BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
HOÀNG THỊ THẾ
NGHIÊN CỨU NHÂN GIỐNG CÂY BA KÍCH
(Morinda officianalis. How) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: TRỒNG TRỌT
Mã số : 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ PHƯƠNG THẢO
HÀ NỘI - 9/2012
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
i
cấy mô Trung tâm Khoa học và sản xuất lâm nông nghiệp Quảng Ninh cùng
các bè ñồng nghiệp - những người ñã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, ñộng viên
và ñóng góp ý kiến quý báu cho ñề tài này. Thiếu những sự ủng hộ ñó ñề tài
chắc chắn không thể ñạt ñược như hiện hữu. Với kinh nghiệm và năng lực của
bản thân, mặc dù ñã cố gắng hết mức, ñề tài chắc không thể tránh khỏi những
thiếu sót nhất ñịnh. Tác giả rất mong ñược sự chỉ bảo của các thầy cô giáo,
các bạn bè ñồng nghiệp và luôn coi ñó là sự tạo ñiều kiện, cơ hội ñể tác giả
tiếp thu, học hỏi. Xin chân thành cảm ơn!
Hà Nội, ngày 25 tháng 9 năm 2012
Tác giả luận văn Hoàng Thị Thế Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
iii
MỤC LỤC
Lời cam ñoan i
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các từ viết tắt vi
Danh mục các bảng vii
danh mục các hình ix
1 MỞ ðẦU 1
1 ðặt vấn ñề 1
2 Mục ñích, yêu cầu 3
4.2 Giai ñoạn tái sinh chồi 38
4.2.1 Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + BAP ñến khả năng tái sinh chồi từ
mẫu cấy. 38
4.3 Giai ñoạn nhân nhanh 40
4.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của KIN ñến khả năng nhân nhanh và
chất lượng chồi. 40
4.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của BAP ñến khả năng nhân nhanh và
chất lượng chồi. 41
4.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp KIN và IBA ñến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi. 44
4.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp KIN và NAA ñến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi. 45
4.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và IBA ñến khả năng
nhân nhanh và chất lượng chồi. 46
4.3.6 Nghiên cứu ảnh hưởng của tổ hợp BAP và α -NAA ñến khả năng
nhân nhanh chồi 47
4.3.7 Nghiên cứu ảnh hưởng của axit ascorbic ñến chất lượng chồi. 49
4.3.8 Nghiên cứu ảnh hưởng riboflavin (vitamin B2) ñến chất lượng
chồi. 51
4.4 Giai ñoạn tạo cây hoàn chỉnh. 52
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
v
4.4.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA tới khả năng ra rễ 53
4.4.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của IBA ñến khả năng ra rễ của chồi 55
4.4.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính ñến chất lượng bộ rễ. 58
4.5 Giai ñoạn sau in vitro 60
4.5.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của tuổi cây mầm ra ngôi ñến tỷ lệ sống
của cây con ngoài vườn ươm. 60
vii
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Tên bảng Trang
4.1 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong HgCl
2
0,1% ñến khả
năng khử trùng mẫu cấy 35
4.2 Ảnh hưởng của thời gian khử trùng trong Ca(HClO)
2
10% ñến
khả năng khử trùng mẫu cấy 36
4.3 Ảnh hưởng của phương pháp khử trùng kép (kết hợp giữa HgCl
2
0,1% và Ca(HClO)
2
10%) ñến khả năng khử trùng mẫu cấy . 37
4.4 Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + BAP ñến khả năng tái sinh chồi từ
mẫu cấy 39
4.5 Ảnh hưởng của KIN ñến khả năng nhân nhanh và chất lượng
chồi 41
4.6 Ảnh hưởng của BAP ñến hệ số nhân chồi 42
4.7 Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + IBA ñến khả năng nhân nhanh và
