Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Thái Nguyên - 2014
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ BÍCH NGỌC
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY VÚ BÒ
(FICUS SIMPLICISSIMA LOUR.) BẰNG
PHƢƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ THỰC VẬT

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC


Nguyễn Thị Bích Ngọc ii
LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự hƣớng
dẫn của PGS.TS Nguyễn Thị Tâm. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận
văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố.
Tác giả Nguyễn Thị Bích Ngọc


1.3.2. Cytokinin 13
1.4. Tình hình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô tế
bào thực vật ở trong nƣớc 14

iv
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1. Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 18
2.1.1. Vật liệu thực vật 18
2.1.2. Hoá chất, thiết bị 18
2.1.3. Địa điểm và thời gian nghiên cứu 18
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 18
2.2.1. Phƣơng pháp nuôi cấy in vitro 19
2.2.2. Đƣa cây ra môi trƣờng tự nhiên 21
2.2.3. Phƣơng pháp xử lí và tính toán số liệu 22
2.2.4. Điều kiện thí nghiệm 22
Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23
3.1. Kết quả nghiên cứu khử trùng hạt 23
3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng riêng rẽ của các chất kích thích sinh
trƣởng đến hiệu quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò trong ống
nghiệm 25
3.2.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của BAP đến hiệu quả nhân chồi và sự
sinh trƣởng của chồi Vú bò 26
3.2.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của kinetin đến hiệu quả nhân chồi và
sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 28
3.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP (kinetin) và NAA đến
hiệu quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 29
3.3.1. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa BAP và NAA đến hiệu quả
nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 29
3.3.2. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng kết hợp giữa kinetin và NAA đến hiệu
quả nhân chồi và sự sinh trƣởng của chồi Vú bò 31
vi
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

BA: 6-Benzyladenine
BAP: 6-Benzylaminopurine
CS: Cộng sự
CT: Công thức
DNA: Deoxyribonucleic acid
ĐC: Đối chứng
IAA: Indole-3-acetic acid
IBA: Indole-3-butyric acid
Kinetin: 6-furfurylaminopurine
LV: Litvay, 1985
MS: Murashige và Skoog, 1962
NAA: Naphthalene acetic acid
2,4-D: 2,4-Dichlorophenoxy acetic acid

35
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của giá thể đến tỉ lệ sống và sự sinh
trƣởng của cây Vú bò in vitro trong vƣờn ƣơm

37

viii
DANH MỤC CÁC HÌNH Trang

Hình 1.1. Cây và quả Vú bò

4
Hình 3.1. Ảnh hƣởng của thời gian khử trùng đến tỉ lệ nảy mầm
và sự phát triển của chồi mầm Vú bò

25
Hình 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ BAP đến hệ số nhân chồi và
sự sinh trƣởng của chồi Vú bò

27
Hình 3.3. Ảnh hƣởng của nồng độ kinetin đến hệ số nhân chồi


1. Đặt vấn đề
Nƣớc ta may mắn sở hữu nguồn tài nguyên cây thuốc khá dồi dào. Hiện
nay, có hàng ngàn loài cây thuốc gắn với những bài thuốc cổ truyền bản địa
đang đƣợc nhân dân khai thác phục vụ cho chữa trị các bệnh. Việc khai thác
quá mức và thiếu quan tâm đến bảo tồn là nguyên nhân chính khiến tài
nguyên cây thuốc ngày càng cạn kiệt, nhiều loài đứng trƣớc nguy cơ tuyệt
chủng [16].
Theo kết quả điều tra của Viện Dƣợc liệu, cả nƣớc ghi nhận gần bốn
nghìn loài cây thuốc, trong đó chỉ 10% là cây thuốc trồng, còn lại là cây thuốc
trong tự nhiên. Trƣớc tình hình suy giảm nhanh chóng nguồn cây thuốc, vấn
đề bảo tồn cây thuốc trở nên bức thiết. Để thực hiện đƣợc phƣơng châm lấy
dƣợc liệu làm nền tảng trong chiến lƣợc phát triển của ngành Y - Dƣợc, một
trong những trọng điểm của định hƣớng là đẩy mạnh công tác trồng trọt cây
thuốc trên quy mô lớn, phát triển nguồn dƣợc liệu hàng hoá phục vụ cho việc
điều trị trong nƣớc và xuất khẩu, mở ra cơ hội lớn cho việc giao thƣơng, tham
gia thị trƣờng quốc tế về dƣợc liệu và dƣợc phẩm có nguồn gốc tự nhiên [4].
Trong dân gian, một trong những cây thuốc đƣợc sử dụng chữa nhiều
bệnh ở ngƣời đó là cây Vú bò. Cây Vú bò đƣợc phân bố ở Trung Quốc, Ấn
Độ và Việt Nam, rải rác khắp các vùng núi thấp (dƣới 600m) đến trung du và
đồng bằng. Ở nƣớc ta, Vú bò là cây mọc hoang ở các vùng đồi núi [16].
Trong cây Vú bò có nhiều axit hữu cơ, axit amin, các chất triterpen,
alkaloid và coumarin. Bộ phận dùng làm thuốc ở cây Vú bò là rễ và vỏ rễ,
đƣợc dùng thay thế Hoàng kỳ nên có tên là Thổ hoàng kỳ. Theo Đông y, Vú
bò vị cay, ngọt, hơi ấm, có tác dụng kiện tỳ, bổ phế, hành khí lợi thấp, tráng

