ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN TIẾN BƯỚC
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG
CỦA VI KHUẨN PHÂN GIẢI PHOSPHATE
KHÓ TAN LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2014
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
NGUYỄN TIẾN BƯỚC
ĐÁNH GIÁ ẢNH HƯỞNG

ii
LỜI CẢM ƠN
Trong quá trình học tập tại Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái
Nguyên cũng như thời gian thực tập tại Phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện
Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam, tôi
đã được trang bị một số kiến thức và kinh nghiệm thực tế giúp tôi hoàn thành
luận văn tốt nghiệp. Tôi xin chân thành cám ơn những tập thể và cá nhân đã giúp
đỡ tôi hoàn thành luận văn của mình.
Tôi xin chân thành cám ơn PGS.TS. Tăng Thị Chính - Trưởng phòng Vi sinh
vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn Lâm Khoa Học và
Công Nghệ Việt Nam, đã định hướng nghiên cứu và tạo điều kiện thuận lợi nhất
cho tôi thực hiện đề tài luận văn.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới Th.S. Đặng Thị Mai Anh và các anh chị
cán bộ Phòng Vi sinh vật Môi Trường - Viện Công Nghệ Môi Trường - Viện Hàn
Lâm Khoa Học và Công Nghệ Việt Nam đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực
tập hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy cô giáo
Khoa Khoa học Sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên đã luôn quan
tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè những
người đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình học tập và
thực hiện đề tài luận văn.
Thái Nguyên, ngày 19 tháng 05 năm 2014
Tác giả luận văn Nguyễn Tiến Bước

trên thế giới 16 iv
1.7.3. Ứng dụng vi sinh vật phân giải phosphate khó tan sản xuất phân vi sinh ở
Việt Nam 18
CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20
2.1. Vật liệu nghiên cứu 20
2.2. Thiết bị (Phụ lục) 20
2.3. Môi trường (Phụ lục) 20
2.4. Hóa chất 20
2.4.1. Các hóa chất chung 20
2.4.2. Dung dịch phân tích 20
2.5. Phương pháp phân tích vi sinh vật 21
2.5.1. Phương pháp lấy mẫu đất 21
2.5.2. Phương pháp pha loãng 21
2.5.3. Phương pháp xác định mật độ vi sinh vật 22
2.6. Phương pháp phân tích hóa học 22
2.6.1. Phương pháp phân tích P tổng số trong đất 22
2.6.2. Phương pháp phân tích phosphate dễ tiêu trong đất (Phương pháp Olsen) 25
2.6.3. Phương pháp xác định độ ẩm và hệ số khô kiệt 27
2.7. Bố trí thí nghiệm 28
2.7.1. Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 28
2.7.2. Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng 29
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30
3.1. Kết quả ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với cây trồng
đỗ xanh trong phòng thí nghiệm 30
3.1.1. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan đối với hàm lượng
photpho tổng số và photpho dễ tiêu trong đất 30
3.1.2. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên các vi sinh vật trong

9 P Photpho
10 PGL Phân giải lân
11 PTN Phòng thí ngiệm
12 TN Thí nghiệm
13 VK Vi khuẩn
14 VSV Vi sinh vật vii

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Các VSV có khả năng phân giải các nguồn phosphate khó tan
khác nhau 11
Bảng 2.1. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P để xây dựng đường chuẩn P
tổng số 23
Bảng 2.2. Nồng độ dung dịch tiêu chuẩn ppm P để xây dựng đường chuẩn P
dễ tiêu 25
Bảng 2.3. Bố trí thí nghiệm quy mô phòng thí nghiệm 28
Bảng 2.4. Bố trí thi nghiệm quy mô đồng ruộng 29
Bảng 3.1. Mật độ VSV phân giải phosphate và VSV tổng số hiếu khí ở các mẫu
đất trồng cây đỗ xanh 33
Bảng 3.2. Chiều cao sinh trưởng của cây đỗ xanh phòng thí nghiệm theo thời gian 34
Bảng 3.3. Khối lượng và chiều dài của rễ cây đậu xanh 35
Bảng 3.4. Kết quả mật độ vi sinh phân giải phosphate và vi sinh vật tổng số trong
đất trồng ngô 40
Bảng 3.5. Kết quả mật độ vi sinh vật phân giải phosphate khó tan và VSV tổng
số trong đất trồng rau bắp cải 45