chất lượng chồi. 44
4.8 Ảnh hưởng của tổ hợp KIN + NAA ñến hệ số nhân nhanh và
chất lượng chồi. 45
4.9 Ảnh hưởng của tổ hợp BAP + IBA ñến hệ số nhân nhanh và
4.1 Chồi ba kích tái sinh từ mẫu cấy trên môi trường MS + 0,25 mg/l
KIN +1,0 mg/l BAP sau 30 ngày 39
4.2 Cụm chồi ba kích trên môi trường MS + 3,0 mg/l BAP sau 45 ngày 43
4.3 Chồi trên môi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA sau 45
ngày nuôi cấy 47
4.4 Chồi ba kích trên môi trường MS + 3,0 mg/l BAP + 0,4 mg/l IBA
+ 10,0 mg/l riboflavin sau 45 ngày. 51
4.5 Rễ ba kích trên môi trường 1/2MS + 0,4 mg/l α-NAA sau 30
ngày cấy 55
4.6 Rễ ba kích trên môi trường 1/2MS + 0,2 mg/l IBA sau 30 ngày cấy 57
4.7 Rễ ba kích trên môi trường ½ MS + 0,2 mg/l IBA + 0,4 g/l than
hoạt tính sau 30 ngày cấy 59
4.8 Cây ba kích in vitro (35 ngày tuổi) ra ngôi 61 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
1
1. MỞ ðẦU
1. ðặt vấn ñề
Hiện nay cùng với sự phát triển của xã hội, ñời sống của con người ñược
nâng cao, nhu cầu của con người về nguồn dược liệu theo ñó cũng ngày càng
tăng. Nguồn dược liệu con người ñang sử dụng có thể ñược tổng hợp bằng nhiều
con ñường khác nhau như tổng hợp hóa học, tổng hợp từ sinh vật, song nguồn
dược liệu từ thực vật ñã ñược con người sử dụng từ lâu và nhu cầu ngày càng
lớn. Tuy nhiên các loài dược liệu trong tự nhiên ñang bị giảm về số lượng và
chất lượng bởi sự khai thác quá mức, các ñiều kiện ngày càng bất lợi của môi
ngày một gia tăng tại các tỉnh phía Bắc do giá trị kinh tế thu ñược hơn hẳn
trồng lúa, ngô, khoai, sắn [6], nên nhu cầu về giống ñặc biệt là cây giống chất
lượng cao ngày càng tăng. Tuy nhiên, việc nhân giống cung cấp cho nhu cầu
sản xuất hiện nay còn gặp nhiều bất cập.
Nguồn cung cấp cây giống hiện nay chủ yếu bằng phương pháp giâm
hom. Việc nhân giống ba kích bằng phương pháp này tuy có ưu ñiểm là kỹ
thuật tương ñối ñơn giản, không ñòi hỏi máy móc thiết bị hiện ñại, dễ áp dụng
nhưng cũng có nhiều nhược ñiểm như: hệ số nhân giống thấp chỉ ñạt 0,6
lần/năm [6], ñòi hỏi nguồn vật liệu cung cấp hom giâm thường xuyên và rất
lớn, cây giống sản xuất ra không hoàn toàn sạch bệnh, sản xuất phụ thuộc vào
mùa vụ, chất lượng cây giống không ñược ñảm bảo, vì vậy chưa ñáp ứng ñủ
nhu cầu cây giống hiện nay.
Kỹ thuật nuôi cấy mô là một trong số các kỹ thuật nhân giống cây
trồng vô tính. ðây là một kỹ thuật cao, có nhiều ưu ñiểm như: hệ số nhân
giống cao, cây giống giữ nguyên ñược các ñặc tính của cây mẹ, ñồng ñều,
sạch bệnh, sức sống cao khi ñưa ra trồng trên ñất, mang lại hiệu quả kinh tế
cao, nên hiện nay ñang ñược ứng dụng vào sản xuất thành công trên nhiều
loại cây trồng ñặc biệt là cây lâm nghiệp, nông nghiệp. Kỹ thuật này giúp tạo
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
3
ñược số lượng lớn cây giống với phẩm chất tốt, giá thành hạ [12].
Xuất phát từ những cơ sở trên, với mong muốn góp phần bảo vệ, phát
triển cây ba kích - cây dược liệu quý, tiến tới cung cấp cho người dân nguồn
giống chất lượng cao và ổn ñịnh, tôi tiến hành ñề tài:
"Nghiên cứu nhân giống cây ba kích (Morinda officianalis. How) bằng
phương pháp nuôi cấy mô"
2. Mục ñích, yêu cầu
2.1. Mục ñích
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
5
2. TỔNG QUAN VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU
2.1. Giới thiệu về cây Ba kích.
Tên khoa học: Morinda officinalis. How
Tên khác: Cây ruột gà, chẩu phóng xì (Quảng Ninh), sáy cáy (Thái),
thau tày cáy (Tày), chày kavằng dòi (Dao).
