây
Năm
Diện tích gieo trồng
(triệu ha)
trước.
Bảng 2. Tình hình sản xuất đậu tương của 4 nước đứng đầu trên thế giới
trong những năm gần đây
Năm Quốc gia
Diện tích gieo
trồng (triệu ha)
Năng suất
(tạ/ha)
Sản lượng
(triệu ha)
2011
Mỹ
29,86
28,2
84,19
Brazil 23,97 31,21 74,82
Argentina 18,75 26,07 48,88
Ấn Độ 10,18 12,0 12,21
2012
Mỹ
30,8
26,64
82,05
Brazil 24,98 26,36 65,85
Argentina 17,58 22,81 40,1
Ấn Độ 10,84 13,53 14,66
2013
Mỹ 30,7 29,15 89,48
Brazil 27,86 29,32 81,7
Argentina 19,42 25,4 49,3
nhập khẩu một lượng lớn đậu tương từ các quốc gia khác trên thế giới (năm 2013,
Việt Nam nhập khẩu khoảng 556 nghìn tấn đậu tương từ Hoa Kỳ).
Bảng 3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam trong những năm gần đây
Năm Diện tích gieo trồng
(nghìn ha)
Năng suất (Tấn/ha) Sản lượng
(Nghìn tấn)
2011
181,1 1,47 266,9
2012
119,6 1,45 173,5
2013
117,8 1,43 168,3
2014*
120 1,47 176,4
2015*
130 1,48 192,4
(Nguồn:Tổng cục thống kê Việt Nam (GSO), Bộ Nông nghiệp và Phát triển
Nông thôn, *: Số liệu dự báo của USDA [86])
Ở nước ta, cây đậu tương đang được trồng tại 25 tỉnh thành trong cả nước,
với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực phía Nam, khu
10
vực trồng đậu tương chính tập trung ở vùng Đồng bằng sông Hồng. Diện tích canh
tác đậu tương ngày càng bị thu hẹp, bên cạnh đó sản lượng đậu tương qua các năm
tương đối đồng đều nhưng tổng sản lượng chung qua các năm biến động và theo
chiều hưởng giảm (bảng 3) [8]. Mặc dù chưa có thống kê cụ thể nguyên nhân của
việc diện tích đất gieo trồng đậu tương ngày càng bị thu hẹp, tuy nhiên, kết hợp với
và sự khô cằn của đất làm cản trở quá trình sinh trưởng của rễ [75]. Thực vật có khả
năng đáp ứng hoặc thích nghi với môi trường khác nhau một cách trực tiếp hoặc
gián tiếp liên quan đến tính bền vững và khả năng phục hồi của quá trình quang
hợp, đồng thời kết hợp với các quá trình khác để sinh trưởng và phát triển đặc biệt
là sinh sản [14]. Một điểm nổi bật của khả năng thích ứng với điều kiện bất lợi phi
sinh học là sự kích hoạt các đáp ứng phức tạp bao gồm tương tác gen và xen kẽ
(crsoss-talk) với nhiều con đường phân tử khác nhau.
Các điều kiện bất lợi hạn, lạnh và mặn đều là những điều kiện bất lợi mang
tính thẩm thấu. Đầu tiên chúng gây ra hiện tượng mất nước ở tế bào và dẫn tới làm
giảm khả năng thẩm thấu của tế bào. Tuy nhiên, mức độ mất nước của tế bào gây ra
bởi các điều kiện bất lợi khác nhau là khác nhau: i) điều kiện bất lợi do muối làm
giảm hàm lượng nước trong tế bào do giảm thế năng nước bên ngoài, làm nồng độ
ion tăng (chủ yếu là Na
+
và Cl
-
) dẫn đến khó hấp thu nước qua rễ và vận chuyển
nước đến các tế bào thực hiện hoạt động trao đổi chất; ii) điều kiện bất lợi do lạnh
gây ra làm giảm hàm lượng nước tế bào có thể gọi là hạn sinh lý, tức là không có
khả năng vận chuyển nước có sẵn trong đất đến các tế bào sống, chủ yếu diễn ra ở
phần thịt lá; iii) sự giảm hàm lượng nước trong tế bào gây ra bởi điều kiện bất lợi
hạn là do tình trạng thiếu nước trong đất hoặc trong khí quyển. Để thích nghi với
các điều kiện bất lợi của ngoại cảnh, thực vật phản ứng lại các điều kiện bất lợi
thông qua hai con đường chính là con đường phụ thuộc acid absisic (ABA) và con
đường không phụ thuộc ABA (hình 1).