tiêu trong đất trồng ngô 39
Hình 3.9. Hình ảnh cây ngô ở quy mô ngoài đồng ruộng 41
Hình 3.10. Ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan và mùn hữu cơ
từ rác thải sinh hoạt lên năng suất của cây ngô 41
Hình 3.11. Kết quả phân tích hàm lượng photpho tổng số trong mẫu đất trồng cây
rau bắp cải 43
Hình 3.12. Kết quả phân tích hàm lượng photpho dễ tiêu 44
Hình 3.13. Ảnh hưởng của VK phân giải P lên sự phát triển sinh khối và rễ của
cây rau bắp cải 46
1
MỞ ĐẦU
1. Lý do chọn đề tài
Phospho (P) là một trong những nguyên tố đóng vai trò quan trọng trong quá
trình sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Nó là một trong những thành phần
chính cấu tạo nên tế bào thực vật bao gồm axit nucleic, phospholipid, coenzyme,
đường phosphoryl, nucleotide và phytate. P có vai trò quan trọng trong nhiều quá
trình trao đổi chất liên quan đến sinh trưởng và phát triển của cây [8]. Nhưng trong
đất P thường tồn tại ở các dạng muối phosphate khó tan mà cây trồng không thể hấp
thụ được. P tồn tại trong đất dưới dạng hợp chất hữu cơ và hợp chất vô cơ. Tỉ lệ của
hai dạng này là khác nhau ở các loại đất, thường xấp xỉ 2/3 là P vô cơ, phần còn lại
là P hữu cơ [3].
Xuất phát từ thực tế nước ta có trữ lượng P rất lớn. Chúng ta đã sản xuất
được một số loại phân hóa học có chất lượng tốt. Tuy nhiên, việc lạm dụng phân
hóa học kéo theo nhiều nguy hại cho môi trường, đất bị bạc màu, cạn kiệt chất dinh
dưỡng. Do đó, sử dụng phân bón vi sinh thay thế một phần phân hóa học là giải
pháp tốt hướng tới một nền nông nghiệp sạch và bền vững sinh thái [8].
Để đáp ứng yêu cầu ngày càng cao của nông nghiệp và để góp phần nâng

Phân vi sinh là chế phẩm có chứa các VSV sống có hoạt lực cao đã được tuyển
chọn. Thông qua các hoạt động trao đổi chất chúng tạo ra các chất dinh dưỡng cho đất
và cây trồng. Để đảm bảo lượng phân vi sinh cần có sự kiểm tra chặt chẽ, thường
xuyên về mật độ cũng như chất lượng của chủng VSV hữu ích có trong phân bón để
tránh gây lãng phí, thiệt hại cho người tiêu dùng [2], [4]. Sử dụng chế phẩm VSV
thường tăng năng suất cho cây trồng, đồng thời có thể tiết kiệm lượng phân hóa học
đáng kể, góp phần tạo sản phẩm sạch cho nông nghiệp và bảo vệ môi trường [13], [17].
Việc đánh giá được mức độ ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó
tan làm cho đất có độ phì nhiêu cao và cây trồng đạt năng suất cao. Trên cơ sở lý
luận và thực tiễn của hướng nghiên cứu này chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:
“Đánh giá ảnh hưởng của vi khuẩn phân giải phosphate khó tan lên một số loại
cây trồng”
2. Mục tiêu nghiên cứu
Tuyển chọn được chủng có khả năng phân giải phosphate khó tan cao phục
vụ cho sản xuất phân hữu cơ vi sinh
3. Nội dung nghiên cứu
Đề tài được thực hiện với các nội dung sau:
Đánh giá mật độ vi sinh vật phân giải phosphate trong đất trồng đỗ xanh
trong phòng thí nghiệm và mật độ vi sinh vật trong đất trồng ngô và rau bắp cải ở
ngoài đồng ruộng.
Phân tích hàm lượng P tổng số và P dễ tiêu trong đất trồng đỗ xanh phòng thí
nghiệm và đất trồng ngô, đất trồng rau bắp cải ngoài đồng ruộng.
Đánh giá ảnh hưởng của vi sinh vật lên năng suất cây trồng.
3
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Khái quát về photpho đối với cây trồng

