i
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
ĐÀO MINH THUẬN
ĐÁNH GIÁ SỰ ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN
CỐ ĐỊNH NITƠ LÊN MỘT SỐ LOẠI CÂY TRỒNG
LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2014
ii
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
2013 tới tháng 5 năm 2014.
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Học viên Đào Minh Thuận
iv
MỤC LỤC
2.2. Đối tƣợng nghiên cứu 26
2.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 26
2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 26
2.3.2 Thời gian nghiên cứu 26
2.4. Bố trí thí nghiệm 26
2.4.1. Thực hiện bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm 26
2.4.2. Thực hiện bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng 27
2.5. Phƣơng pháp phân tích 28
2.5.1. Phƣơng pháp xác định mật độ vi sinh vật 28
2.5.2 . Phƣơng pháp xác định chỉ số nốt sần 28
2.5.3. Phƣơng pháp xác định độ ẩm và hệ số khô kiệt của đất 29
2.5.4. Phƣơng pháp phân tích nitơ trong đất 30
2.5.4.1. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitơ tổng số 30
2.5.4.2. Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng nitơ dễ tiêu 31
2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu 31
CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32
3.1. Ảnh hƣởng của vi khuẩn cố định nitơ lên cây đậu xanh trên quy mô
phòng thí nghiệm 32
3.1.1. Kết quả vi sinh vật trong các mẫu đất 32
3.1.2. Đánh giá tác động của vi khuẩn cố định nitơ tới hàm lƣợng nitơ tổng số
và nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng đậu xanh 34
3.1.3. Đáng giá tác động của vi sinh vật cố định nitơ lên sinh trƣởng và năng
suất của cây đậu xanh 37 vi
3.2. Đánh giá hiệu quả của vi khuẩn cố định nitơ lên cây ngô và cây bắp cải
ngoài đồng ruộng 40
3.2.1. Đánh giá hiệu quả của vi khuẩn cố định nitơ lên cây ngô 40
3.2.1.1. Đánh giá mật độ vi sinh vật trong các mẫu đất trồng ngô 40
ATP
Adenosin triphosphat
2
Az
Azotobacter
3
CFU
Colony Forming Unit
4
Cl
Clostridium
6
ĐC
Đối chứng
7
ĐC(-)
Đối chứng âm
8
ĐC(+)
Đối chứng dƣơng
5
DNA
Deoxyribonucleic acid
9
MPA
Meat pepton agar
10
N
Nitơ
11
Bảng
Tên bảng
Trang
1.1
Tình hình sử dụng chế phẩm nốt sần cho cây đậu đỗ tại Việt
Nam
22
1.2
Khả năng cố định nitơ của một số cây họ đậu trên đồng
ruộng
24
2.1
Bố trí thí nghiệm trong phòng thí nghiệm
26
2.2
Bố trí thí nghiệm trên quy mô đồng ruộng với vi khuẩn cố
định nitơ
27
2.3
Các thông số xác định chỉ số nốt sần
28
3.1
Sự biến động mật độ vi khuẩn cố định nitơ tự do, nitơ cộng
sinh và vsv tổng số trong các mẫu đất trồng cây đậu xanh
32
3.2
Chỉ số nốt sần ở rễ cây đậu xanh
33
3.3
Kết quả so sánh hàm lƣợng nitơ tổng số và nitơ dễ tiêu
Tên hình
Trang
1.1
Vòng tuần hoàn nitơ trong tự nhiên
4
1.2
Azotobacter
7
1.3
Clostridium
9
1.4
Nốt sần rễ họ đậu
12
1.5
Sự xâm nhiễm của vi khuẩn nốt sần
14
2.1
Đồ thị đƣờng chuẩn P tổng số (mg/ml) ở OD
882
34
2.2
Đồ thị chuẩn đƣờng P dễ tiêu (mg/ml) với OD
882
37
3.1
Sự biến động của nitơ tổng số trong mẫu đất trồng đậu xanh
34
Kết quả phân tích nitơ dễ tiêu trong mẫu đất trồng cây bắp
cải
46
3.12
Sinh khối tƣơi trung bình của cây bắp cải khi thu hoạch
48
x
LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày chân thành bày tỏ lòng biết ơn
sâu sắc tới PGS.TS Tăng Thị Chính – Trƣởng phòng Vi sinh vật Môi trƣờng
– Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt
Nam, đã định hƣớng nghiên cứu, hƣớng dẫn và tạo điều kiện về kinh phí, hóa
chất, thiết bị trong suốt thời gian thực hiện luận văn tại phòng.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới Th.S Đặng Thị Mai Anh và các
anh chị, cán bộ phòng Vi sinh vật môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng –
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã nhiệt tình hƣớng dẫn,
giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Tôi xin cảm ơn tới PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh cùng các thầy
cô giáo trong trƣờng Đại học Khoa học – Đại học Thái Nguyên; các thầy cô
trong Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ
Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè,
những ngƣời đã luôn bên tôi, động viên và góp ý cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện luận văn này.