2.1.1. Phân loại thực vật học [2].
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa môi (Lamiidae)
Bộ: Long ñởm (Gentianales)
Họ: Cà phê (Rubiaceae)
Chi: Nhàu (Morinda)
Loài: Morinda officinalis. How
Tên thường gọi: Ba kích
2.1.2. ðặc ñiểm sinh vật học, sinh thái học [2].
2.1.2.1. Phân bố ñịa lý
+ Thế giới:
Ba kích có phân bố tự nhiên ở Lào, Trung Quốc và Việt Nam.
+ Việt Nam:
Ba kích mọc hoang, phân bố nhiều ở vùng ñồi núi thấp của miền núi và
trung du ở các tỉnh phía Bắc. Ba kích có nhiều ở Quảng Ninh, Bắc Giang,
Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Tuyên Quang, Thái Nguyên, Cao Bằng, Lạng Sơn, Yên
Bái, Hà Giang, Hà Tây, Hòa Bình. Gần ñây thấy ở Tây Giang - Quảng Nam.
2.1.2.2.ðặc ñiểm hình thái
+ Thân: cây thân thảo, leo bằng thân, quấn vào cành cây khác hoặc giàn
- Thích hợp vùng nhiệt ñới nóng ẩm có 2 mùa mưa và khô rõ rệt, nhiệt
ñộ không khí mùa khô từ 8 - 24
0
C và mùa mưa từ 25 - 38
0
C. Lượng mưa năm
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
7
từ 1100 - 2000 mm.
- Ưa ñất ẩm mát, thành phần cơ giới trung bình, tầng dày trên 1 m,
nhiều mùn, tơi xốp, không chịu ñược ñất bị úng.
- Khi còn nhỏ cây chịu bóng, thích hợp ñộ tàn che 0,4 - 0,5, ở nơi ñất
trống cần trồng cây che phủ
Trong tự nhiên có 2 loại: Ba kích tím có lõi củ màu tím. Ba kích trắng
có lá bầu hơn, lõi củ thường có củ màu vàng ñến hồng vàng. người sử dụng
thường ưa chuộng ba kích tím hơn ba kích trắng.
2.1.3. Công dụng của ba kích
Củ ba kích là loại dược liệu quý dùng trong y học cổ truyền.
+ Tăng sức dẻo dai: Trên thực nghiệm, khi dùng ba kích với liều 5-
10g/kg thể trọng dùng liên tiếp 7 ngày thấy có tác dụng tăng sức dẻo dai cho
súc vật thí nghiệm.
+ Tăng sức ñề kháng: Ba kích có tác dụng tăng cường sức ñề kháng của
cơ thể ñối với các yếu tố ñộc hại.
ðối với người già hoặc những bệnh nhân biểu hiện mệt mỏi, ăn kém,
ngủ ít, gầy yếu mà không thấy có những yếu tố bệnh lý gây nên và một số
trường hợp có ñau mỏi các khớp, ba kích có tác dụng tăng lực rõ rệt thể hiện
qua những cảm giác chủ quan như giảm mệt mỏi, ăn ngon, ngủ ngon và những
dấu hiệu khách quan như tăng cân nặng, tăng cơ lực. ðối với bệnh nhân ñau
2.2.1. Tình hình phát triển nguồn dược liệu
Nằm trong vùng khí hậu nhiệt ñới gió mùa nóng ẩm nên Việt Nam có
nguồn tài nguyên thực vật phong phú và ña dạng với khoảng 10.350 loài thực
vật bậc cao, 800 loài rêu, 600 loài nấm và hơn 2000 loài tảo. Kết quả ñiều tra
trong cả nước ñã ghi nhận ñược 3.948 loài thực vật và nấm lớn có thể sử dụng
làm thuốc, trong ñó có hàng chục loại có giá trị chữa bệnh cao. Tổng sản
lượng dược liệu ở Việt Nam hằng năm ước tính khoảng từ ba ñến năm nghìn
tấn. Một số dược liệu quý ñược thế giới công nhận và có tiềm năng phát triển
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
9
rất lớn như: hồi, trinh nữ hoàng cung, quế, ac-ti-sô, sâm ngọc linh, tràm, thanh
hao hoa vàng, hoa hòe, ba kích [36].