P
2
O
5
+ H
2
O = 2HPO
3
Metaphosphoric
HPO
3
+ H
2
O = H
3
PO
4
ortophosphoric
2H
3
PO
4
= H
4
P
2
O
7
+ 2 H
2

gốc từ sự phân hủy xác chết của sinh vật. Tùy vào nguồn gốc và quá trình tạo thành
mà hàm lượng P trong các loại đất, các tầng đất khác nhau là khác nhau [9].
P trong đất cung cấp cho cây qua đất, phân phosphate vô cơ, phân chuồng
động vật, các chất thải nông nghiệp, xác động thực vật cũng như VSV, rác thải hữu
cơ, rác thải sinh hoạt và quặng phosphate [21], [26].
Trong tự nhiên nói chung và trong đất nói riêng, P tồn tại ở hai dạng chủ yếu
là P hữu cơ và P vô cơ. Tỉ lệ của hai dạng này là khác nhau ở các loại đất, thường
xấp xỉ 2/3 là P vô cơ, phần còn lại là P hữu cơ [3].
1.4.1. Phosphate hữu cơ
Tùy theo loại đất, tỷ lệ P hữu cơ thường chiếm từ 20 - 80% P tổng số trong
đất. Ở lớp đất mặt, P chiếm khoảng 50%. Những nhóm hợp chất P hữu cơ tồn tại
trong đất gồm: phospholipid, axit nucleic, inositol phosphate, nucleoprotein và
phytate [12].
P hữu cơ chuyển sang phosphate vô cơ bởi quá trình khoáng hóa nhờ VSV.
VSV phân hủy những hợp chất này và tạo ra P dễ tiêu cho cây trồng dưới dạng axit
phosphoric và muối dễ tan của nó [29], [32]. Nhưng các dạng lân này lại bị đất hấp 5
phụ và VSV hút lại, nên trong đất có rất ít phosphate ở dạng hòa tan. Nhiều tác giả
nghiên cứu cho rằng: nếu chất hữu cơ vùi trong đất là chất hữu cơ nghèo phosphate
thì qua quá trình phân giải hàm lượng P hữu cơ trong đất không tăng mà còn giảm
xuống [10].
Theo những công trình nghiên cứu của Kalia (1954): nếu chất hữu cơ vùi
xuống đất chứa ít hơn 0,2 - 0,3% P
2
O
5
thì quá trình phân giải không tăng thêm
lượng phosphate dễ tan cho cây vì VSV sẽ hút hết. Cường độ hút P hữu cơ của đất

4
-nH
2
O và
phosphate của kim loại kiềm thổ trong đất trung tính hoặc kiềm Ca
3
(PO
4
)
2
,
Mg
3
(PO
4
)
2
.
P tan trong axit yếu: loại này thực vật có thể sử dụng được nhưng chậm.
Trong đất thường gặp ở dạng CaHPO
4
, MgHPO
4
nhất là trong đất chua nhẹ và đất
trung tính.
P tan trong nước: thường gặp là những P tan như K
2
HPO
4
, NaH

PO
4
-
→ HPO
4
2-
→ PO
4
3-

Trong thực tế, H
2
PO
4
-
là dạng cây trồng dễ hấp thụ nhất. Các dạng phosphate
còn lại thường là những dạng khó tan mà cây trồng không thể đồng hóa được, muốn
cây trồng sử dụng được phải qua quá trình biến đổi thành dạng dễ tan. Dưới tác
dụng của VSV, P hữu cơ được vô cơ hóa biến thành các dạng muối của axit
phosphoric. Các dạng P này một phần được cây trồng sử dụng biến thành dạng P
hữu cơ, một phần bị cố định dưới dạng khó tan như Ca
3
(PO
4
)
2
, FePO
4
, AlPO
4

chu trình nước và các sinh vật sống dưới nước trung bình xấp xỉ 100.000 năm cho
đến khi nó cuối cùng nghỉ ngơi dưới đáy đại dương trong thành các trầm tích [8].
P có thể ở lại bên trong trầm tích hơn 100 triệu năm và trái với chu trình
carbon và nitơ, P không lọc qua bầu khí quyển của Trái đất. Chu trình P lần lượt là
một chu trình trầm tích. P trong các đại dương và trầm tích sông được nâng lên bởi
các thành phần bên ngoài địa chất và có thể lại trở lại bề mặt trái đất một lần nữa. Mọi
thứ cứ quay vòng như thế tạo chu trình to nhỏ [8].
Tác động của con người đã làm thay đổi rất lớn tới chu trình P trong tự
nhiên thông qua các hoạt động như khai thác mỏ, các hoạt động nông nghiệp:
trồng cây và bón phân (đặc biệt là các sản phẩm phân bón hóa học). Trong phân
bón có chứa một lượng lớn P. Lượng P khi sử dụng sẽ đi vào chu trình P thông
qua các con đường khác nhau. Nguồn phosphate làm phân bón được khai thác từ
quặng apatit chứa chủ yếu là canxi phosphate. Trong quá trình sản xuất phân bón
super phosphate, axit sulfuric giúp chuyển hóa đá chứa phosphate thành phân
bón. Hàng năm, P trả lại cho chu trình đại sinh thái là 60.000 tấn. Trong khi đó
đầu vào của chu trình là khoảng 2.000.000 tấn (qua phân bón). Thực vật không
hấp thu hoàn toàn lượng phân bón phosphate sử dụng chứng tỏ lượng hao hụt
qua chu trình là khá lớn, một lượng lớn còn lại bị rửa trôi vào nguồn nước và
tích tụ ở nền đáy ao hồ gây ô nhiễm nguồn nước. P bổ sung quá nhiều không chỉ
gây ảnh hưởng tới môi trường nước mà còn có thể làm tăng sự phát triển của
sinh vật (ví dụ hiện tượng phú dưỡng gây hiện tượng tảo nở hoa) và làm thay đổi
sự cân bằng sinh vật trong các hệ sinh thái [1], [8].
Dưới đây là sơ đồ tóm tắt chu trình tuần hoàn của P giúp ta hiểu phần nào về
chu trình này thông qua cả 2 chu trình P trong nước, chu trình P trong đất và tác
động của con người tới chu trình [41]. 8