2
gân cốt, chữa phong thấp tê bại, ho do phế lao, ra mồ hôi trộm, chân tay mệt
mỏi vô lực, ăn ít bụng trƣớng, thủy thũng, viêm gan, bạch đới, phụ nữ sau
sinh không có sữa [20].

1.1. Giới thiệu chung về cây Vú bò
1.1.1. Đặc điểm phân loại và sinh học của cây Vú bò
Cây Vú bò có tên khoa học là Ficus simplicissima Lour., tên thƣờng
gọi: Vú bò sẻ, Vú chó, Vú lợn, Ngải phún, Sung ba thùy [1], [16].
Vú bò thuộc chi Đa đề (Ficus).
Họ Dâu tằm (Moraceae).
Bộ Hoa hồng (Rosales).
Lớp Hai lá mầm (Magnoliopsida).
Ngành Hạt kín (Magnoliophyta).
Giới Thực vật (Plantae) [34].
Vú bò thuộc dạng cây nhỏ, cao 1 - 2m. Thân Vú bò ít phân cành, phần
ngọn non có lông. Lá Vú bò mọc so le, thƣờng tập trung ở ngọn thân, hình
bầu dục, gốc tròn hoặc hơi hình tim, đầu thuôn nhọn, có 3 thùy, rộng 4 - 18
cm, mặt trên nháp, mặt dƣới có lông nhỏ, mép khía răng, gân gốc 3, cuống lá
có lông dày cứng, lá kèm hình ngọn giáo [2], [16].
Vú bò có cụm hoa mọc ở kẽ lá gồm hoa đực và hoa cái, hoa đực không
cuống, lá đài 4, hình dải, dính nhau ở gốc, nhị 2, hoa cái có cuống, lá đài 4,
thuôn tù, bầu hình trái xoan. Cành, lá, cuống lá, hoa đều có lông mịn màu
vàng mốc [16].
Quả Vú bò thuộc loại quả phức không cuống, có ít lông, có vị chát,
giòn, màu lục, khi chín thì mềm màu tím, có vị ngọt nhẹ, bên trong có nhiều
hạt (quả thực). Tháng 5 đến tháng 12 là mùa ra hoa kết quả của Vú bò. Toàn
cây Vú bò có nhựa mủ. Rễ Vú bò hình trụ, màu vàng, tƣơng đối thẳng [16].

4

(A) (B)
Hình 1.1. Cây (A) và quả (B) Vú bò
1.1.2. Một số thành phần có hoạt tính dƣợc học của cây Vú bò
Trong rễ cây Vú bò có chứa các axit hữu cơ, axit amin, các chất

Vị thuốc Vú bò đƣợc sử dụng trong một số đơn thuốc sau:
(1) Chữa phong thấp: Ngày dùng 15 - 20g dƣới dạng thuốc sắc hay
ngâm rƣợu. Mỗi lít rƣợu ngâm 100 - 200g rễ sao vàng, mỗi ngày uống 15 -
20ml rƣợu này.
(2) Chữa đau phong thấp: Rễ Vú bò 60g, móng giò lợn 250g, rƣợu 60g.
Thêm ít nƣớc, sắc còn nửa bát, chia làm 2 lần uống trong ngày cách nhau 4 - 6
giờ.
(3) Chữa ngã bị ứ huyết, ngực bụng đau nhức, hòn cục: Toàn cây Vú bò
giã nát, thêm rƣợu và ít muối, sao nóng đắp lên nơi đau.
(4) Chữa đau dạ dày, viêm tinh hoàn, lòi dom, sa tử cung: Vú bò 30g,
Tô mộc, Hồi đầu thảo, Ngƣu tất, Mộc thông mỗi vị 12 g. Sắc uống
(5) Chữa bế kinh, sau khi đẻ ứ huyết đau bụng: Rễ Vú bò 30 - 60g. Sắc
nƣớc rồi thêm ít rƣợu uống.
(6) Chữa thấp khớp mạn tính: Vú bò (sao vàng) 20g, Dây đau xƣơng
(sao vàng) 16g, rễ Sung (sao) 12g, củ Ráy tía (sao) 12g, rễ Gối hạc (sao vàng)