Tuy nhiên, thực tế cho thấy ñến nay các vùng phân bố tự nhiên của cây
thuốc bị suy giảm nghiêm trọng do khai thác một cách cạn kiệt. Nhiều vùng
rừng có cây thuốc phong phú nay ñã hoàn toàn bị phá bỏ, như khu vực núi
Hàm Rồng - Sa Pa, Lào Cai, cao nguyên An Khê thuộc hai tỉnh Gia Lai và
Bình Ðịnh, nhiều loại có nguy cơ tuyệt chủng, có 144 loài cây thuốc thuộc
diện quý hiếm cần ñược bảo tồn: sâm ngọc linh, tam thất, ba kích, bách hợp
[36].Thực tế, nhiều ñịa phương có ñầy ñủ các ñiều kiện ñể trồng trọt dược liệu
có giá trị cao, nhưng do cách làm manh mún, tự phát, thiếu liên kết và thị
trường dược liệu không ổn ñịnh nên việc phát triển các vùng dược liệu hiện
nay gặp nhiều khó khăn. Chính sách bảo tồn nguồn gen, nhất là các cây quý
còn quá ít. Từ một nước xuất khẩu, Việt Nam trở thành một nước nhập khẩu
dược liệu ñể phục vụ thị trường trong nước. Mở rộng diện tích trồng cây
thuốc là con ñường tất yếu bảo ñảm cung cấp ñủ dược liệu cho công nghiệp
dược trong nước và xuất khẩu.
Một khó khăn cơ bản cho các ñơn vị sản xuất ñược liệu hiện nay là
nguồn nguyên liệu ñầu vào cho nhà máy không ổn ñịnh, không có khả năng
phẩm có giá trị, thị trường tiêu thụ không chỉ trong nước mà còn ñược xuất
khẩu. Ở nước ta ba kích ñược sử dụng chủ yếu trực tiếp như ngâm rượu, sắc
nước uống. Sản phẩm rượu ngâm củ ba kích ñược coi là ñặc sản của tỉnh
Quảng Ninh [13], giá 1 kg củ ba kích tươi hiện nay giao ñộng từ 200.000 ñến
250.000 ñồng.
ðịnh hướng phát triển ngành nông lâm nghiệp nước ta là chuyển ñổi
dần diện tích cây có giá trị kinh tế cao thay thế cây kém hiệu quả. Ba kích
ñang là một trong những ñối tượng ñược lựa chọn ñể mở rộng diện tích trồng
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
11
ở các tỉnh miền núi phía Bắc trong những năm tới [13]. Vấn ñề quy hoạch
vùng trồng và ñáp ứng nguồn giống có nguồn gốc, chất lượng hiện nay là việc
làm mang ý nghĩa khoa học và thực tiễn lớn.
2.3. Kỹ thuật nuôi cấy mô - tế bào.
Nhân giống bằng nuôi cấy mô (propagation by tisue culture), hoặc vi
nhân giống (micropropagation) là tên gọi chung cho các phương pháp nuôi
cấy in vitro cho các bộ phận nhỏ ñược tách khỏi cây [19] ñang ñược dùng phổ
biến ñể nhân giống thực vật, trong ñó có cây lâm nghiệp. Các bộ phận ñược
dùng ñể nuôi cấy có thể là chồi ñỉnh, chồi bên, chồi bất ñịnh, bao phấn, phấn
hoa, phôi và các bộ phận khác như vỏ cây, lá non, thân mầm (hypocotyl) v.v.
Song nuôi cấy mô cho chồi bên và chồi bất ñịnh là những phương pháp chính
ñược dùng trong nhân giống cây rừng [12].