Hình 1.1. Quá trình chuyển hóa P trong hệ sinh thái [41]

Ca
3
(PO
4
) hoặc lexitin [11].
Các vi sinh vật phân giải phosphate khó tan được biết đến nay là các
loài: Pseudomonas, Micrococus, Bacillus, Flavobacterium, Penicillium, Sclelotium,
Aspergillus. Các VSV này không chỉ phân giải phosphate canxi, phosphate nhôm,
sắt, mangan và kể cả quặng. VSV không chỉ chuyển hóa phosphate vô cơ, mà còn
có khả năng khoáng hóa các hợp chất lân hữu cơ tạo ra sản phẩm mà cây trồng có
thể hấp thu được [36]. 10Hình 1.4. Các VSV phân giải phosphate [36]
VSV phân giải P khó tan phân bố rộng rãi trong các tầng đất và đặc biệt ở
vùng rễ, các loại rễ khác nhau thì khác nhau (các VSV này có thể ở trong rễ, bề mặt
rễ, đất vùng rễ và đất không phải vùng rễ). Đồng thời số lượng VSV phân giải P
cũng thay đổi theo điều kiện khí hậu và lịch sử của đất, phụ thuộc vào chất đất, chế
độ canh tác, loại cây trồng, mùa vụ và tuổi của cây… [20].
Theo Jayandra và cộng sự đã tổng kết: “Sự xuất hiện của VSV phân giải
phosphate trong rễ cây là cao nhất sau đó là đất quanh rễ. Tới nửa số VSV đất được
kiểm tra có khả năng hòa tan Ca
3
(PO
4
)
2

Achromobacter spp
Bacillus sp, B.pulvifacien, B.criculans,
B.subtilis, B.mycoides, B.mesenteries,
B.fluorescence, B.megaterium.
Pseudomonas sp, P.putida, P.culcis,
P.rathonia, P.liquifaciens.
Escherichia freundii, E.intermedia
Xanthomonas spp
Flarobacterium spp
Brevibacterium spp
Serratia spp
Alcaligenes spp
Aerobacter acrogens
Erwinia spp
Nitrosomonas spp
Thiobaccillus thiooxidans

Xạ khuẩn
Micromonospora sp
Nocardia sp
Streptomyces sp
Chất khoáng
Phytate
Tricanxi phosphate
Canxi phosphate
Sắt phosphate
Hydroxyapatit

Fluorapatit
Quặng phosphate

2
và bột apatit. Khả năng phân giải P vô cơ liên quan mật thiết tới sự sản
sinh axit của VSV. Quá trình lên men tạo ra axit carbonic, là axit chủ yếu thúc đẩy
quá trình hòa tan P vô cơ [10].
Ca
3
(PO
4
)
2
+ H
2
CO
3
+ H
2
O → Ca(PO
4
)
2
H
2
O + Ca(HCO
3
)
2

Trong đất, VK nitrat hóa và VK chuyển hóa lưu huỳnh cũng có tác dụng
quan trọng trong việc phân giải Ca
3

2

Ca
3
(PO
4
)
2
+ 2H
2
SO
4
→ Ca(H
2
PO
4
)
2
+ CaSO
4

Đối với nấm thì Aspergillus niger có khả năng phân giải P mạnh nhất. Ngoài
ra còn có một số chi khác như Penicillin, Rhizopus…
1.5.2. Ảnh hưởng của vi sinh vật phân giải phosphate lên phân bón
Trong tự nhiên, P nằm trong nhiều dạng hợp chất khác nhau. Các hợp chất P
hữu cơ trong đất có nguồn gốc từ xác động vật, thực vật, phân xanh, phân chuồng…
Những hợp chất P hữu cơ này được vi sinh vật phân giải tạo thành những hợp chất
P vô cơ khó tan, một số ít được tạo thành ở dạng dễ tan. Hợp chất P hữu cơ quan
trọng nhất được phân giải ra từ tế bào vi sinh vật là nucleotide.
Nucleotide có trong thành phần nhân tế bào. Nhờ tác động của các nhóm vi