6
16g, Thiên niên kiện 12g, rễ Bạch hoa xà 8g. Sắc nƣớc, cho thêm ít rƣợu để
uống.
(7) Chữa ứ máu tím bầm do ngã hay bị thƣơng: Lá hay quả giã nát,
chƣng với rƣợu, đắp hay chƣờm.
(8) Sƣng đau tinh hoàn: Rễ Vú bò tƣơi 60 - 120g. Sắc uống.
(9) Bạch đới: Rễ Vú bò khô 60g. Sắc uống
(10) Ăn không ngon miệng, tiêu hoá kém, hay đầy bụng, hay bị phân
sống: Vú bò 20g, Mộc hƣơng 4g, Thảo quả 6g, Đậu khấu 6g. Sắc uống.
(11) Các chứng viêm gan mạn, xơ gan, phù do suy dinh dƣỡng: Vú bò
20g, Diệp hạ châu 16g, Nhân trần 12g, Rau má 16g. Sắc uống.
(12) Khử đờm giảm ho (viêm phế quản, ho có đờm): Vú bò 20g, Mạch
môn 12g, Diếp cá 20g, lá Táo 16g. Sắc uống.
(13) Lợi sữa: Vú bò 20g, Trạch tả 20g, Mộc thông 20g, Xuyên sơn giáp

thống.
(5) Nâng cao chất lƣợng cây giống: Nuôi cấy mô là một phƣơng pháp
hữu hiệu để loại trừ virut, nấm khuẩn khỏi các cây giống đã nhiễm bệnh. Cây
giống sạch bệnh tạo ra bằng cấy mô thƣờng tăng năng suất 15 - 30% so với
giống gốc.
(6) Khả năng tiếp thị sản phẩm tốt hơn và nhanh hơn: Các dạng sản
phẩm khác nhau có thể tạo ra từ hệ thống vi nhân giống nhƣ cây con in vitro
(trong ống nghiệm) hoặc trong bầu đất. Các cây giống có thể đƣợc bán ở dạng
cây, củ bi hay thân củ.
(7) Lợi thế về vận chuyển: Các cây con kích thƣớc nhỏ có thể vận
chuyển đi xa dễ dàng và thuận lợi, đồng thời cây con tạo ra trong điều kiện vô
trùng đƣợc xác nhận là sạch bệnh. Do vậy, bảo đảm an toàn, đáp ứng các quy
định về vệ sinh thực vật quốc tế.

8
(8) Sản xuất quanh năm: Quá trình sản xuất có thể tiến hành vào bất kì
thời gian nào, không phụ thuộc mùa vụ [31].
1.2.1.2. Các phƣơng thức nhân giống in vitro
* Nuôi cấy mô phân sinh (đỉnh sinh trưởng)
Khái niệm mô phân sinh chỉ đúng khi mẫu vật nuôi cấy đƣợc tách từ
đỉnh sinh trƣởng có kích thƣớc trong vòng 0,1mm tính từ chóp của tháp sinh
trƣởng. Trong thực tế thƣờng gặp khó khăn lớn trong việc nuôi thành công
các đỉnh sinh trƣởng riêng rẽ nhƣ vậy nên ngƣời ta chỉ áp dụng hình thức nuôi
cấy mô phân sinh với mục đích làm sạch virut cho cây trồng [3], [10].
Độ lớn của chồi (mô) nuôi cấy có mối tƣơng quan chặt chẽ với tỉ lệ
sống, khả năng cảm ứng và mức độ ổn định về mặt di truyền. Nếu độ lớn chồi
tăng thì tỉ lệ sống và tính ổn định tăng, nhƣng có thể làm giảm khả năng cảm
ứng của chồi/mô nuôi cấy và ngƣợc lại. Tuy nhiên, nếu xét về hiệu quả kinh
tế (thể tích bình nuôi, lƣợng dung dịch môi trƣờng dinh dƣỡng…): nếu độ lớn
tăng thì hiệu quả kinh tế giảm, nếu độ lớn giảm thì hiệu quả kinh tế tăng. Do

