Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
**************************

NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ MANGOSTEEN “ HỖN HỢP
CÁC XANTHON” CỦA VỎ QUẢ MĂNG CỤT VÀ THỬ TÁC
DỤNG KHÁNG VI KHUẨN CỦA MANGOSTEEN HƯỚNG DẪN: PGS.TS. HÀ HUY KẾ
TS. PHAN QUỐC KINH
NGƯỜI THỰC HIỆN: LÊ THỊ THANH THANH
CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT
KHÓA: 14
LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC

Hà Nội – 2012
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên


Phyma, Kingphar Codanbe, …
Từ trước tới nay ở Việt Nam đã có nhiều công trình công bố về
nghiên cứu chiết xuất xác định các xanthon từ vỏ quả măng cụt như các
nhóm tác giả: Đào Hùng Cường, Đỗ Thuý Vân (2010), nghiên cứu chiết tách
và xác định xanthon [2]; Hà Diệu Ly và cộng sự (2009), cô lập xanthon có
hoạt tính kháng khuẩn [5]; Nguyễn Văn Đậu (2009), phân lập 6 xanthon từ
vỏ quả măng cụt [8]; Đỗ Thị Tuyên và cộng sự (2012), nghiên cứu quy trình
tách chiết α-mangostin từ vỏ quả măng cụt quy mô phòng thí nghiệm [4];
Nguyễn Thị Mai Phương và cộng sự (2003), tác dụng của dịch chiết vỏ quả
măng cụt (Garcinia mangostana L.) lên vi khuẩn sâu răng Streptococcus
mutans” [7], … Tuy nhiên các nghiên cứu này chủ yếu là các nghiên cứu
trong phòng thí nghiệm, chưa thấy có tài liệu nào ở Việt Nam công bố về
nghiên cứu chiết xuất mangosteen (có chứa các xanthon) ở quy mô công
nghiệp, để phục vụ cho việc sản xuất các thực phẩm chức năng, trong hoàn
cảnh trang thiết bị chiết xuất ở các nhà máy của Việt Nam vẫn đang ở quy
mô thủ công, chưa được hiện đại hoá. Luận văn này nhằm góp phần nghiên
cứu quy trình sản xuất mangosteen “hỗn hợp các xanthon” dựa vào các dung
môi có sẵn ở Việt Nam, rẻ tiền và không dễ cháy nổ. Quy trình chiết xuất
bằng ngâm kiệt, an toàn hơn quy trình chiết xuất bằng các dung môi hữu cơ
dễ cháy khi gia nhiệt và giá thành các dung môi hữu cơ này rất đắt. Luận văn
này chủ yếu tập trung nghiên cứu phương pháp chiết xuất bằng soxhlet để
nghiên cứu hàm lượng mangosteen có trong vỏ quả măng cụt và chiết tách
xác định các xanthon chính có trong mangosteen và thử hoạt tính kháng sinh
với vi khuẩn thường gặp ở Việt Nam là Staphylococus aureus. Trên cơ sở đó
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

sẽ sử dụng phương pháp ngâm kiệt chiết bằng ethanol 95
o
, để có thể sản xuất
mangosteen ở Việt Nam với giá thành rẻ và với quy trình tương đối an toàn.