14
1.6. Hiệu quả của phân vi sinh vật phân giải phosphate
Hàm lượng P dễ tiêu trong hầu hết các loại đất đều rất thấp. Vì vậy việc bón
lân cho đất nhằm nâng cao năng suất cây trồng là việc làm cần thiết. Người ta cũng
biết rằng khoảng 2/3 lượng lân bón vào đất được chuyển hóa thành dạng cây trồng
không sử dụng được hoặc bị rửa trôi. Phân vi sinh vật phân giải phosphat khó tan
không chỉ có tác dụng nâng cao hiệu quả cuả phân bón lân khoáng nhờ hoạt tính
phân giải và chuyển hóa của các chủng vi sinh vật mà có tác dụng tận dụng nguồn
phosphat có sẵn trong đất. Nhiều công trình nghiên cứu ở châu Âu, châu Mĩ cũng
như ở các nước châu Á đều cho thấy hiệu quả to lớn của phân vi sinh vật phân giải
phosphate. Tại Ấn Độ VSV phân giải lân được đánh giá có tác dụng tương đương
với 50 kg P2O5/ha. Sử dụng VSV phân giải lân cùng quặng phosphat có thể thay
thế được 50% lượng lân khoáng cần bón mà không ảnh hưởng đến năng suất cây
trồng.
Các kết quả nghiên cứu ở Liên Xô, Canada cũng cho các kết quả tương tự.
Sản phẩm phosphobacterin và PB500 đã được sản xuất trên quy mô công nghiệp ở 2
quốc gia này. Hiện nay Trung Quốc và Ấn Độ là 2 quốc gia đang đẩy mạnh quy mô
phát triển và ứng dụng công nghệ sản xuất phân lân vi sinh vật ở quy mô lớn với
diện tích sử dụng hàng chục triệu ha. Tại Việt Nam các công trình nghiên cứu gần
đây cho biết 1 gói chế phẩm VSV phân giải lân sử dụng cho cafe trên vùng đất đỏ
Bazan có tác dụng tương đương với 34,3kg P
2
O
5
/ha. Bón phân vi sinh có tác dụng
làm tăng số lượng VSVPGL trong đất, dẫn đến tăng cường độ phân giải lân khó tan
trong đất 23-35%. Cây trồng phát triển tốt hơn, thân lá cây mập hơn, to hơn, bản lá
dày hơn, tăng sức đề kháng sâu bệnh, tăng năng suất đậu tương 5-11%, lúa 4,7-15%
so với đối chứng

(48,9.10
6
/g) và thấp nhất ở đất kiềm ( 20.10
3
/g), trong khi ở đất nâu vàng, đất đỏ và đất
phèn là 20,4. 10
6
; 1,07. 10
6
; 0,98. 10
6
/g đất. Trong số 265 chủng VK PS, 44 chủng chiếm
16,6% bao gồm B. megatherium, Arthrobacter sp., Flavobacter sp., Erwinia sp.,
Pseudomonas sp. có hoạt tính hòa tan P 25,30mg/g; 67 chủng chiếm 25,3% bao gồm B.
alcaligenes, B. polumyxa, B. sutilis có hoạt tính hòa tan P 20,25g/mg; 51 chủng (19,2%)
bao gồm B. cereus, B. sphaericus có hoạt tính hòa tan P 15,20mg/g; 33 chủng (12,5%)
bao gồm Chromobacterium violaceum và Serratia sp. có hoạt tính hòa tan P 5,1mg/g và
18 chủng (6,8%) gồm B. firmus có hoạt tính hòa tan P 2,5mg/g [44].
Halder và cs (1991) cũng nghiên cứu khả năng hòa tan phosphate của chủng
Bradihizobium trong môi trường nuôi cấy có chứa cả hydroxyapatit và canxi phosphate.
Quá trình hòa tan phosphate của các chủng dẫn đến làm giảm pH môi trường. Nitơ ở
dạng amoni là nguồn nitơ thích hợp cho quá trình hòa tan phosphate. Tuy nhiên, nitrat
cũng là một nguồn nitơ khá hiệu quả hỗ trợ PO
4
3-
phân giải. Trong đó, glucose là nguồn
carbon tốt nhất cho quá trình phân giải [30].
Sự hòa tan FePO
4
và AlPO