Hà Nội, tháng 05 năm 2014
Học viên
nitơ lên một số loại cây trồng”.
* Mục tiêu của đề tài:
Đánh giá hiệu quả của các chủng vi khuẩn cố định nitơ đã đƣợc tuyển
chọn của Phòng Vi sinh vật Môi trƣờng – Viện Công nghệ Môi trƣờng – Viện
Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam lên một số loại cây trồng, qua đó 2
phục vụ sản xuất phân hữu cơ nhằm hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học,
tăng năng suất cây trồng và bảo vệ môi trƣờng.
* Nội dung nghiên cứu
- Đánh giá khả năng cố định nitơ và và sự ảnh hƣởng của vi khuẩn cố
định nitơ lên năng suất cây trồng khi bổ sung vào đất ở quy mô phòng thí
nghiệm.
- Đánh giá khả năng cố định nitơ và và sự ảnh hƣởng của vi khuẩn cố
định nitơ lên năng suất cây trồng khi bổ sung vào đất ở quy mô ngoài đồng
ruộng.
dƣơng [38].
Cây trồng không đồng hóa trực tiếp nitơ hữu cơ, mà phải nhờ các loại
vi sinh vật phân hủy và chuyển hóa nguồn nitơ bền vững thành ra nitơ dạng
dễ tiêu (NH
3
hoặc NH
4
+
), cung cấp nguồn dinh dƣỡng nitơ cho cây trồng, quá
trình này đƣợc gọi là quá trình amôn hóa [9]. Các vi sinh vật có khả năng
amôn hóa bao gồm nhiều loài sinh bào tử hoặc không sinh bào tử, có khả 4
năng sử dụng nhiều nguồn vật chất khác nhau. Các vi sinh vật này có khả
năng tiết ra men phân giải protein vào môi trƣờng, thủy phân thành các amino
acid. Khi đó, chúng sử dụng các amino acid này trong quá trình dị hóa và
đổng hóa.
Tiếp nối quá trình amôn hóa, các loài vi sinh vật lại chuyển hóa tiếp từ
NH
3
thành NO
3
-
đƣợc gọi là quá trình nitrat hóa.
Tiếp theo của quá trình nitrat hóa, các loại vi sinh vật lại chuyển hóa từ
NO
3
-
thành N để bù trả nitơ cho không khí và đƣợc gọi là quá trình phản nitrat
không nhìn thấy đƣợc [7].
Quá trình cố định nitơ có thể xảy ra nhờ các tác nhân vật lý, hóa học
hoặc sinh học, trong đó ngƣời ta quan tâm nhiều đến quá trình cố định đạm
sinh học vì hiệu quả và tính an toàn của nó đối với môi truờng.
Quá trình cố định nitơ phân tử là quá trình khử nitơ thành NH
3
có xúc
tác của enzym nitrogenaza, khi có mặt của ATP [31].
6
N
2
+ AH
2
+ ATP NH
3
+ A + ADP + P
Năm 1992, các nhà khoa học đã hoàn thiện đƣợc cơ chế của quá trình
cố định nitơ phân tử nhƣ sau [31]:
N = N NH=NH H
2
N-NH
2
NH
3
nitrogenaza
nitrogenaza
7
Tất cả các loài Azotobacter (theo hình 1.2) đều sống dị dƣỡng. Để dùng
nguồn cacbon, chúng sử dụng nhiều nguồn hữu cơ khác nhau: monosaccarit,
disaccarit, một số polysaccarit đa đƣờng, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả
các hợp chất thơm. Nguồn nitơ đối với Azotobacter không chỉ là nitơ phân tử
mà còn là muối ammon, nitrat, nitrit, amino axit.
Hình 1.2. Azotobacter [34]
Tùy thuộc vào các hợp chất chứa nitơ có trong môi trƣờng mà quá trình
cố định nitơ trong môi trƣờng bị ức chế nhiều hay ít. Azotobacter có nhu cầu
lớn đối với photpho, canxi và nhận năng lƣợng từ quá trình oxy hóa các hợp
chất hữu cơ thành CO
2
và H
2
O. Phần lớn các chủng Azotobacter phát triển ở
pH lớn hơn 6 và cần độ ẩm cao hơn so với nhiều loại vi khuẩn, vì vậy ít gặp
chúng ở nơi khô hạn. Phần lớn các chủng Azotobacter phân lập đƣợc từ tự
nhiên có khả năng cố định đƣợc trên 10mgN/1g hợp chất cacbon. Một số
chủng Azotobacter trong điều kiện thích hợp có khả năng đồng hoá đƣợc đến
300mgN/1g hợp chất cacbon.