các mẫu cây cỏ và sống tại Ấn Độ vào thế kỷ 18, “mangostana” và tên tiếng
Anh là mangosteen đều xuất phát từ tên Mã lai là “mangustan”.
1.1.1.1. Nguồn gốc và phân bố
Cây măng cụt có nguồn gốc từ Mã Lai và Indonesia, được trồng từ
hàng chục thế kỷ. Ngày nay bắt gặp khắp Đông Nam Á, Ấn Độ, Myanma
cũng như ở Sri Lanka, Philippine, được các nhà truyền giáo đạo Gia tô di
thực vào miền Nam Việt Nam, như ở các tỉnh Tây Ninh, Gia Định. Hiện nay
măng cụt chủ yếu được trồng ở vùng đồng bằng sông Cửu Long (Cần Thơ,
Đồng Tháp, Vĩnh Long, Tiền Giang, Kiên Giang, Bình Dương, Cà Mau, Trà
Vinh, …) với tổng diện tích lên tới gần 5000 ha, cho sản lượng khoảng 4500
tấn/năm. Theo dự án phát triển sản xuất và xuất khẩu rau, hoa quả tươi của
Việt Nam, dự kiến phát triển diện tích trồng măng cụt ở vùng đồng bằng
sông Cửu Long lên khoảng 11300 ha, cho sản lượng 24000 tấn/năm. Cây
măng cụt đòi hỏi điều kiện thổ nhưỡng khắc khe, khí hậu nóng và ẩm, vì vậy
cây măng cụt chủ yếu được trồng nhiều ở miền Nam Việt Nam, không tiến
xa ra vùng khí hậu lạnh ở miền Bắc mà chỉ dừng lại ở Huế [3].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên
Hình 1. Vùng trồng nhiều măng cụt ở Việt Nam
1.1.1.2. Đặc điểm thực vật
Măng cụt là loại cây to, cao trung bình 7 – 12m, nhưng cũng có thể
cao đến 20 – 25m. Thân có vỏ màu nâu đen sậm, có nhựa màu vàng. Lá dày,
dai và cứng, bóng, mọc đối, màu lục sẫm, mặt trên của lá có màu sậm hơn
mặt dưới, hình thuôn dài 15 – 25cm, rộng 6 – 11cm, cuống dài 1 – 2cm. Hoa
đa tính thường là hoa cái và hoa lưỡng tính. Hoa mọc đơn hay từng đôi. Quả
hình cầu tròn, đường kính khoảng 4 – 7cm, vỏ quả màu đỏ tím, dày và xốp,
trong đỏ tươi như rượu vang, phía dưới có lá đài, phía đỉnh có đầu nhuỵ.
Quả chứa 5 – 8 hạt, quanh hạt có lớp áo bọc màu trắng, ăn ngọt, thơm ngon.

nhiều thành phần dinh dưỡng khác (Bảng 1) [25].
Bảng 1. Thành phần dinh dưỡng trong thịt quả măng cụt

Các thành phần
Hàm lƣợng
Fructose
2,4%
Sucrose
10,0%
Glucose
2,2%
Maltose
0,1%
Lactose
< 0,1%
pH
3,52
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Độ ẩm
80,69%
Protein
0,50%
Chất xơ
1,35%
Vitamin B
2

< 0,08 mg/100 g
Vitamin B

1.1.2.1. Cấu trúc
Nhân xanthon có tính đối xứng, được đánh số theo quy ước quốc tế
(danh pháp IUPAC). Nguyên tử C1 – C4 được đánh từ vòng bên phải và
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

nguyên tử C5 – C8 đánh ở vòng bên trái. Hệ thống đánh số được dựa trên
khung cơ bản xanthen-9 [10]. Các xanthon được phân loại thành 5 nhóm
chính: xanthon oxy hoá đơn giản, xanthon glycosid, prenyl xanthon,
xanthonolignoid và các loại khác [28].
Khung xanthon có cấu trúc tương tự khung acridon, alkakoid có nhiều
trong họ cam (Rutaceae), nhưng chúng khác nhau ở chỗ nguyên tử nitơ
trong nhân acridon được thay thế bằng nguyên tử oxy. Các acridon cũng có
màu vàng như xanthon.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.2.2. Tính chất lý hóa của α-mangostin, β- mangostin, γ-mangostin
Xanthon trong vỏ quả măng cụt được nghiên cứu nhiều là α-
mangostin, β-mangostin, γ-mangostin và gartanin:
* α-mangostin [11], [43]:
Tên khoa học: 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-bis-(3-methyl-2-
butenyl)-9H-xanthen-9-one; 1,3,6-trihydroxy-7-methoxy-2,8-di(3-methyl-2-
butenyl) xanthon.
CTPT: C
24
H
26
O
6