12
Hình 1. Cơ chế chống chịu của thực vật với điều kiện bất lợi
Thực vật có khả năng chống lại tất cả các yếu tố phi sinh học ảnh hưởng tới
đã từng được nghiên cứu và biến đổi ở cây đậu tương[23, 16]. Cả hai gen
GmDREB2 và P5CR, mã hóa lần lượt cho Dehydration Responsive Element
Binding protein và L-∆
1
-Pyrroline-5-Carboxylate Reductase, đều có mặt tự nhiên
trong hệ gen của đậu tương [24]. Trong điều kiện hạn hán, gen GmDREB2 được
kích hoạt biểu hiện và mã hóa cho một yếu tố phiên mã có khả năng liên kết với yếu
tố di truyền DRE của nhiều gen tham gia vào phản ứng chịu hạn, góp phần kích
hoạt phản ứng thích ứng với môi trường thiếu nước. Chính từ đặc điểm này, các nhà
nghiên cứu đi đến hướng tăng cường sự biểu hiện của gen GmDREB2 nhằm nâng
cao tính chống chịu trong điều kiện môi trường thiếu nước ở thực vật, mà
Arabodopsis chính là một ví dụ liên quan. Trong khi đó, theo Ronde và các cs
(2004)[23], với việc chuyển thêm bản copy của gen P5CR vào trong cây, đậu tương
được xác định có khả năng chống chịu với hạn hán tốt hơn. Theo nghiên cứu này
chỉ ra rằng số lượng gen P5CR có mối liên hệ đến hàm lượng nước trong tế vào,
cũng như hàm lượng proline tự do. Lý do cây chịu hạn tốt hơn là vì proline tự do sẽ
liên kết và làm ổn định màng tế bào.
14
1.4. Gen GmGLP1
Germin-like proteins (GLPs) là những proteins có trình tự tương đồng với
những protein germin được tìm thấy ở cây lúa mỳ và lúa mạch – do vậy GLPs cũng
có các motif germin [45] – và được tìm thấy ở rêu, cây một lá mầm và cây hai lá
mầm [62]. Các phân tích hệ gen ở nhiều loài thực vật cho thấy GLPs được mã hóa
bởi các họ gen gồm nhiều gen thành viên. Trong đó, riêng ở đậu tương đã xác định
có một họ gen GmGLP có 21 gen [45]. Khác với những germin – được biểu hiện ở
hạt đang nảy mầm – các gen GLPs được biểu hiện ở nhiều bộ phận khác nhau của
cây, như ở lá mầm, rễ, lá, hoa, và hạt [45, 62]. Sự biểu hiện này phản ánh vai trò đa
dạng của GLPs trong quá trình phát triển của cây: thực tế, GLPs tồn tại ở dạng
glycoprotein thường kết chuỗi lại trong ma trận ngoại bào nhờ các liên kết ion, và
Phương pháp này sử dụng vi khuẩn A. tumefaciensnhư một vector sinh học
để chuyển một đoạn ADN của chúng vào hệ gen thực vật, kết quả tạo được cây biến
đổi gen [34], [80]. Vi khuẩn A. tumefaciens xâm nhiễm vào cây trồng thông qua vị
trí bị tổn thương của cây. Khi bị tổn thương, mô thực vật sẽ tiết ra một số hợp chất
phenol, hợp chất này đóng vai trò dẫn dụ vi khuẩn A. tumefaciensbiểu hiện vùng
gen Vir nằm trên Ti – plasmid [35]. Kết quả biểu hiện cácgen Vir, sợi đơn T-ADN
sẽ được chuyển và tổng hợp trong hệ gen thực vật. Vấn đề chính của phương pháp
chuyển gen này là làm thế nào để có thể kết hợp giữa tế bào chủ với vector tương
ứng.