nhỏ hơn 1 thƣờng có khuynh hƣớng tạo chồi; nếu tỉ lệ này bằng 1 thì mô nuôi
cấy thƣờng phát sinh callus [10].
* Nhân giống in vitro thông qua giai đoạn mô sẹo (callus)
Nếu tái sinh cây hoàn chỉnh trực tiếp từ mẫu vật cấy ban đầu thì thu
đƣợc nhanh chóng các cây khá đồng nhất về mặt di truyền, tuy nhiên trong
nhiều trƣờng hợp mô nuôi cấy không tái sinh cây ngay mà phát triển thành
khối mô sẹo. Tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về
mặt di truyền, để tránh tình trạng đó cần sử dụng mô sẹo vừa phát sinh để thu
đƣợc cây tái sinh đồng nhất về di truyền. Thông thƣờng, ngƣời ta chỉ tiến
hành nhân giống qua giai đoạn mô sẹo đối với những đối tƣợng khó tái sinh
cây trực tiếp [30].
* Nhân giống thông qua phát sinh phôi vô tính - công nghệ hạt nhân tạo
Phôi vô tính là các cá thể nhân giống có cực tính bắt nguồn từ các tế
bào soma. Chúng rất giống phôi hữu tính ở hình thái, quá trình phát triển và

10
sinh lí, nhƣng do không phải là sản phẩm của quá trình thụ tinh giữa giao tử
đực và giao tử cái, vì vậy không có quá trình tái tổ hợp di truyền, do đó các
phôi vô tính có nội dung di truyền giống hệt với các tế bào soma đã sinh ra
chúng [10].
Khả năng tạo phôi vô tính trong nuôi cấy mô thực vật, ngoài các điều
kiện môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy, còn phụ thuộc rất lớn vào loài, vào các
giống, dòng trong cùng một loài. Khả năng này đã đƣợc chứng minh là do
một hoặc vài gene phụ trách. Vì vậy, bằng biện pháp lai tạo có thể chuyển khả
năng tạo phôi vô tính cao từ cây này qua cây khác [10].
Hạt nhân tạo là phôi vô tính bọc trong một lớp vỏ polymer nhƣ agar,
agarose, alginatc… Trong cấu trúc lƣới của lớp vỏ đó, nƣớc, chất dinh dƣỡng
đƣợc cung cấp thay cho nội nhũ, giúp cho phôi vô tính có thể nảy mầm trở
thành cây hoàn chỉnh [10].
1.2.2. Các giai đoạn trong quy trình nhân giống vô tính in vitro

Ngoài các chất cung cấp dinh dƣỡng cho mô nuôi cấy, việc bổ sung
một hoặc nhiều chất điều hòa sinh trƣởng nhƣ auxin, cytokinin và gibberellin
là rất cần thiết để kích thích sự sinh trƣởng, phát triển và phân hóa cơ quan.
Tuy vậy, yêu cầu đối với những chất này thay đổi tùy theo loài thực vật, loại
mô, hàm lƣợng chất điều hòa sinh trƣởng nội sinh của chúng. Các chất điều
hòa sinh trƣởng đƣợc sử dụng nhiều trong nuôi cấy mô thực vật thuộc nhóm
auxin và nhóm cytokinin [31].
1.3.1. Auxin
Bản chất hóa học của auxin tự nhiên trong tế bào thực vật là axit indol
axetic (IAA) và nó là dạng auxin đầu tiên, chủ yếu và quan trọng nhất trong
tất cả các loại thực vật. Trong thực vật nó không chỉ tồn tại ở dạng tự do mà
còn ở dạng liên kết không có hoạt tính sinh học nhƣ IAA-glucose, IAA-