dung môi hữu cơ (alcol, ether, aceton …), không tan trong nước [3], [43].
Trong phân tử các xanthon có một tới nhiều nhóm – OH nên khi chuyển
sang môi trường kiềm phổ hấp phụ tử ngoại ở vùng 318 – 321nm được
chuyển dịch đến vùng 365 – 370nm (bathochrom).
Các xanthon có nhóm – OH tự do cũng dễ dàng bị methyl hoá bởi
dimethyl sunfat như γ-mangostin được methyl hoá thành β-mangostin, mặt
khác γ-mangostin cũng có thể điều chế được bằng phản ứng demethyl hoá α-
mangostin sử dụng piperidin làm xúc tác [24].
1.1.3. Tác dụng và công dụng của măng cụt và xanthon.
1.1.3.1. Theo y học cổ truyền
Quả măng cụt ngoài tính chất thơm ngon, nó còn được dùng nhiều để
làm thuốc. Từ lâu, ở Ấn Độ, măng cụt được kê vào nhiều thang thuốc cổ
truyền, đặc biệt chống viêm, chữa tiêu chảy, ức chế dị ứng, làm giản phế
quản trong bệnh hen suyễn [9]. Ngoài ra quả măng cụt còn xem như là
những thuốc chống dịch tả, bệnh lỵ, kháng vi khuẩn, kháng vi sinh vật,
chống suy giảm miễn dịch. Người Thái Lan dùng nó để chữa vết thương
ngoài da [35]. Người Mã Lai dùng nước sắc từ vỏ quả măng cụt chữa lỵ, đau
bụng, tiêu chảy, bệnh vàng da. Ở Việt Nam theo Đông y, vỏ quả măng cụt
có vị chua chát, có tính bình, đi vào hai kinh phế và đại tràng, có công năng
thu liễm, sáp trường, chỉ huyết, dùng trị tiêu chảy, ngộ độc thức ăn [1]. Hiện
nay ở Việt Nam, Bộ Y tế đã cho phép sử dụng hoạt chất xanthon được chiết
từ vỏ quả măng cụt vào sản xuất thuốc chữa bệnh tiêu chảy, bệnh lỵ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.1.3.2. Theo y học hiện đại
Ngày nay, nền y học hiện đại đã có nhiều khám phá mới về công dụng
của măng cụt và cũng như của các xanthon, sau đây là một số công dụng
chính:

+ Moongkarndi và cộng sự (2004) - Bộ môn vi sinh vật của Đại học Mahidol
Bangkok, Thái Lan thử tính chống tăng sinh của 9 dược liệu ở dòng tế bào
ung thư tuyến vú bằng dịch chiết ethanol cho thấy măng cụt có tiềm năng rất
lớn về chống ung thư [32].
+ Sato và cộng sự (2004) - Bộ môn sinh học phân tử Đại học Tohoku, Nhật
Bản nghiên cứu tác dụng làm tế bào tự huỷ (apoptosis) của 8 xanthon trên u
tế bào ưa crôm (pheochromocytoma) ở chuột lớn. Trong số những xanthon
này, α-mangostin chiết từ vỏ măng cụt, có tác dụng mạnh nhất với EC50 =
4µM. α-mangostin tác dụng trên đường gây tự huỷ của ty lạp thể
(mitochondrial apoptotic pathway) và ức chế Ca
2+
- ATPase đáng kể [38].
+ Moongkarndi và cộng sự (2004) - Bộ môn vi sinh của Đại học Mahidol
Bangkok, Thái Lan cũng chứng minh dịch chiết thô methanol của vỏ quả
măng cụt có tác dụng trên dòng tế bào ung thư vú [31].
+ Mandal và cộng sự (1992) - Viện kỹ thuật sinh học quốc tế Gifu, Nhật Bản
nghiên cứu tác dụng của 6 xanthon từ vỏ quả măng cụt lên sự tăng trưởng tế
bào của dòng tế bào ung thư bạch cầu HL60 ở người, α-mangostin ức chế
hoàn toàn ở nồng độ 10µM bằng cách cảm ứng tế bào tự huỷ [28].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

+ Ho và cộng sự (2002) - Bộ môn nghiên cứu giáo dục bệnh viện cựu chiến
binh Đài Bắc, Đài Loan, chiết và làm tinh khiết 6 xanthon từ vỏ quả măng
cụt dùng sắc ký từng phần rồi thử tính độc hại tế bào qua 14 dòng tế bào ung
thư người, kể cả 6 dòng tế bào ung thư gan. Kết quả cho thấy garcinon-E có
tính diệt tế bào ung thư người mạnh nhất cũng như tế bào ung thư dạ dày và
phổi [22].
Tuy nhiên tất cả các nghiên cứu trên đều thực hiện trong ống nghiệm,
chưa có nghiên cứu nào thử lâm sàng để có thể chứng minh măng cụt chữa
được bệnh ung thư trên người.