Mặc dù ban đầu đậu tương không phải là đối tượng được xem xét để lây
nhiễm với vi khuẩn [21] cho tới khi Pederson và cs (1983) [59] đã chứng minh đậu
tương là vật chủ thích hợp với loại vi khuẩn này. Tuy nhiên, hiệu quả chuyển gen
vẫn bị kiểm soát bởi yếu tố giống [25, 54]. Mặt khác, khả năng thu được các chồi
chuyển gen từ những khối mô có khả năng tái sinh như phôi vô tính và nốt lá mầm
ban đầu rất thấp. Để nâng cao hiệu quả chuyển gen ngày càng có nhiều nghiên cứu
nhằm tối ưu quy trình như: bổ sung hợp chất có vai trò xúc tác như acetosyringone
để kích thích sự biểu hiện của các gen Vir, L-cystein [53], thiol [52] hoặc sử dụng
các chủng vi khuẩn có khả năng gây độc tính cao [32], xác định các yếu tố ảnh
hưởng đến hiệu quả chuyển gen thông qua nốt lá mầm [48, 55], cải tiến nốt lá mầm
16
làm vật liệu biến nạp [58], kết hợp lây nhiễm với tái sinh [15]. Vấn đề khác khi sử
dụng vi khuẩn A. tumefaciens còn phụ thuộc vào chủng khuẩn [47], số lượng bản
sao ADN được tổng hợp trong hệ gen thực vật [60, 71], pH môi trường [65], mức
độ gây tổn thương của cây [65, 70]. Trái ngược với phương pháp chuyển ADN trực
tiếp, chuyển gen thông qua vi khuẩn A. tumefaciens có thể cho kết quả với số bản
copy nhiều hơn, có thể là các mảnh hoặc các đoạn được kết hợp trong một khuôn
mẫu không được kiểm soát.
Những cây đậu tương chuyển gen đầu tiên được tao ra bằng phương pháp nốt
lá mầm sử dụng vi khuẩn A. tumefaciens làm trung gian được báo cáo vào năm
thước 15kD được hình thành. Tuy nhiên, những cây chuyển gen này đều bị khảm và
khi phân tích các cây ở thế hệ sau không thấy có một cây nào có chứa gen mã hóa
zein 15kD.
Gần đây, một phương pháp mới và có khả năng cho hiệu quả hơn đã được
phát triển để biến nạp vi khuẩn A. tumefaciens mang gen vào thẳng tế bào mô đích.
Kỹ thuật mới này gọi là SAAT (Sonication Assisted Agrobacterium – media
transformation) [74]. Sử dụng SAAT với nuôi cấy huyền phù phát sinh phôi vô tính
đã cho hiệu quả chuyển gen ổn định và không có hiện tượng thể khảm. Phương
pháp này có ưu điểm là thời gian nuôi cấy cộng sinh mô thực vật với
Agrobacterium được rút ngắn. Với kỹ thuật quét điện tử hiển vi, nhóm tác giả khám
phá ra SAAT, tạo ra những rãnh và khe nhỏ giống nhau, xuyên qua mô, cho phép A.
tumefaciens dễ dàng đi vào mô đích mong muốn không giống như phương pháp
chuyển nạp gen khác. Sử dụng kỹ thuật SAAT để chuyển gen vào đỉnh sinh trưởng
đã làm gia tăng hiệu quả chuyển nạp gen tạm thời trong nhiều cơ quan như: lá, nốt
lá mầm, phôi hữu tính, phôi vô tính, rễ, thân, chồi, hạt qua sự thể hiện GUS tăng
gấp 100-400 lần trên cây Ohio buckeye, đậu đũa (cowpea), cây vân sam trắng
(white spuruce), lúa mì, ngô và đậu tương, đồng thời gen chuyển nạp tương đối ổn
định qua các thế hệ. Cũng với phương pháp trên Meurer và các cs (1998) [48] áp
dụng trên 28 giống đậu tương. Nhóm tác giả cho rằng, để thực hiện thành công
phương pháp SAAT thì cần khảo sát các yếu tố như: chủng vi khuẩn, xác định tế
bào chủ và khả năng tiếp nhận gen của mô mong muốn. Với phương pháp SAAT ,
chọn những cụm phôi có 10 – 20 phôi (đường kính 2 – 4mm) được lây nhiễm với
1ml dịch khuẩn A. tumefaciens có nồng độ OD
600
= 0,1 – 0,5 trong thời gian 0-300
giây. Sau 2 ngày trên môi trường lây nhiễm có 0,1mM Acetosyringone mẫu được
chuyển lên môi trường chứa 400 mg/l timetin. Hai tuần sau khi SAAT, chuyển mô
Copyright: Tài liệu đại học ©