Nhiều nghiên cứu cho biết khi phát triển chung với một số vi khuẩn
khác Azotobacter sẽ có hoạt động cố định nitơ cao hơn so với việc nuôi cấy
riêng rẽ. Azotobacter sẽ đem một phần nitơ đồng hoá đƣợc đƣa vào môi
trƣờng dƣới dạng NH
nitơ phân tử mạnh mẽ nhất. Tế bào của Cl. Pasteurianum là loại trực khuẩn
khá lớn, dài 1,5 – 8μm và rộng 0,8 – 1,3μm [21], [24]. Đây là nhóm dị dƣỡng 9
hóa năng hữu cơ, các nguồn hữu cơ chúng sử dụng: monosaccarit, disaccarit,
một số polysaccarit nhiều rƣợu, các axit hữu cơ trong đó bao gồm cả các hợp
chất thơm (theo hình 1.3).
Hình 1.3. Clostridium (theo CDC Public Health, 2007) [32]
1.2.1.3. Vi khuẩn Beijerinskii
Năm 1893 nhà bác học Ấn Độ Stacke đã phân lập đƣợc một loài vi
khuẩn ở ruộng lúa nƣớc pH rất chua có khả năng cố định nitơ phân tử, ông đặt
tên là vi khuẩn Beijerinskii.
Vi khuẩn Beijerinskii có khả năng đồng hóa tốt các loại đƣờng đơn,
đƣờng kép, cứ tiêu tốn 1g đƣờng gluco nó cố định đƣợc khoảng 5 – 10mgN.
Vi khuẩn Beijerinskii có hình cầu, hình bầu dục hoặc hình que, gram âm
không sinh nha bào, hiếu khí, một số loài có tiêm mao có khả năng di động.
Kích thƣớc tế bào dao động 0,5 – 2,0μm x 1,0 – 4,5μm, khuẩn lạc thuộc nhóm
S, rất nhầy, lồi không màu hoặc màu nâu tối khi già, không tạo nang xác.
Khác với vi khuẩn Azotobacter, vi khuẩn Beijerinskii có tính chống
chịu cao với acid, nó có thể phát triển ở môi trƣờng pH = 3 nhƣng vẫn phát
triển ở pH trung tính hoặc kiềm yếu, vi khuẩn Beijerinskii sống thích hợp ở độ
ẩm 70 – 80% và ở nhiệt độ 25 – 28
o
C. Vi khuẩn Beijerinskii phân bố rộng
trong tự nhiên, nhất là ở vùng nhiệt đới và á nhiệt đới. 10
- Năm 1984, theo Bergey thì vi khuẩn nốt sần thuộc họ Rhizobiaceae
có 2 nhóm, gồm 7 loài sau:
+ Nhóm 1: có 2 – 6 tiên mao, mọc theo kiểu chùm mao hoặc chu mao,
phát triển nhanh trên môi trƣờng cao nấm men (môi trƣờng nuôi cấy vi khuẩn
nốt sần).
Thuộc về nhóm 1 bao gồm có 4 loài: Rhizobium leguminosarum (cộng
sinh ở cây đậu Hà Lan); Rhizobium phaseolii (cộng sinh ở cây đậu Côve);
Rhizobium trifolii (cộng sinh ở cây cỏ Ba lá); Rhizobium meliloti (cộng sinh ở
cây phân xanh – medicago).
+ Thuộc về nhóm 2 bao gồm có 3 loài: Rhizobium japonicum (cộng
sinh ở cây đậu tƣơng); Rhizobium vigna (cộng sinh ở cây đậu xanh, cây l5c);
Rhizobium lupini (cộng sinh ở cây lupin).
- Năm 1996, tạm phân loại vi khuẩn nốt sần thành 2 nhóm với 4 giống:
Sinorhizobium feradii; Bradyrhizobium; Agrobacterium; Phyllobacterium.
Trong 4 giống trên chỉ có 2 giống là Bradyrhizobium và Sinorhizobium
feradii có khả năng cố định nitơ phân tử trong nốt sần rễ cây họ đậu.
Đặc điểm của giống Sinorhizobium feradii là những loài mọc nhanh,
sản sinh axit, hình thành độ đục trên môi trƣờng dịch thể. Khuẩn lạc hình
thành trong 2 – 3 ngày, có thời gian thế hệ là 2 – 4 giờ, có kích thƣớc khoảng
0,5 – 1,3μm x 2,5 – 3,0μm. Có từ 2 – 3 roi, có khả năng di động đƣợc và phát
triển tốt ở môi trƣờng gluco, mannitol và sacazozơ. Loài vi khuẩn này thích
hợp ở vùng nhiệt độ ôn hòa [4].