C, ethanol
95
o
là dung môi hoà tan xanthon tốt, rẻ tiền, dễ kiếm, ít độc hại. Hơn nữa khi
chiết với số lượng lớn xanthon từ vỏ quả măng cụt để đưa vào sản xuất thì
dùng ethanol 95
o
sẽ thiết thực và mang lại hiệu quả kinh tế cao.
1.1.6. Tinh chế xanthon
Để tinh chế các dẫn xuất xanthon từ cao măng cụt, nhiều tác giả đã áp
dụng các phương pháp thông dụng như:
 Sắc ký cột với chất hấp phụ là silicagel 60 (Merck) [44] hoặc Woelm
acid alumina grade III [18]. Sau đó rửa giải bằng các hỗn hợp dung môi
từ ít phân cực đến phân cực hơn để tách các hợp chất.
 Sắc ký lớp mỏng điều chế (preparative chromatography) để phân lập
riêng từng hợp chất [24].
1.1.7. Các phương pháp phân tích các dẫn xuất xanthon
♦ Sắc ký lớp mỏng [19]:
+ Chất hấp phụ là silicagel 60 F
254
(Merck) và với hệ dung môi như:
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

benzen – methanol (95:5); chloroform – hexan (90:10)
chloform – ethylacetat – methanol (80:10:5)
benzen – ethylacetat (75:5) hoặc (17:3)
+ Thuốc thử hiện màu:
- Phun dung dịch FeCl
3
5%.

Tụ cầu khuẩn được chia làm hai nhóm chính: tụ cầu có enzyme
coagulase (Staphylococcus aureus hay còn gọi là tụ cầu vàng,
Staphylococcus intermedius) và tụ cầu không có enzyme coagulase
(Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus,
Staphylococcus heamolyticus, Staphylococcus capitis,… ). Nhờ có enzyme
coagulase mà trên môi trường nuôi cấy có máu, vi khuẩn tạo nên các khuẩn
lạc màu vàng. Do vậy vi khuẩn Staphylococcus aureus được gọi là tụ cầu
vàng. Còn nhóm vi khuẩn không có enzyme coagulase, trên môi trường
nuôi cấy có máu, nhóm vi khuẩn này tạo thành khuẩn lạc màu trắng như sứ
hoặc màu trắng ngà, nên thường gọi nhóm vi khuẩn này là tụ cầu trắng.
Hình 3. Vi khuẩn Staphylococcus aureus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

1.2.2. Đặc tính và các yếu tố độc lực của vi khuẩn Staphylococus aureus
Năm 1926, Daranyi là người đầu tiên phát hiện mối tương quan giữa
sự hiện diện của hoạt động enzyme coagulase của vi khuẩn với khả năng gây
bệnh của nó. Tuy nhiên, đến năm 1948 phát hiện này mới được chấp nhận
rộng rãi. Trên lâm sàng việc phân biệt các chủng tụ cầu có khả năng gây
bệnh và không gây bệnh thường dựa vào sự hiện diện của enzyme
coagulase. Enzyme này gắn với prothrombin trong huyết tương và hoạt hóa
quá trình sinh fibrin từ tiền chất fibrinogen . Enzyme này cùng với yếu tố kết
cụm (clumping factor) của một enzyme vách vi khuẩn, giúp tụ cầu vàng tạo
kết tủa fibrin trên bề mặt của nó. Tính chất này là yếu tố bệnh sinh cực kỳ
quan trọng và yếu tố cũng đóng vai trò quan trọng trong chẩn đoán.
Tụ cầu vàng còn sản xuất nhiều yếu tố độc lực khác có liên quan đến
cấu tạo của vách vi khuẩn.
 Vỏ polysaccharide: một số chủng tụ cầu vàng có thể tạo vỏ

chứng sốc nhiễm độc, một hội chứng sốc trầm trọng.
 Hầu hết các chủng tụ cầu đều sản xuất được enzyme penicillinase
(beta-lactamase). Enzyme này phá hủy vòng beta-lactam, cấu trúc cơ
bản của các kháng sinh như penicilline G, ampicilline và
ureidopenicilline, làm cho các kháng sinh này mất tác dụng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu và dụng cụ chiết xuất xanthon
2.1.1. Nguyên liệu, hoá chất
* Nguyên liệu: vỏ quả măng cụt được cung cấp từ công ty thuốc nam Đà
Lạt, vỏ khô, độ ẩm 10 - 12%.
* Hoá chất: EtOH, EA (CH
3
COOC
2
H
5
), MeOH (CH
3
OH), benzen (C
6
H
6
),
nước cất, thuốc thử anisaldehyd (4-methoxy benzaldehyd), acid sulfuric
(H
2