12
myoinositol, IAA-glucan, IAA-aspartate…Các dẫn xuất khác của indol cũng
thể hiện hoạt tính của auxin là indol tryptamine, indol acetaldehyde, indol
pyruvate, indol ethanol [7].
Auxin đƣợc tổng hợp ở tất cả các thực vật bậc cao, tảo, nấm, vi khuẩn và
chủ yếu ở đỉnh chồi ngọn rồi di chuyển xuống các bộ phận non của cơ thể
thực vật nhƣ lá, rễ và các mô dự trữ…Auxin gồm có auxin tự nhiên và auxin
tổng hợp (IBA, NAA, 2,4-D…) [7].
Auxin có nhiều vai trò khác nhau trong đời sống thực vật, liên quan tới
hàng loạt các quá trình sinh lý: Kích thích phân chia và kéo dài tế bào, kích
thích sự mọc rễ ở cành giâm và kích thích sự phát sinh chồi phụ, auxin có các
ảnh hƣởng khác nhau đối với sự rụng lá, quả, sự đậu quả, sự phát triển và chín
của quả, sự ra hoa…Do hoocmon thực vật tác động lên sinh trƣởng thông qua
mối tƣơng quan nồng độ giữa các loại hoocmon khác nhau, nên các quá trình
trên đây không chỉ ảnh hƣởng của auxin mà còn của các hoocmon khác. Tùy
thuộc vào nồng độ tác dụng mà các mô thực vật có các kiểu phản ứng khác
nhau đối với auxin. Phản ứng chủ yếu và nhanh chóng nhất đối với xử lý

đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô để kéo dài chồi và phát sinh phôi với các
nồng độ khác nhau tùy theo đối tƣợng thực vật nuôi cấy và mục đích nuôi cấy
[7].
Cytokinin có mặt trong mọi thực vật, với hàm lƣợng cao nhất trong phôi
và trong quả đang phát triển. Hoạt tính của chúng đƣợc tăng cƣờng khi chúng
tƣơng tác với myo-inositol, nhƣng có thể bị mất khi kết hợp trong thành phần
của các glycoside [7].
Cũng nhƣ auxin, cytokinin tham gia điều hòa các phản ứng trong cây,
đồng thời làm tăng các quá trình trao đổi axit nucleic và protein. Cytokinin

14
điều chỉnh sinh trƣởng bằng nhiều cách nhƣ điều chỉnh tốc độ tổng hợp ADN
khi phân chia tế bào, làm chậm sự lão hóa của lá, góp phần phá vỡ trạng thái
ngủ của hạt, kích thích hạt nảy mầm, kích thích ra hoa và sinh trƣởng của quả,
gây nên sự hình thành chồi mầm trong nhiều mô, làm tăng diện tích phiến lá
do kích thích sự lớn lên của tế bào [31].
Trong môi trƣờng nuôi cấy mô, cytokinin cần cho sự phân chia tế bào,
tạo và nhân mô sẹo, phân hóa chồi từ mô sẹo hoặc từ các cơ quan, gây tạo
phôi vô tính, kích thích phát sinh chồi nách và kìm hãm ảnh hƣởng ƣu thế của
chồi đỉnh, tăng cƣờng phát sinh chồi phụ. Các loại cytokinin thƣờng đƣợc
dùng là: kinetin, BAP… Cytokinin hòa tan trong dung dịch HCl pha loãng
[31].
1.4. Tình hình nhân giống cây dƣợc liệu bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô
tế bào thực vật ở trong nƣớc
Ở Việt Nam, công nghệ nuôi cấy mô tế bào phục vụ nhân giống cây
trồng đã đƣợc triển khai trên 20 năm nay. Nhân giống thƣơng mại quy mô
lớn đã đạt đƣợc ở một số cây trồng nhƣ nhân nhanh giống chuối (khoảng 2
triệu cây/năm), nhân nhanh giống khoai tây sạch bệnh, nhân nhanh các giống
mía mới nhập nội năng suất cao, nhân nhanh các dòng bạch đàn chọn lọc và
keo lai đạt 3 triệu cây/năm. Công nghệ nhân giống cũng đƣợc áp dụng trên

tái sinh chồi in vitro cây Ba kích tím là MS bổ sung kinetin 0,25 mg/l, môi
trƣờng nhân chồi là MS bổ sung BAP 3,5 mg/l + IBA 0,2 mg/l, môi trƣờng
tạo rễ là MS bổ sung IBA 0,2 - 0,25 mg/l [27].
Vũ Thị Lan và cs (2011) đã đề xuất môi trƣờng thích hợp cho sự sinh
trƣởng mô sẹo cây Trinh nữ hoàng cung để thu sinh khối là: SB1 (MS + NAA
2,0 mg/l + BAP 0,5 mg/l) và SB2 (MS + NAA 2,0 mg/l + 1,0 mg/l BAP);
SK6 (MS + NAA 2,0 mg/l + kinetin 1,0 mg/l) và SK7 (MS + NAA 2,0 mg/l
+ kinetin 1,5 mg/l); SN9 (MS + NAA 2,0 mg/l + 10% nƣớc dừa) và SN10
(MS + NAA 2,0 mg/l + 20% nƣớc dừa) [9]. Cũng thông qua giai đoạn mô sẹo