Ưu ñiểm chính của nuôi cấy mô là cây mô ñược trẻ hoá cao ñộ và có rễ
giống như cây mọc từ hạt, thậm chí không có sự khác biệt ñáng kể so với cây
mọc từ hạt. Một ưu ñiểm khác của nhân giống bằng nuôi cấy mô là có hệ số
nhân cao hơn nhân giống hom, từ một cụm chồi sau một năm nuôi cấy mô
liên tục có thể sản xuất hàng triệu cây con. Hơn nữa, nuôi cấy mô cũng là một
trong những biện pháp làm sạch bệnh. Vì thế mặc dầu nuôi cấy mô ñòi hỏi kỹ
thuật phức tạp, giá thành cao, song vẫn ñược nhiều nơi áp dụng, ñặc biệt là
2.3.2. Các bước tiến hành của phương pháp nuôi cấy mô -tế bào thực vật
2.3.2.1.Giai ñoạn chuẩn bị
ðây là bước ñầu tiên của quy trình nhân giống. Giai ñoạn này gồm các
khâu như: chọn lọc cây mẹ ñể lấy mẫu, chọn cơ quan ñể lấy mẫu. Mô chọn ñể
nuôi cấy thường là các mô có khả năng tái sinh cao trong ống nghiệm, sạch
bệnh, giữ ñược các ñặc tính quý của cây mẹ. Sau ñó chọn chế ñộ khử trùng
thích hợp làm sao ñể mẫu cấy bị nhiễm là thấp nhất, ñồng thời khả năng sinh
trưởng và phát triển vẫn tốt. Phương pháp vô trùng mẫu cấy phổ biến hiện nay
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
13
là dùng các tác nhân hoá học có tính sát trùng mạnh như cồn 70%, HgCl
2
,
NaOCl, Ca(ClO
3
)
2
, H
2
O
2
, ñể khử trùng mẫu. Nồng ñộ chất khử trùng ñược
chọn trên cơ sở thực tiễn thí nghiệm, theo nguyên tắc mô non nồng ñộ thấp,
mô già nồng ñộ cao, có nhiều trường hợp phải phối hợp hai hay nhiều chất
khử trùng với nhau. Cũng có thể bổ sung các chất kháng nấm và vi khuẩn vào
môi trường nhằm tăng hiệu quả khử trùng. Thời gian khử trùng ñược xác ñịnh
bằng thực nghiệm ñối với từng loài cây hoặc mô nuôi cấy. Nhìn chung, mô
non khử trùng trong thời gian ngắn, mô già trong thời gian dài hơn.
2.3.2.2. Giai ñoạn nuôi cấy khởi ñộng
biệt, do ñó ở giai ñoạn này cần chủ ñộng ñể ñiều khiển ñược quá trình chiếu
sáng, dinh dưỡng và giữ nước cũng như lựa chọn các giá thể thích hợp và
trong ñiều kiện cách ly bệnh ñể các cây con ñạt tỷ lệ sống cao.
2.3.3. Các nhân tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy mô [19].
Các nhân tố ảnh hưởng ñến quá trình nuôi cấy mô bao gồm: Nền môi
trường nuôi cấy, mẫu cấy, thời tiết, mùa vụ, kiểu gen của cây, chế ñộ nhiệt,
chế ñộ chiếu sáng, số lần cấy chuyển, thể khí trong bình, cực tính của cây
Trong ñó, nền môi trường nuôi cấy là ñiều kiện tối cần thiết, là yếu tố
quyết ñịnh cho sự phân hóa tế bào và cơ quan nuôi cấy. ðồng thời, ñây cũng
là giá ñỡ ñể cố ñịnh cây và là nguồn cung cấp chất dinh dưỡng ñể cho cây
phát triển. Do vậy, sự sinh trưởng, phát triển của cây nuôi cấy mô phụ thuộc
mạnh mẽ vào thành phần của môi trường nuôi cấy. Nền nuôi cấy bao gồm 8
yếu tố, ñó là:
- Các nguyên tố ña lượng;
- Các nguyên tố vi lượng;
- Các vitamin;
- Các chất ñiều hoà sinh trưởng;
- Nguồn các bon hữu cơ;
- Các chất phụ gia;
- Chất ñông cứng môi trường;
- pH môi trường; Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ……………………
15
Một trong 8 nhân tố này thay ñổi sẽ kéo theo sự thay ñổi trong quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây invitro [27].
2.3.3.1. Các nguyên tố ña lượng
Sáu nguyên tố ña lượng N, P, K, S, Mg, Ca là cần thiết và thay ñổi theo
- Phốt pho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy có nhu cầu phốt pho rất
cao. Nó không chỉ là một trong những thành phần cấu trúc của phân tử axit
nucleic mà khi phospho ở dạng H
2
PO
4
và HPO
4
còn có tác dụng như một
hệ thống ñệm làm ổn ñịnh pH của môi trường trong quá trình nuôi cấy.
2.3.3.2. Các nguyên tố vi lượng
Fe, Cu, Zn, Mn, Bo, I, Co là các nguyên tố vi lượng thường ñược dùng
trong môi trường nuôi cấy invitro. Nó ñóng vai trò quan trọng trong các
hoạt ñộng của enzym. Chúng ñược dùng với nồng ñộ thấp hơn nhiều so với
các nguyên tố ña lượng (<30mg/l). Riêng sắt sử dụng ở dạng phức: Fe-
NaEDTA.
Copyright: Tài liệu đại học ©