môi EtOH 95
o

- Chiết cao măng cụt thô với dung môi EtOH 95
o

bằng soxhlet trong 6 giờ,
nhiệt độ 80
o
C.
- Loại tạp chất qua cột silicagel và than hoạt tính.
- Phân lập α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng phương pháp sắc ký
lớp mỏng điều chế.
- Xác định α-mangostin, β-mangostin, γ-mangostin bằng các phương pháp:
UV, IR, MS, HPLC.
2. Chiết mangosteen bằng phương pháp ngâm kiệt, ứng dụng cho sản xuất
quy mô lớn.
2.3. Phƣơng pháp thử hoạt tính kháng vi khuẩn S. aureus của
mangosteen và α-mangostin
Tiến hành theo DĐVN IV, phụ lục 13.9. Xác định hoạt lực thuốc
kháng sinh bằng phương pháp thử vi sinh vật.
- Địa điểm thực hiện: Khoa vi sinh, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương,
Bộ Y tế.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

- Chủng chỉ thị: Staphylococcus aureus ATCC 6538.
- Môi trường định lượng (pH sau khi tiệt khuẩn: 7,9 ± 0,1).
Pepton 6,0g
Casein thuỷ phân từ pancreatin 4,0g
Cao thịt bò 1,5g

- Dùng khoan thạch (đường kính trong 6 mm) đục 6 lỗ trên đĩa thạch petri
sao cho cách đều nhau, dùng kim vô khuẩn lấy cục thạch ra.
- Dung dịch đệm phosphat (pH sau khi tiệt khuẩn: 8,0 ± 0,1)
Dikali hydrophosphat 16,73g
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

Kali đihdrophosphat 0,52g
Nước cất vừa đủ 1000ml
Điều chỉnh pH của dung dịch đệm bằng dung dịch acid phosphoric 2N
hoặc dung dịch Natri hydroxyd 2N nếu cần. Tiệt trùng dung dịch đệm
phosphat ở nhiệt độ 121
o
C trong 15 phút bằng nồi hấp.
- Chuẩn bị mẫu mangosteen: cân 0,1g mangosteen, thêm 0,9ml EtOH 96
o
,
lắc đều đến khi tan hết, thu được dung dịch 1/10. Pha loãng tiếp tục bằng
dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để thu được 3 dung dịch với 3 nồng độ:
+ Nồng độ 1/50 (tương ứng với 2mg mẫu): lấy 0,2ml của dung dịch 1/10
thêm vào 0,8ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0.
+ Nồng độ 1/100 (tương ứng với 1mg mẫu): lấy 0,5ml của dung dịch 1/50
thêm vào 0,5ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0.
+ Nồng độ 1/200 (tương ứng với 0,5mg mẫu): lấy 0,5ml của dung dịch
1/100 thêm vào 0,5ml dung dịch đệm phosphat pH 8,0.
- Tương tự với mẫu α-mangostin, ta tiến hành giống mẫu mangosteen, cân
0,1g mẫu và cũng pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat pH 8,0 để thu
được 3 dung dịch với 3 nồng độ: 1/50, 1/100, 1/200.
- Các dung dịch chứng: pha dung dịch EtOH 20% (tương ứng với nồng độ
EtOH trong dung dịch 1/50), pha dung dịch EtOH 10% (tương ứng với nồng
độ EtOH trong dung dịch 1/100), pha dung dịch EtOH 5% (tương ứng với

- Hoà vào MeOH
- Tách mangosteen bằng sắc ký lớp mỏng điều
chế, chất hấp phụ silicagel 60 F
254
(Merck),
dung môi: benzen-MeOH (tỷ lệ: 95:5), lọc.
α-mangostin, β-mangostin,
γ-mangostin
Phân tích xác định cấu trúc:
UV, IR, MS, HPLC

Bột vỏ quả măng cụt

EtOH 95
o

V
1

β-mangostin
V
2

α-mangostin
V
3

γ -mangostin
- Hoà vào EA
- Chạy qua cột silicagel – than hoạt tính