Đặc điểm của giống Bradyrhizobium là những loài mọc chậm, sản sinh
chất kiềm. Khuẩn lạc hình thành 3 – 5 ngày, có thời gian thế hệ là 6 – 8 giờ,
có kích thƣớc 0,3 – 1,2μm x 2,2 – 3,2μm, có từ 1 – 2 tiên mao, có khả năng di
động đƣợc. Chúng phát triển tốt ở môi trƣờng pentozơ. 12
1.2.2.2. Đặc tính sinh học và tính chuyên hóa của vi khuẩn nốt sần
Vi khuẩn nốt sần thƣờng xâm nhập vào rễ cây họ đậu thông qua các
lông hút và đôi khi thông qua vết thƣơng ở vỏ rễ. Mỗi loại cây họ đậu thƣờng
tiết ra xung quanh rễ những chất có tác dụng kích thích những chủng vi khuẩn
nốt sần chuyên tính và ức chế những chủng không chuyên tính để thực hiện
quá trình xâm nhiễm nhƣ các hợp chất gluxit, các axit amin, các axit hữu cơ
Muốn xâm nhiễm tốt, mật độ của vi khuẩn trong vùng rễ phải đạt khoảng 10
4
tế bào trong 1g đất. Nếu xử lí với hạt đậu thì mỗi hạt đậu loại nhỏ cần 500 –
1000 tế bào vi khuẩn, hạt to cần khoảng 70000 tế bào [14].
Nhiều nghiên cứu của một số tác giả cho rằng, vi khuẩn nốt sần có tính
chuyên tính rất cao đối với cây họ đậu cùng chi. Một số lại cho rằng chúng có
tính chuyên tính thấp đối với cây họ đậu cùng chi.
Sự hình thành, phát triển của nốt sần diễn ra qua một số công đoạn sau:
+ Giai đoạn trƣớc khi xâm nhiễm vào rễ: Các vi khuẩn Rhizobium hoặc
Bradyrhizobium đƣợc nhân lên trong vùng rễ nhờ các dịch tiết của rễ. Trong
rễ cây họ đậu có chứa lectin là một glycoprotein có tác dụng dẫn dụ các vi
khuẩn về phía lông hút của rễ.
+ Giai đoạn xâm nhiễm: Rhizobium xuyên sâu vào bên trong lông hút
làm dây xâm nhiễm phát triển, dây xâm nhiễm này đƣợc tạo thành từ màng tế
bào chất có chứa dịch nhầy đông đặc, tại đây các vi khuẩn tăng cƣờng hoạt
động của mình. Dây xâm nhiễm xuyên qua thành pectoxelluloza của tế bào
thực vật, nó lớn lên và phân chia ở bên trong vỏ rễ. 14
+ Sự xuất hiện của nốt sần: Khi Rhizobium đi vào trong rễ thì quá trình
hình thành nốt sần bắt đầu. Nốt sần lớn lên nhờ hoạt động của mô phân sinh
này. Tại đây ngƣời ta giả thiết rằng có sự chuyển DNA của tế bào vi khuẩn tế
bào cây chủ mà nó đƣợc xác định bởi một hoocmon.
độ: 24 – 26
o
C; độ ẩm: 50 – 70%. Có hình dạng thay đổi tuỳ theo từng giai
đoạn phát triển và điều kiện sống: khi còn non có hình que ngắn, bắt màu
đồng đều và có khả năng chuyển động nhờ tiêm mao; khi về già bất động, tế
bào có kích thƣớc lớn, chứa nhiều glycogen, volutin và lypoprotein gọi là thể
giả khuẩn. Thể giả khuẩn là trạng thái duy nhất có khả năng cố định nitơ của
vi khuẩn nốt sần, giai đoạn này trùng với giai đoạn ra hoa của thực vật, khi đó
cƣờng độ cố định nitơ của chúng là cực đại. Vi khuẩn nốt sần có tính chuyên
hoá cao, mỗi loài chỉ xâm nhiễm một nhóm cây họ đậu nhất định.
Ngay từ 1888, ngƣời ta đã phát hiện rằng vi khuẩn nốt sần cộng sinh
với cây trồng thuộc bộ đậu có thể cố định đƣợc nitơ trong khí quyển nhƣng
khi nó sống đơn độc trong đất lại không làm đƣợc điều đó. Quá trình khử N
thành NH
3
là do sự tham gia của nitrogenaza trong vi khuẩn, nitrogenaza tạo
thành từ 2 bản thể: Một bản thể có phân tử thấp và chứa Fe; một bản thể có
Copyright: Tài liệu đại học ©